CN105409771A - 一种佛手参的快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种佛手参的快速繁殖方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，炼苗后转入温室最终存活率高。

Description

一种佛手参的快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及一种佛手参的快速繁殖方法，属于生物领域。

背景技术

兰科手参属植物为多年生草本植物,全世界共10种,我国有5种,包括西南手参、手参、短距手参、峨眉手参和角距手参。佛手参因具有可观的药用价值而被列入多部藏医药经典。

兰科植物的种子极小(每粒种子长1~2mm,直径0.1~0.2mm),由于其胚发育不完全,缺乏供给营养成分的胚乳,因此在自然条件下需要与生境中的真菌共生才能萌发,自然萌发率极低。兰科植物依其生长的环境可分为气生兰和陆生兰,生长于土壤中的陆生兰为了适应其分布地的生态环境,在长期的进化中发展了种皮厚及含有阻碍萌发的物质等特征,其种子比气生兰种子更难以萌发。兰科手参属植物为陆生兰类,佛手参的无性繁殖是由老手参根部仅增生一个小手参,当小手参长大时,老手参枯死,平均繁殖倍数低于2,而种子的自然萌发率也极低。解决佛手参的种苗规模化繁殖是实现其人工栽培、药用开发及种质资源保护的关键。

佛手参属于陆生兰类,其无性及有性繁殖均较为困难,人为的采挖导致了野生资源日益匮乏,迫切需要像天麻、石斛等药用兰科植物一样进行人工栽培,而种苗的规模化生产是实现人工栽培的关键技术。现有技术有人曾尝试利用佛手参的根、芽体和花梗为外植体进行离体培养研究,设计了大量不同植物生长物质组合的培养基,但接种的150个块根、150个花梗和20余个芽体无一例诱导成功,表明佛手参组织培养难度很大。该研究还首次对佛手参种子进行了非共生萌发研究,种子萌发率可达到20%,这已经是很重大的突破，但是萌发率还是非常低，而且将萌发后得到的原球茎进一步进行诱导分化处理，分化率最高仅仅为7%左右，而且后期分化得到的芽无法壮苗成活。

本发明旨在提供一种佛手参的快速繁殖方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，炼苗后转入温室最终存活率高。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明针对背景技术存在的问题，提供一种佛手参的快速繁殖方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，炼苗后转入温室最终存活率高。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种佛手参的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下：

种子萌发：

（1）预处理：

取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在28℃恒温处理3min；

所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；

（2）萌发培养基培养：

预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；

用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m^-2·s^-1的散光条件下培养；

所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。

结果：培养30d后，萌动率达到99.8%，萌发率高达92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。

诱导佛手参原球茎分化：

（3）获得佛手参种子萌芽得到的原球茎；

（4）愈伤组织形成：

将佛手参种子萌芽得到的原球茎移至诱导增殖培养基；

所述诱导增殖培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖15.8g/L、琼脂3.9g/L，海藻糖5g/L，复方中药提取液0.3g/L、椰汁5g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取5份党参，2份天山雪莲，1份青果，1份淫羊藿，1.6份积雪草，0.5份凌霄花，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

（5）待根状茎和愈伤组织长出以后,将根状茎切为长约0.2cm的节段,愈伤组织切成0.2cm×0.2cm小块平铺于新鲜的诱导增殖培养基上;置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度22μmol·m^-2·s^-1的条件下培养，每45d继代一次,继代3次后的增殖倍数为4.1，分化率高达81.2%。

再生植株形成与生长

（6）分化出芽后,很快在芽基部长出多条根,这时转入壮苗培养基：

所述壮苗培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖18.8-20.1g/L、琼脂3.9g/L，胶原蛋白0.2-0.5g/L、海藻糖3-4g/L、椰汁6g/L、6-BA0.2-0.3mg/L、pH6.5；

置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度25μmol·m^-2·s^-1的条件下培养；

壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为78.1-92.3%。

本发明利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，成活率高，而且炼苗后转入温室最终存活率也很高。

本发明的有益之处在于：

本发明利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为78.1-92.3%。

，而且炼苗后转入温室最终存活率也很高。

具体实施方式

实施例1：

一种佛手参的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下：

种子萌发：

（1）预处理：

取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在28℃恒温处理3min；

所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；

（2）萌发培养基培养：

预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；

用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m^-2·s^-1的散光条件下培养；

所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。

结果：培养30d后，萌动率达到99.8%，萌发率高达92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。

诱导佛手参原球茎分化：

（3）获得佛手参种子萌芽得到的原球茎；

（4）愈伤组织形成：

将佛手参种子萌芽得到的原球茎移至诱导增殖培养基；

所述诱导增殖培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖15.8g/L、琼脂3.9g/L，海藻糖5g/L，复方中药提取液0.3g/L、椰汁5g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取5份党参，2份天山雪莲，1份青果，1份淫羊藿，1.6份积雪草，0.5份凌霄花，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

（5）待根状茎和愈伤组织长出以后,将根状茎切为长约0.2cm的节段,愈伤组织切成0.2cm×0.2cm小块平铺于新鲜的诱导增殖培养基上;置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度22μmol·m^-2·s^-1的条件下培养，每45d继代一次,继代3次后的增殖倍数为4.1，分化率高达81.2%。

