CN111387057B - 一种手掌参无菌播种培养基 - Google Patents

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    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Abstract

本发明公开了一种手掌参无菌播种培养基，该播种培养基以MS为基本培养基，在每升培养基中含有：玉米素0.1～0.3mg、激动素0.4～0.8mg、萘乙酸0.1～0.5mg、赤霉素0.2～0.5mg、酪蛋白0.2～0.6g、活性炭0.5～2.0g、氯霉素0.02～0.05mg、琼脂8～12g、蔗糖5～10g和手掌参内生菌液3～5mL，pH值为4.7～5.5。本发明提供的无菌播种培养基能有效提高手掌参种子的萌发率，为手掌参的栽培提供了一条新的途径。

Description

一种手掌参无菌播种培养基
技术领域
本发明涉及植物繁育技术领域，具体是涉及一种手掌参无菌播种培养基。
背景技术
手掌参(Gymnadenia R.Br)又名佛手参、掌参。手掌参是重要中药材，也是及其珍贵的滋补食品，其根部入药,具有补益气血、生津止渴的功效,主治肺虚咳喘、虚劳消瘦和神经衰弱等。现代药理学研究发现,手掌参是防治老年痴呆症的潜在药物。
由于手掌参生态条件独特,自然繁殖率低,加上近年来人为的过度开采，造成了手掌参资源的急剧减少，现己被《濒危野生动植物种类国际贸易公约》(cITEs)列为1级珍稀植物，规模化人工栽培是解决手掌参药用资源紧缺问题的有效途径。人工栽培的最大问题是手掌参种苗问题，手掌参繁殖分为有性繁殖和无性繁殖两种。手掌参无性繁殖时，老的手掌参根部仅增生一个新的小手掌参，老手掌参中贮藏的营养成分向地上部分或新手掌参转移，新手掌参逐渐长大,老手掌则参逐渐退化。通过无性繁殖，当年的一株手掌参到明年依然还是一株，显然无性繁殖方式并不能增加手掌参资源数量，只能起到延续种群的功能。有性繁殖是增加手掌参野生植株数量的唯一途径。手掌参种子数量虽然庞大，但萌发率极低，手掌参同其他兰科植物一样，种子极小，缺乏供给营养的胚乳。同时由于手掌参种子极小，形成的实生苗细弱，生长状况差，幼苗存活率很低。大量文献表明，兰科植物在整个生活史的不同阶段和真菌有着复杂的共生关系，共生菌在兰科植物完成整个生活史中起着关键的作用(Dearnaley et al.2012；McCormick&Jacquemyn,2014)。这种共生关系在兰科植物的的种子萌发和幼苗阶段尤其重要。
鉴于手掌参濒危最主要的内在因素是其繁殖能力和繁殖效率低。因此急需提供不受播种季节限制、受环境及气候影响较小、能提高种子萌发率、缩短出苗时间及成苗周期的组培方法来获得大量幼苗，以解决目前手掌参种苗繁殖能力及繁殖效率低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能促进种子萌发的手掌参无菌播种培养基，以解决现有技术存在的问题。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案是：
一种手掌参无菌播种培养基，以MS为基本培养基，在每升培养基中含有：玉米素0.1～0.3mg、激动素0.4～0.8mg、萘乙酸0.1～0.5mg、赤霉素0.2～0.5mg、酪蛋白0.2～0.6g、活性炭0.5～2.0g、氯霉素0.02～0.05mg、琼脂8～12g、蔗糖5～10g和手掌参内生菌液3～5mL，pH值为4.7～5.5；
所述手掌参内生菌液由如下方法制得：
(1)将新鲜的手掌参根茎洗净、消毒、无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干水分，然后用无菌刀片将根茎切成小段后接种于菌液培养基PDA+氯霉素0.02mg/L+土壤浸出液200mL/L+手掌参根茎汁液2mL/L中，在温度18～25℃、无光照条件下培养2～3天；
(2)待手掌参根茎周围菌丝生长旺盛时挑取一个单菌落转接到10mL菌液培养基中进行纯化培养2～3d；
所述土壤浸出液是将2～4g手掌参根茎周围的土壤溶解在100mL蒸馏水中，摇床震荡20min后取上清液制得；
所述手掌参根茎汁液是将手掌参根茎用碾钵碾磨出汁液后过滤制得。
进一步地，手掌参内生菌液制备步骤(2)中手掌参根茎用0.1％的升汞消毒4～8min。
本发明针对手掌参种苗需求量大，现有种苗繁殖力低的问题，提供了一种掌参无菌播种培养基，该播种培养基中含有的手掌参内生菌液和酪蛋白能为种子萌发提供营养物质，含有的氯霉素有助于内生菌生长并抑制杂菌生长。本发明能有效提高手掌参种子的萌发率，为手掌参的栽培提供了一条新的途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本实施例提供的手掌参无菌播种培养基，以MS为基本培养基，在每升培养基中含有：玉米素0.2mg、激动素(KT)0.6mg、萘乙酸0.3mg、赤霉素0.35mg、酪蛋白0.4g、活性炭1.25g、氯霉素0.03mg、琼脂10g、蔗糖7.5g和手掌参内生菌液4mL，pH值为5.1；
所述手掌参内生菌液由如下方法制得：
(1)将新鲜的手掌参根茎冲洗干净后，放入0.1％的升汞消毒6min，无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干水分，然后用无菌刀片将根茎切成小段后接种于菌液培养基PDA+氯霉素0.02mg/L+土壤浸出液200mL/L+手掌参根茎汁液2mL/L+琼脂13g/L中，在温度22℃、无光照条件下培养2天；
(2)待手掌参根茎周围菌丝生长旺盛时挑取一个单菌落转接到10mL菌液培养基PDA+氯霉素0.02mg/L+土壤浸出液200mL/L+手掌参根茎汁液2mL/L中进行纯化培养2d；
所述土壤浸出液是将3g手掌参根茎周围的土壤溶解在100mL蒸馏水中，摇床震荡20min后取上清液制得；
所述手掌参根茎汁液是将手掌参根茎用碾钵碾磨出汁液后过滤制得。
实施例2
本实施例提供的手掌参无菌播种培养基，以MS为基本培养基，在每升培养基中含有：玉米素0.1mg、KT0.4mg、萘乙酸0.1mg、赤霉素0.2mg、酪蛋白0.2g、活性炭0.5g、氯霉素0.02mg、琼脂8g、蔗糖5g和手掌参内生菌液3mL，pH值为4.7；
所述手掌参内生菌液由如下方法制得：
(1)将新鲜的手掌参根茎冲洗干净后，放入0.1％的升汞消毒4min，无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干水分，然后用无菌刀片将根茎切成小段后接种于菌液培养基PDA+氯霉素0.02mg/L+土壤浸出液200mL/L+手掌参根茎汁液2mL/L+琼脂13g/L中，在温度18℃、无光照条件下培养2天；
(2)待手掌参根茎周围菌丝生长旺盛时挑取一个单菌落转接到10mL菌液培养基PDA+氯霉素0.02mg/L+土壤浸出液200mL/L+手掌参根茎汁液2mL/L中进行纯化培养2d；
所述土壤浸出液是将2g手掌参根茎周围的土壤溶解在100mL蒸馏水中，摇床震荡20min后取上清液制得；
所述手掌参根茎汁液是将手掌参根茎用碾钵碾磨出汁液后过滤制得。
实施例3
本实施例提供的手掌参无菌播种培养基，以MS为基本培养基，在每升培养基中含有：玉米素0.3mg、KT0.8mg、萘乙酸0.5mg、赤霉素0.5mg、酪蛋白0.6g、活性炭2g、氯霉素0.05mg、琼脂12g、蔗糖10g和手掌参内生菌液5mL，pH值为5.5；
所述手掌参内生菌液由如下方法制得：
(1)将新鲜的手掌参根茎冲洗干净后，放入0.1％的升汞消毒8min，无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干水分，然后用无菌刀片将根茎切成小段后接种于菌液培养基PDA+氯霉素0.02mg/L+土壤浸出液200mL/L+手掌参根茎汁液2mL/L+琼脂13g/L中，在温度25℃、无光照条件下培养3天；
(2)待手掌参根茎周围菌丝生长旺盛时挑取一个单菌落转接到10mL菌液培养基PDA+氯霉素0.02mg/L+土壤浸出液200mL/L+手掌参根茎汁液2mL/L中进行纯化培养3d；
所述土壤浸出液是将4g手掌参根茎周围的土壤溶解在100mL蒸馏水中，摇床震荡20min后取上清液制得；
所述手掌参根茎汁液是将手掌参根茎用碾钵碾磨出汁液后过滤制得。
实施例4
手掌参种子的播种过程如下：
(1)手掌参果荚的选择和消毒：选择当年成熟且未开裂的果荚，果荚表面无病斑、虫斑，将采收的果荚手工去除表面多余的枝干及枯萎的部分，再用清水反复冲洗，然后放入75％的酒精中浸泡30min，取出晾干后备用；
(2)手掌参果荚的接种：将酒精浸泡后的果荚去除宿存花被、蕊柱、果柄，用自来水洗净后，用75％的酒精表面消毒3分钟，然后置于0.1％的升汞溶液中消毒6～10分钟，用无菌水冲洗2～3次后用无菌滤纸吸干表面的水分；然后将果荚的一端剪开，使种子均匀撒在实施例1制得的无菌播种培养基表面；
(3)种子萌发：培养温度采用18～25℃，播种前期采用暗培养，2月左右有绿芽萌发后改为光培养。手掌参种子在18～25℃萌发生长较快，温度过高易褐变死亡，温度过低发芽慢。当温度低于8～10℃时，即使满足营养条件也不能萌发。培养30～60天后统计，出苗率是自然播种出苗率的2～3倍。

