CN105265320B - 一种绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法，包括如下步骤：(1)外植体的取材与消毒；(2)无菌试管苗的获取；(3)试管苗增殖培养；(4)试管苗壮苗培养；(5)试管苗生根培养；(6)试管苗炼苗移栽。该法以带芽茎段和茎尖作为外植体，通过组织培养繁殖，能够缩短培养周期并快速繁殖出绵毛马兜铃优质种苗。培养30d芽繁殖系数可达6.0倍，经过扩繁、壮苗和生根培养，组培苗生根率达90.7％以上，移栽基质后成活率在87.5％以上，有效解决了绵毛马兜铃的规模化育苗问题。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养繁殖技术领域，具体是一种绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法。
背景技术
绵毛马兜铃(Aristolochia mollissima Hance)，中药名寻骨风，作为传统的中药材，旧时在民间草药书籍中便具有使用记载，根、茎、根茎及叶可入药，可治疗风湿关节痛，疗效显著，并对使用份量、食用方法进行了记述，如《饮片新参》，而到了现代，中医上还将绵毛马兜铃录入《中华本草》、《全国中草药汇编》等。近年来，国内关于绵毛马兜铃的研究多见于药理作用的分析，对化学成分的研究比较多，如绵毛马兜铃油的抗炎作用，并在药理成分的基础上研究了成分对药物配伍的影响。在实际应用上，打破传统的使用方法，观察多例关节炎的临床表现，并制成多种合适病状的剂型使用，相比传统的煎服或外用疗效更好。国外主要对于绵毛马兜铃的有效药用成分进行分析、提取，以及化学结构的测定，进行绵毛马兜铃提取物对抗癌活性的研究。由于绵毛马兜铃具有多种药用价值，市场售价逐渐走高。近年来由于过度采挖，使野生绵毛马兜铃资源面临威胁。为保护该种植物的野生资源，加强对绵毛马兜铃的开发利用，需大力推广绵毛马兜铃的栽培种植，要实现其人工栽培，首要解决的问题就是种苗的繁育，而运用组织培养技术，可以加速其繁殖速度获得大量试管苗，满足种苗市场的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法，针对目前绵毛马兜铃繁育存在的问题，通过组织培养繁殖，能够缩短培养周期并快速繁殖出绵毛马兜铃优质种苗，进行规模化生产种苗，满足市场需求。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：取绵毛马兜铃剪切成2-3cm的带芽茎段或l-2cm长的茎尖，作为外植体进行消毒，首先将2-3滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，把外植体放入烧杯轻轻搅拌2min，再用棉花清洗外植体表面污垢，自来水轻微流水冲洗8-10min；移置超净工作台，用75v/v％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后再用添加了1-2滴吐温-20的50ml浓度为0.1v/v％升汞消毒6-8min、无菌水冲洗3-5次，最后放置消毒好的不锈钢碟子，剪切成1.0-1.5cm长的带芽茎段，获得无菌外植体；
(2)无菌试管苗的获取：将消毒好的外植体置于诱导培养基中进行不定芽诱导发芽得到无菌试管苗，所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，30g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为15-20d；
(3)试管苗增殖培养：将无菌试管苗置于增殖培养基中进行培养获得大量不定芽，所述增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.1-1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.01-0.5mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为30d；
(4)试管苗壮苗培养：将繁殖后的不定芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株，所述壮苗培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.1-1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.01-0.5mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为30d；
(5)试管苗生根培养：将健壮植株置于生根培养基中培养得到完整的带根苗，所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.5-1.5mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为25d；
(6)试管苗炼苗移栽：筛选完整的带根苗进行炼苗后移植于基质中培养，再移栽至大田；
步骤(6)中的炼苗移栽按以下操作进行：经过步骤(5)获得带根的完整植株，待苗长至5-6cm,根长至2-4cm时，选择生长良好、整齐、健壮的瓶苗，在室温为23-25℃的室内进行炼苗，并在瓶中加水淹没培养基，炼苗5-7d，取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到基质中生长40-50d，再移栽至大田。
所述基质为按珍珠岩：蛭石：泥沙＝1：2；1的比例混合。
本发明的突出优点在于：
<1>通过绵毛马兜铃不定芽的诱导和繁殖，能保持原始品种的性状，能够在短期内繁殖得到大量性状一致的植株，满足生产需要，并为提供优良性状的绵毛马兜铃工厂化育苗提供参考。
<2>所用MS和1/2MS固体培养基包含大量和微量元素，添加的6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸等化学药剂，成本较低廉、浓度适宜，具体作用如下：在诱导培养基中添加6-BA和NAA，能够诱导不定芽萌发；在增殖培养基中添加6-BA、NAA和IAA能够促进芽的增殖；在壮苗培养基中添加6-BA和NAA能够促进苗壮和芽的再次增殖；在1/2MS生根培养基中添加IBA和NAA可促进苗生根，经炼苗后移栽至装基质的营养杯。
<3>培养30d芽繁殖系数可达5.5倍，经过扩繁、壮苗和生根培养，组培苗生根率达90.7％以上，移栽基质后成活率在87.5％以上，有效解决了绵毛马兜铃的规模化育苗问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
本发明所述的绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法的一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：取绵毛马兜铃剪切成2-3cm的带芽茎段及1-2cm的茎尖作为外植体进行消毒；首先将2-3滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，把外植体放入烧杯轻轻搅拌2min，再用棉花清洗外植体表面污垢，自来水轻微流水冲洗8-10min；移置超净工作台，用75v/v％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后再用添加了1-2滴吐温-20的50ml浓度为0.1v/v％升汞消毒6-8min、无菌水冲洗3-5次，最后放置消毒好的不锈钢碟子，剪切成1.0-1.5cm长的带芽茎段，获得无菌外植体。所述无菌水为经高温高压灭菌后的蒸馏水。
(2)无菌试管苗的获取：将消毒好的外植体置于诱导培养基中进行不定芽诱导发芽(温度为23-25℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d)15-20d，得到无菌试管苗；
(3)试管苗增殖培养：将无菌试管苗置于增殖培养基中进行培养(温度为23-25℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d)30d，获得大量不定芽，不定芽增殖系数为5.3；
(4)试管苗壮苗培养：将繁殖后的不定芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养(温度为23-25℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d)30d，得到健壮植株，不定芽二次增殖系数为3.4；
(5)试管苗生根培养：将健壮植株置于MS生根培养基中培养25d(温度为23-25℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d)，得到完整的带根苗，生根率为90.7％；
(6)试管苗炼苗移栽：经过步骤(5)获得带根的完整植株，待苗长至5-6cm,根长至2-4cm时，选择生长良好、整齐、健壮的瓶苗，在室温为23-25℃的室内进行炼苗，并在瓶中加入少量自来水淹没培养基，炼苗5-7d，用镊子取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到基质中生长40-50d，再移栽至大田，成活率为92％。所述基质为按珍珠岩：蛭石：泥沙＝1：2；1的比例混合,并且基质疏松透气、排水良好。
