CN107006372A - 香椿离体组织快速繁殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了香椿离体组织快速繁殖的方法。本发明方法中，以香椿无菌苗、成熟叶片及幼嫩茎段为原材料，并通过配制不同培养基组合，优化筛选了适于香椿愈伤组织诱导、幼芽分化及植株生根的培养基，同时通过对再生苗的移栽基质及条件控制进行优化，能够快速培育凉都红香椿，并为建立香椿种子苗圃及开发和利用香椿树种，以及最终推动地区产业化发展提供理论前提。

Description

香椿离体组织快速繁殖的方法

技术领域

本发明涉及林业生物技术领域，具体而言，涉及香椿离体组织快速繁殖的方法。

背景技术

香椿[Toona sinensis(A.Juss)Roem]属楝科多年生落叶乔木，喜阳光，适宜生长在昼夜温差大及肥沃的沙质土壤中。香椿原产我国中部，目前在全国很多地方已大面积栽培，主要分布在黄河流域和长江流域之间，尤以河北、山东栽种最多。香椿生长迅速、树干通直且材质花纹美观，既可用作速生材，又是上等的木生蔬菜，具有很高的营养价值、药用价值和食疗价值；另外，香椿的芽和种子等也可作为工业原料。

香椿叶浸提液活性成分的分析结果表明，其含有多种生物活性物质，包括没食子酸(gallic acid)、芦丁(rutin)、槲皮苷(quercitin)、儿茶酚(catechin)、表儿茶酚(epicatechin)、棕榈酸(palmitic acid)、油酸(oleicacid)、亚油酸(linoleic acid)、亚麻酸(linolenic acid)、β-谷甾醇混合物(a mixture of β-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、β-谷甾醇糖苷(β-sitosteryl-glucoside)、榈酸乙酯(ethyl gallate)、二十碳酸乙酯、正二十六烷醇、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮、杨梅素、杨梅苷等，这些化合物具有较高的药用与保健价值。

此外，香椿作为我国传统的名贵木本蔬菜，除了色香味俱佳外，还含有丰富的营养成分。据报道，1kg香椿嫩芽含蛋白质98g、脂肪8g、糖类72g、胡萝卜素90mg、维生素B₁ 12mg、维生素B₂ 1.3mg、维生素C 1.15g、钙1.1g、磷1.2g以及铁34mg。香椿所含营养成分居西红柿、甜椒、黄瓜、大白菜、甘蓝、菠菜、芹菜、萝卜、胡萝卜等主要蔬菜之首。同时，香椿芽可鲜食、炒食、凉拌、油炸、腌制以制作成不同的食品，深受广大群众喜爱。

虽然香椿作为食材两用的优良树种具有重要的经济价值，但在自然条件下，人们通常用播种、扦插育苗、埋根、分蘖等无性繁殖方法进行香椿的繁殖。然而，这些方法往往具有繁殖系数低、速度慢等缺点。同时，香椿芽生产受季节性影响明显，采收期短，仅限于春季的采收，因此传统的栽培生产很难满足生产需要，不利于快速繁殖和优良品种的选育推广栽培。

植物生物技术的发展，尤其是细胞工程和基因工程理论和实践的突破，为快速繁殖优良品种、改良品种和培育新品种提供了新的途径。其中，植物组织培养是快速繁育良种的重要策略手段之一。植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性。1902年，德国植物学家Gottlieb Haber landt提出了离体细胞培养的概念，并首次将分离的完全分化的细胞进行了组织培养试验。之后Skoog和Miller提出了激素控制器官形成的概念，使植物组织培养再生体系建立的研究达到了一个新水平。

目前，植物组织培养的应用和研究主要涉及到花卉、药用植物、农林蔬菜等方面。木本植物由于普遍存在生长周期较长，体细胞中含有较多的多酚类物质易导致植物材料褐化，短期经济效益较低，科研难度较大等现象，其组织培养研究相对较少。香椿作为我国特有的木本类蔬菜植物具有重要的开发及应用价值，尽管国内已有一些学者对其离体培养及快速繁殖进行了研究，但香椿在离体快繁中通常会出现愈伤分化困难，褐化严重，分化芽再生植株不易，移栽存活率低的问题。因此本研究以凉都香椿为材料，经过长期研究，探索了一种适于香椿的组织再生培养技术，可为推动地区产业化经济发展提供参考。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种香椿离体组织快速繁殖的方法，本发明方法能够有效解决香椿传统育种过程中周期长、繁育系数低、耗时费力等技术问题，为香椿的快速繁殖、良种培育提供理论保障。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种香椿离体组织快速繁殖的方法，所述方法包括如下步骤：

a)无菌外植体获取

将香椿种子冲洗后浸种，然后消毒，播撒于种子萌发培养基中进行培养，得到无菌幼苗，然后将无菌幼苗进行剪切处理，分别得到无菌幼苗叶片切块以及无菌幼苗下胚轴切段；

摘取香椿新发幼叶以及新发幼嫩枝条，并冲洗、消毒，然后分别进行剪切处理，分别得到成熟组织叶块以及成熟组织茎段；

b)愈伤诱导及植株再生

分别将无菌幼苗叶片切块、无菌幼苗下胚轴切段、成熟组织叶块和成熟组织茎段接种于愈伤诱导培养基中，待愈伤组织形成后，转移至愈伤分化培养基中继续培养至出现分化芽；然后，将分化芽从愈伤组织上剥离，并接入生根培养基中继续培养；