再生植株形成与生长

（6）分化出芽后,很快在芽基部长出多条根,这时转入壮苗培养基：

所述壮苗培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖18.8g/L、琼脂3.9g/L，胶原蛋白0.5g/L、海藻糖3g/L、椰汁6g/L、6-BA0.3mg/L、pH6.5；

置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度25μmol·m^-2·s^-1的条件下培养；

壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为78.1%。

实施例2：

一种佛手参的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下：

种子萌发：

（1）预处理：

取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在28℃恒温处理3min；

所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；

（2）萌发培养基培养：

预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；

用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m^-2·s^-1的散光条件下培养；

所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。

结果：培养30d后，萌动率达到99.8%，萌发率高达92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。

诱导佛手参原球茎分化：

（3）获得佛手参种子萌芽得到的原球茎；

（4）愈伤组织形成：

将佛手参种子萌芽得到的原球茎移至诱导增殖培养基；

所述诱导增殖培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖15.8g/L、琼脂3.9g/L，海藻糖5g/L，复方中药提取液0.3g/L、椰汁5g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取5份党参，2份天山雪莲，1份青果，1份淫羊藿，1.6份积雪草，0.5份凌霄花，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

（5）待根状茎和愈伤组织长出以后,将根状茎切为长约0.2cm的节段,愈伤组织切成0.2cm×0.2cm小块平铺于新鲜的诱导增殖培养基上;置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度22μmol·m^-2·s^-1的条件下培养，每45d继代一次,继代3次后的增殖倍数为4.1，分化率高达81.2%。

再生植株形成与生长

（6）分化出芽后,很快在芽基部长出多条根,这时转入壮苗培养基：

所述壮苗培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖20.1g/L、琼脂3.9g/L，胶原蛋白0.2g/L、海藻糖4g/L、椰汁6g/L、6-BA0.2mg/L、pH6.5；

置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度25μmol·m^-2·s^-1的条件下培养；

壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为92.3%。

实施例3：

一种佛手参的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下：

种子萌发：

（1）预处理：

取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在28℃恒温处理3min；

所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；

（2）萌发培养基培养：

预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；

用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m^-2·s^-1的散光条件下培养；

所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。

结果：培养30d后，萌动率达到99.8%，萌发率高达92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。

诱导佛手参原球茎分化：

（3）获得佛手参种子萌芽得到的原球茎；

（4）愈伤组织形成：

将佛手参种子萌芽得到的原球茎移至诱导增殖培养基；

所述诱导增殖培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖15.8g/L、琼脂3.9g/L，海藻糖5g/L，复方中药提取液0.3g/L、椰汁5g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取5份党参，2份天山雪莲，1份青果，1份淫羊藿，1.6份积雪草，0.5份凌霄花，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

（5）待根状茎和愈伤组织长出以后,将根状茎切为长约0.2cm的节段,愈伤组织切成0.2cm×0.2cm小块平铺于新鲜的诱导增殖培养基上;置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度22μmol·m^-2·s^-1的条件下培养，每45d继代一次,继代3次后的增殖倍数为4.1，分化率高达81.2%。

再生植株形成与生长

（6）分化出芽后,很快在芽基部长出多条根,这时转入壮苗培养基：

所述壮苗培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖19.4g/L、琼脂3.9g/L，胶原蛋白0.4g/L、海藻糖3g/L、椰汁6g/L、6-BA0.3mg/L、pH6.5；

置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度25μmol·m^-2·s^-1的条件下培养；

壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为85.7%。

可见，本发明是对佛手参育苗的重大突破，其可分化得到大量健康的小苗，存活率为78.1-92.3%。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种佛手参的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下：

种子萌发：

（1）预处理：

取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在28℃恒温处理3min；

所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；

（2）萌发培养基培养：

预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；

用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m^-2·s^-1的散光条件下培养；

所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

诱导佛手参原球茎分化：

（3）获得佛手参种子萌芽得到的原球茎；

（4）愈伤组织形成：

将佛手参种子萌芽得到的原球茎移至诱导增殖培养基；

所述诱导增殖培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖15.8g/L、琼脂3.9g/L，海藻糖5g/L，复方中药提取液0.3g/L、椰汁5g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；

所述复方中药提取液的制备方法为：

如下所述均为质量份；

取5份党参，2份天山雪莲，1份青果，1份淫羊藿，1.6份积雪草，0.5份凌霄花，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；

（5）待根状茎和愈伤组织长出以后,将根状茎切为长约0.2cm的节段,愈伤组织切成0.2cm×0.2cm小块平铺于新鲜的诱导增殖培养基上;置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度22μmol·m^-2·s^-1的条件下培养，每45d继代一次,继代3次后的增殖倍数为4.1，分化率高达81.2%；

再生植株形成与生长

（6）分化出芽后,很快在芽基部长出多条根,这时转入壮苗培养基：

所述壮苗培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖18.8-20.1g/L、琼脂3.9g/L，胶原蛋白0.2-0.5g/L、海藻糖3-4g/L、椰汁6g/L、6-BA0.2-0.3mg/L、pH6.5；

置于温度26℃,光照周期12h·d-1,光照强度25μmol·m^-2·s^-1的条件下培养。

2.权利要求1所述的提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其特征在于：

壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为78.1-92.3%。