其中，各阶段使用的培养基配方如下：
所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，30g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤，培养基pH值为5.8；
所述增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.02mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8；
所述壮苗培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.2mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.05mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8；
所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.8mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8。
实施例2
本发明所述的绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法的另一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，增殖培养基以MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，培养基pH值为5.8，并添加0.2mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.01mg·L-1的萘乙酸；不定芽增殖系数为6.0；
步骤(4)中，壮苗培养基以MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，培养基pH值为5.8，并添加0.1mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.05mg·L-1的萘乙酸；不定芽二次增殖系数为2.8；
步骤(5)中，生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1g·L-1活性炭，培养基pH值为5.8，并添加1.0mg·L-1的萘乙酸(NAA)，生根率为94.3％。
步骤(6)中，成活率为90％。
实施例3
本发明所述的绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法的再一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，增殖培养基以MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，培养基pH值为5.8，并添加1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.02mg·L-1的萘乙酸；不定芽增殖系数为5.5；
步骤(4)中，壮苗培养基以MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，培养基pH值为5.8，并添加0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.1mg·L-1的萘乙酸；不定芽二次增殖系数为2.8；
步骤(5)中，生根培养基以1/2MS为基本培养基，附加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1g·L-1活性炭，培养基pH值为5.8，并添加0.5mg·L-1的萘乙酸(NAA)，生根率为89.5％。
步骤(6)中，成活率为88.3％。
实施例4
本发明所述的绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法的又一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.8mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.04mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，不定芽增殖系数为5.2；
步骤(4)中，壮苗培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.1mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，；不定芽二次增殖系数为2.3；
步骤(5)中，生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，1g·L-1活性炭，1.2mg·L-1的萘乙酸(NAA)，培养基pH值为5.8，生根率为94.8％。
步骤(6)中，成活率为91.7％。
Claims (3)
1.一种绵毛马兜铃Aristolochia mollissima Hance的组织培养繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：取绵毛马兜铃剪切成2-3cm的带芽茎段或l-2cm长的茎尖，作为外植体进行消毒，首先将2-3滴洗洁精滴入装50ml自来水的烧杯中，把外植体放入烧杯轻轻搅拌2min，再用棉花清洗外植体表面污垢，自来水轻微流水冲洗8-10min；移置超净工作台，用75％v/v乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后再用添加了1-2滴吐温-20的50ml浓度为0.1％v/v升汞消毒6-8min、无菌水冲洗3-5次，最后放置在消毒好的不锈钢碟子，剪切成1.0-1.5cm长的带芽茎段，获得无菌外植体；
(2)无菌试管苗的获取：将消毒好的外植体置于诱导培养基中进行不定芽诱导发芽得到无菌试管苗，所述诱导培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，30g·L-1蔗糖，0.5mg·L-1的6-苄基腺嘌呤，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为15-20d；
(3)试管苗增殖培养：将无菌试管苗置于增殖培养基中进行培养获得大量不定芽，所述增殖培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.1-1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.01-0.5mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为30d；
(4)试管苗壮苗培养：将繁殖后的不定芽置于壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株，所述壮苗培养基以MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.1-1.0mg·L-1的6-苄基腺嘌呤、0.01-0.5mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为30d；
(5)试管苗生根培养：将健壮植株置于生根培养基中培养得到完整的带根苗，所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加5g·L-1琼脂，20g·L-1蔗糖，0.5-1.5mg·L-1的萘乙酸，培养基pH值为5.8，培养条件为：温度为22-24℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为25d；
(6)试管苗炼苗移栽：筛选完整的带根苗进行炼苗后移植于基质中培养，再移栽至大田。
2.根据权利要求1所述的绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤(6)中的炼苗移栽按以下操作进行：经过步骤(5)获得带根的完整植株，待苗长至5-6cm,根长至2-4cm时，选择生长良好、整齐、健壮的瓶苗，在室温为23-25℃的室内进行炼苗，并在瓶中加水淹没培养基，炼苗5-7d，取出试管苗，洗净根部培养基，移栽到基质中生长40-50d，再移栽至大田。
3.根据权利要求1所述的绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法，其特征在于：所述基质为按珍珠岩：蛭石：泥沙＝1：2；1的比例混合。
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