CN108308037A - 一种新塔花组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

一种新塔花组织培养快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新塔花组织培养快速繁殖方法。该方法通过无菌苗的获得、茎段初代培养、芽的增殖培养、芽的生根培养、炼苗及移栽等步骤实现新塔花的离体再生。本发明不仅可以不受季节限制加快成苗周期，进行大规模工厂化育苗；同时，能够排除病菌及虫害对植物的侵扰，以达到对新塔花的有效利用。

Description

一种新塔花组织培养快速繁殖方法
技术领域
本发明属于药用植物繁育技术领域，具体涉及一种新塔花组织培养快速繁殖方法。
背景技术
新塔花属(Ziziphora Linn.)植物大约有25～30种，分布于地中海至亚洲中部阿富汗、俄罗斯、蒙古等区域；我国有4种新塔花，均产于新疆。新塔花(Ziziphora bungeanaJuz.)为唇形科(Labiatae)新塔花属植物，又名唇香草、山薄荷、小叶薄荷，为多年生芳香半灌木植物。在国外，哈萨克斯坦、蒙古和俄罗斯有分布；而在我国仅分布于新疆，是新疆特有的药用植物。其主要分布在天山、阿尔泰山、准噶尔西部山地、帕米尔高原以及昆仑山的砾石坡地、半荒漠草地以及沙滩上，海拔约为700～1100m。新塔花在民间被用作传统维吾尔药材，其地上部分均可入药，具有很好的药用价值和应用价值；其性味为辛、凉，具有强心利湿、理气化痰、消炎散结、疏散风热、清利头目、宁心安神、利水清热、壮骨强身的功效。其被广泛用于治疗感冒发热，目赤肿痛，头痛咽痛，心悸失眠等症；有报道称其在临床上被用于治疗高血压、冠心病及心脑血管等疾病，起到保护与治疗心肌缺血引起心肌细胞与其它细胞损伤的作用；还可被用于治疗心脏病，气短多汗，水肿，气管炎，肺脓肿等疾病。
在此之前，新塔花主要采用播种的方法进行繁育，其发芽率较低，远不能满足实际生产的需要，本发明以新塔花无菌苗茎段为材料，通过组织诱导、增殖、分化、生根、炼苗移栽等过程获得新塔花离体再植株，建立新塔花组织培养快速繁殖技术方法，为新塔花工厂化，规模化、产业化提供技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新塔花组织培养快速繁殖方法，本发明以新塔花无菌苗茎段为材料，通过无菌苗的获得、茎段初代培养、芽的增殖培养、芽的生根培养、炼苗及移栽等步骤实现新塔花的离体再生。
一种新塔花组织培养快速繁殖方法，按如下所述步骤进行：
(1)种子的消毒：将新塔花种子用纱布包好，在无菌操作台中采用酒精溶液浸泡消毒处理，然后无菌水冲洗，移入NaClO溶液中振荡消毒，再次于无菌水中冲洗，沥干后置于铺有无菌滤纸的培养皿上备用；
(2)无菌苗的获得：将灭菌后的新塔花种子接种于萌发培养基中，连续培养；
(3)茎段初代培养：在无菌操作台中，将获得的无菌苗的茎切成段，接种于初代培养基中，连续培养；
(4)芽的增殖培养：将茎段初代培养得到的芽切成单芽后接种插入增值培养基中，继续培养2-4天；
(5)芽的生根培养：将增殖培养后的芽接种于含有NAA生根培养基中，培养15-20天后；
(6)炼苗移栽：将步骤(5)获得的生长良好且健壮的生根苗置于自然光照下炼苗5-8天后，将幼苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度，待幼苗成活后再移栽。
步骤(1)所述酒精溶液的体积浓度为75％，浸泡40s；NaClO溶液的质量浓度为2％，振荡消毒4min。
步骤(2)接种后，再每天光照时间为16h，温度为25-27℃，光照强度为8000Lx的条件下，连续培养40天。
所述的萌发培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。
步骤(3)所述切成的段长1cm；所述接种后，在每天光照时间为16h，温度为25-27℃，光照强度为8000Lx的条件下，连续培养30天。
所述的初代培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖，0.7％的琼脂，6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.5-1.0mg/L，培养基pH为5.8-6.0。
所述单芽包括顶芽和茎段；所述增值培养基包括顶芽增值培养基和茎段增值培养基；所述顶芽增值培养基为：MS培养基中含0.7％的琼脂，30g/L蔗糖，0.5mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA(萘乙酸)，0.3mg/L GA3(赤霉素)，pH为5.8-6.0；所述茎段增值培养基为：MS培养基中含0.7％的琼脂，35g/L蔗糖，1.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，0.3mg/L GA3，pH为5.8-6.0；所述步骤(4)接种后，在每天光照时间为16h，温度为25-27℃，光照强度为8000Lx条件下，培养2-4天。
所述生根培养基为：1/2MS培养基中含0.5mg/L NAA，培养基pH为5.8-6.0；所述步骤(5)接种后，在每天光照时间为16h，温度为25-27℃，光照强度为8000Lx的条件下，培养15-20天。
所述基质为营养土：珍珠岩以质量比4:1混合成的混合培养土。
所述的MS基本培养基包括：
大量元素：NH4NO3 1650mg/L、KNO3 1900mg/L、KH2PO4 170mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、CaCl2·2H2O 440mg/L；