Claims (2)

1.一种手掌参无菌播种培养基，其特征在于：该无菌播种培养基以MS为基本培养基，在每升培养基中含有：玉米素0.1～0.3mg、激动素0.4～0.8mg、萘乙酸0.1～0.5mg、赤霉素0.2～0.5mg、酪蛋白0.2～0.6g、活性炭0.5～2.0g、氯霉素0.02～0.05mg、琼脂8～12g、蔗糖5～10g和手掌参内生菌液3～5mL，pH值为4.7～5.5；
所述手掌参内生菌液由如下方法制得：
(1)将新鲜的手掌参根茎洗净、消毒、无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干水分，然后用无菌刀片将根茎切成小段后接种于菌液培养基PDA+氯霉素0.02mg/L+土壤浸出液200mL/L+手掌参根茎汁液2mL/L中，在温度18～25℃、无光照条件下培养2～3天；
(2)待手掌参根茎周围菌丝生长旺盛时挑取一个单菌落转接到10mL菌液培养基中进行纯化培养2～3d；
所述土壤浸出液是将2～4g手掌参根茎周围的土壤溶解在100mL蒸馏水中，充分震荡后取上清液制得；
所述手掌参根茎汁液是将手掌参根茎用碾钵碾磨出汁液后过滤制得。
2.根据权利要求1所述的手掌参无菌播种培养基，其特征在于：手掌参内生菌液制备步骤(1)中手掌参根茎用0.1％的升汞消毒4～8min。
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