微量元素：FeSO4·7H2O 27.8mg/L、Na2·EDTA·2H2O 37.3mg/L、KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2mg/L、MnSO4·H2O2 2.3mg/L、ZnSO4·7H2O 8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L、CoCl2·6H2O 0.025mg/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L；
有机物质：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.4mg/L、甘氨酸2.0mg/L；30g/L蔗糖、7g/L卡拉胶，ph值5.8-6.0。
本发明的有益效果：本发明通过植物组织培养技术短时间内快速获得大量新塔花优良品种苗木的方法。以新塔花无菌苗茎段为材料，通过无菌苗的获得、茎段初代培养、芽的增殖培养、芽的生根培养、炼苗及移栽等步骤实现新塔花的离体再生。为其大量选育、快速繁殖、新品种推广提供技术支持。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
(1)种子的消毒：将采集的新塔花种子用纱布包好，在无菌操作台中先用75％的酒精浸泡消毒处理40s，取出后用无菌水冲洗3次，移入2％的NaClO溶液中振荡消毒4min，将种子再次取出置于无菌水中重复振荡冲洗5次，而后沥干置于铺有无菌滤纸的培养皿上备用。
(2)无菌苗的获得：在无菌操作台中，将灭菌后的新塔花种子接种于含有MS培养基的三角瓶中，每瓶30粒种子。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx的条件下，连续培养40天后，统计萌发率。所述的萌发培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。
(3)茎段初代培养：在无菌操作台中，将获得的无菌苗的茎段切成1cm长，分别接种于含有6-BA的MS培养基中。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，连续培养30d天后观察茎段腋芽萌动情况。所述的初代培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0，适宜茎段侧芽萌动的激素浓度为0.5-1.0mg/L6-BA。
(4)芽的增殖培养：将茎段初代培养得到的芽切成单芽(顶芽)后接种插入含有不同激素配比的MS继代培养基上。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，培养3天后统计增值情况。所述的增值培养基为：MS培养基中含0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。适宜顶芽增殖的激素浓度为0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.3mg/L GA3+30g/L蔗糖。
(5)芽的生根培养：将增殖培养后的芽接种于含有((NAA与IAA)的1/2MS培养基上，接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，培养15-20天后，统计生根情况。所述的生根培养基为：1/2MS培养基(MS培养基配方中的大量元素减半)，培养基pH为5.8-6.0。适宜芽生根的激素浓度为：0.5mg/L NAA；0.5mg/L IAA；但NAA比IAA更适宜于芽的生根培养。
(6)炼苗移栽：将步骤(5)获得的生长良好且健壮的生根苗置于自然光照下炼苗5～8天后，将幼苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝4:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度，待幼苗成活后再移栽。
实施例2
(1)种子的消毒：将采集的新塔花种子用纱布包好，在无菌操作台中先用75％的酒精浸泡消毒处理40s，取出后用无菌水冲洗3次，移入2％的NaClO溶液中振荡消毒4min，将种子再次取出置于无菌水中重复振荡冲洗5次，而后沥干置于铺有无菌滤纸的培养皿上备用。
(2)无菌苗的获得：在无菌操作台中，将灭菌后的新塔花种子接种于含有MS培养基的三角瓶中，每瓶30粒种子。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx的条件下，连续培养40天后，统计萌发率。所述的萌发培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。
(3)茎段初代培养：在无菌操作台中，将获得的无菌苗的茎段切成1cm长，分别接种于含有6-BA的MS培养基中。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，连续培养30d天后观察茎段腋芽萌动情况。所述的初代培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0，适宜茎段侧芽萌动的激素浓度为0.5-1.0mg/L6-BA。
(4)芽的增殖培养：将茎段初代培养得到的芽切成单芽(茎段)后接种插入含有不同激素配比的MS继代培养基上。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，培养3天后统计增值情况。所述的增值培养基为：MS培养基中含0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。适宜茎段增殖的激素浓度为1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.3mg/L GA3+35g/L蔗糖。
(5)芽的生根培养：将增殖培养后的芽接种于含有NAA的1/2MS培养基上，接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，培养15-20天后，统计生根情况。所述的生根培养基为：1/2MS培养基(MS培养基配方中的大量元素减半)，培养基pH为5.8-6.0。最适宜芽生根的激素浓度为0.5mg/L NAA。
(6)炼苗移栽：将步骤(5)获得的生长良好且健壮的生根苗置于自然光照下炼苗5～8天后，将幼苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝4:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度，待幼苗成活后再移栽。
实施例3
(1)种子的消毒：将采集的新塔花种子用纱布包好，在无菌操作台中先用75％的酒精浸泡消毒处理40s，取出后用无菌水冲洗3次，移入2％的NaClO溶液中振荡消毒4min，将种子再次取出置于无菌水中重复振荡冲洗5次，而后沥干置于铺有无菌滤纸的培养皿上备用。
(2)无菌苗的获得：在无菌操作台中，将灭菌后的新塔花种子接种于含有MS培养基的三角瓶中，每瓶30粒种子。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx的条件下，连续培养40天后，统计萌发率。所述的萌发培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。
(3)茎段初代培养：在无菌操作台中，将获得的无菌苗的茎段切成1cm长，分别接种于含有6-BA的MS培养基中。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，连续培养30d天后观察茎段腋芽萌动情况。所述的初代培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0，适宜茎段侧芽萌动的激素浓度为0.5-1.0mg/L6-BA。
(4)芽的增殖培养：将茎段初代培养得到的芽切成单芽(顶芽)后接种插入含有不同激素配比的MS继代培养基上。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，培养3天后统计增值情况。所述的增值培养基为：MS培养基中含0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。适宜顶芽增殖的激素浓度为0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.3mg/L GA3+30g/L蔗糖。
(5)芽的生根培养：将增殖培养后的芽接种于含有((NAA与IAA)的1/2MS培养基上，接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，培养15-20天后，统计生根情况。所述的生根培养基为：1/2MS培养基(MS培养基配方中的大量元素减半)，培养基pH为5.8-6.0。适宜芽生根的激素浓度为：0.5mg/L NAA；0.5mg/L IAA；0.5mg/L L-肌肽。
(6)炼苗移栽：将步骤(5)获得的生长良好且健壮的生根苗置于自然光照下炼苗5～8天后，将幼苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝4:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度，待幼苗成活后再移栽。
实施例4
(1)种子的消毒：将采集的新塔花种子用纱布包好，在无菌操作台中先用75％的酒精浸泡消毒处理40s，取出后用无菌水冲洗3次，移入2％的NaClO溶液中振荡消毒4min，将种子再次取出置于无菌水中重复振荡冲洗5次，而后沥干置于铺有无菌滤纸的培养皿上备用。
(2)无菌苗的获得：在无菌操作台中，将灭菌后的新塔花种子接种于含有MS培养基的三角瓶中，每瓶30粒种子。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx的条件下，连续培养40天后，统计萌发率。所述的萌发培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。
(3)茎段初代培养：在无菌操作台中，将获得的无菌苗的茎段切成1cm长，分别接种于含有6-BA的MS培养基中。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，连续培养30d天后观察茎段腋芽萌动情况。所述的初代培养基为：MS培养基中含3％的蔗糖和0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0，适宜茎段侧芽萌动的激素浓度为0.5-1.0mg/L6-BA。
(4)芽的增殖培养：将茎段初代培养得到的芽切成单芽(茎段)后接种插入含有不同激素配比的MS继代培养基上。接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，培养3天后统计增值情况。所述的增值培养基为：MS培养基中含0.7％的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。适宜茎段增殖的激素浓度为1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.3mg/L GA3+35g/L蔗糖。
(5)芽的生根培养：将增殖培养后的芽接种于含有NAA的1/2MS培养基上，接种后，每天光照时间为16h，温度为(26±1)℃，光照强度为8000Lx，培养15-20天后，统计生根情况。所述的生根培养基为：1/2MS培养基(MS培养基配方中的大量元素减半)，培养基pH为5.8-6.0。最适宜芽生根的激素浓度为0.5mg/L NAA；0.5mg/L波叶苦木提取物。
所述波叶苦木提取物的提取方法为：取波叶苦木叶片，晒干，磨成粉末，加3-5倍重量份数的水回流提取3次，合并滤液，蒸干制成。
(6)炼苗移栽：将步骤(5)获得的生长良好且健壮的生根苗置于自然光照下炼苗5～8天后，将幼苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝4:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度，待幼苗成活后再移栽。
统计实施例1-4的苗移栽成活率，从第(5)步生根存活的幼苗算起，到第(6)部移栽20天后仍然保持成活为止，成活率计算公式：
(生根幼苗数-移栽20天成活苗数)/生根幼苗数X100％
统计结果见表1所示：
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
成活率％ 75％ 74％ 95％ 96％

Claims (9)

1.一种新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，按如下所述步骤进行：
（1）种子的消毒：将新塔花种子用纱布包好，在无菌操作台中采用酒精溶液浸泡消毒处理，然后无菌水冲洗，移入NaClO溶液中振荡消毒，再次于无菌水中冲洗，沥干后置于铺有无菌滤纸的培养皿上备用；
（2）无菌苗的获得：将灭菌后的新塔花种子接种于萌发培养基中，连续培养；
（3）茎段初代培养：在无菌操作台中，将获得的无菌苗的茎切成段，接种于初代培养基中，连续培养；
（4）芽的增殖培养：将茎段初代培养得到的芽切成单芽后接种插入增值培养基中，继续培养2-4天；
（5）芽的生根培养：将增殖培养后的芽接种于含有NAA生根培养基中，培养15-20天后；
（6）炼苗移栽：将步骤(5)获得的生长良好且健壮的生根苗置于自然光照下炼苗5-8天后，将幼苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度，待幼苗成活后再移栽。
2.根据权利要求1所述新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤（1）所述酒精溶液的体积浓度为75%，浸泡40s；NaClO溶液的质量浓度为2%，振荡消毒4min。
3.根据权利要求1所述新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤（2）接种后，再每天光照时间为16h，温度为25-27℃，光照强度为8000Lx的条件下，连续培养40天。
4.根据权利要求1所述新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的萌发培养基为：MS培养基中含3%的蔗糖和0.7%的琼脂，培养基pH为5.8-6.0。
5.根据权利要求1所述新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤（3）所述切成的段长1cm；所述接种后，在每天光照时间为16h，温度为25-27℃，光照强度为8000Lx的条件下，连续培养30天。
6.根据权利要求1所述新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的初代培养基为：MS培养基中含3%的蔗糖，0.7%的琼脂，6-BA 0.5-1.0 mg/ L，培养基pH为5.8-6.0。
7.根据权利要求1所述新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述单芽包括顶芽和茎段；所述增值培养基包括顶芽增值培养基和茎段增值培养基；所述顶芽增值培养基为：MS培养基中含0.7%的琼脂，30 g/ L蔗糖，0.5 mg/ L 6-BA ， 0.2 mg/ L NAA ，0.3 mg/ LGA3， pH为5.8-6.0；所述茎段增值培养基为：MS培养基中含0.7%的琼脂，35 g/ L蔗糖，1.0mg/ L 6-BA ， 0.1 mg/ L NAA ，0.3 mg/ L GA3，pH为5.8-6.0；所述步骤（4）接种后，在每天光照时间为16h，温度为25-27℃，光照强度为8000Lx条件下，培养2-4天。
8.根据权利要求1所述新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述生根培养基为：1/2MS培养基中含0.5 mg/ L NAA，培养基pH为5.8-6.0；所述步骤（5）接种后，在每天光照时间为16h，温度为25-27℃，光照强度为8000Lx的条件下，培养15-20天。
9.根据权利要求1所述新塔花组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述基质为营养土：珍珠岩以质量比4:1混合成的混合培养土。
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