c)再生组织移栽

选取长出不定根的试管苗，移出栽培室，并进行炼苗；然后，移栽至灭菌基质中。

可选的，本发明中，步骤a)中香椿种子的消毒为依次经酒精消毒和升汞消毒；

优选的，所述酒精消毒为采用75％酒精溶液进行消毒，并消毒20s；

优选的，所述升汞消毒为采用0.1％升汞溶液进行消毒，并消毒8min。

可选的，本发明中，步骤a)中所述种子萌发培养基为添加有GA₃、NAA、蔗糖以及琼脂的1/2MS基本培养基；

优选的，所述种子萌发培养基中GA₃的含量为0.5mg/L，NAA的含量为0.05mg/L，蔗糖的含量为0.3％，琼脂的含量为7g/L。

可选的，本发明中，步骤a)中所述培养的温度为25±5℃，光照时数为12h，光照强度为1000-2000lx。

可选的，本发明中，步骤a)中香椿新发幼叶以及新发幼嫩枝条的消毒为依次经酒精消毒和升汞消毒；

优选的，所述酒精消毒为采用75％酒精溶液进行消毒，并消毒45s；

优选的，所述升汞消毒为采用0.1％升汞溶液进行消毒，并消毒8～10min。

可选的，本发明中，步骤b)中所述愈伤诱导培养基为添加有TDZ、NAA、蔗糖以及琼脂的MS基本培养基；

优选的，所述愈伤诱导培养基中TDZ的含量为0.15mg/L,NAA的含量为0.3mg/L，蔗糖的含量为0.3％，琼脂的含量为7g/L。

可选的，本发明中，步骤b)中所述愈伤分化培养基为添加有6-BA、KT、NAA、蔗糖以及琼脂的MS基本培养基；

优选的，所述愈伤分化培养基中，6-BA的含量为0.1mg/L，KT的含量为0.5mg/L，NAA的含量为0.1mg/L，蔗糖的含量为0.3％，琼脂的含量为7g/L。

可选的，本发明中，步骤b)中所述生根培养基为添加有NAA、蔗糖以及琼脂粉的1/2MS基本培养基；

优选的，所述生根培养基中，NAA的含量为0.5mg/L，蔗糖的含量为0.2％，琼脂粉的含量为6g/L。

可选的，本发明中，步骤c)中所述基质为经过灭菌的腐殖质和碎炉渣混合基质；

优选的，基质中腐殖质和碎炉渣的质量为3:2。

可选的，本发明中，步骤c)中进行移栽后，幼苗前期在适当遮荫的条件下培育，然后在自然光照条件下培育，并定期灭菌；

优选的，幼苗前期遮荫培育过程中，环境的湿度首先保持在85～95％，然后逐步降低至70％；

优选的，所述定期灭菌为采用40％多菌灵800倍液进行灭菌；

更优选的，所述定期灭菌为每隔5～7天进行一次灭菌，并灭菌2～3次。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)外植体取材广泛，以往的研究结果表明，针对不同香椿外植体需要调整不同的培养，而本申请中针对不同来源的外植体材料均可采用相同的愈伤诱导培养基、幼芽愈伤分化培养基以及生根培养培养基进行培养。

(2)愈伤组织分化率高，本申请中通过使用本发明培养基，能够通过培养香椿离体组织形成色泽黄绿、结构致密的愈伤组织，而这也利于进一步的继代及分化培养，与现有技术中所公开的愈伤诱导培养基相比，本发明各步骤中所用培养基成分简单，无需复杂的配方，能够有效节约成本。

(3)重复性与普遍性高，本发明中对材料的处理方式统一，简便，容易重复，且能够推广应用。

(4)经济效益高。通过组织再生实验发现，本研究发明的培养基配方能较好地诱导愈伤组织分化出嫩芽，并最终形成完整的植株。同时，移栽过程中对基质和环境条件的探索为提高香椿的移栽存活率提供了理论保障。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为香椿叶块；

图2为出现愈伤组织结构的香椿叶块；

图3为香椿愈伤组织；

图4为长有分化芽的香椿愈伤组织；

图5为香椿组培植株。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中以香椿无菌苗、成熟叶片及幼嫩茎段为材料，通过配制不同培养基组合，优化筛选，并得到适于香椿愈伤组织诱导、幼芽分化及植株生根的培养基。同时，通过对再生苗的移栽基质及条件控制进行探索，为快速培育凉都红香椿、建立香椿种子苗圃及开发和利用香椿树种，并最终推动地区产业化发展提供理论前提。

在本发明一个优选的方案中，本发明中所涉及的是一种凉都红香椿(Toonasinensis Roem)离体组织快速繁殖的方法。

鉴于现有技术中，对于不同来源的香椿外植体需要使用不同的培养基体系，以及由此所带来的香椿外植体培养操作上的复杂与不便，本申请中特提供了一种新的香椿培养体系。通过对所用愈伤诱导培养基、愈伤分化培养基以及生根培养基营养成分的调整以及各培养阶段条件的调控，使得该体系能够适用于无菌香椿苗、香椿成熟叶片以及香椿幼嫩茎段(尚未木质化)等不同来源的香椿外植体，而且均能够实现由外植体诱导和培育形成新的香椿植株。

本发明所构建的体系具体参考如下：将香椿无菌外植体(无菌香椿苗、香椿成熟叶片以及香椿幼嫩茎段等)在愈伤诱导培养基中诱导培养，至愈伤组织形成，此步骤中所用愈伤诱导培养基为：MS基本培养基+0.15mg/L TDZ(噻重氮苯基脲)+0.3mg/L NAA(萘乙酸)+0.3％蔗糖(即，蔗糖的质量百分比为0.3％)+7g/L琼脂；

优选的，诱导培养期间每10～14d继代培养一次；

在愈伤组织形成后，将其转移至愈伤分化培养基中，并培养至分化芽出现；此阶段中，所用愈伤分化培养基为：MS+0.1mg/L 6-BA(6-苄基氨基嘌呤)+0.5mg/L KT(激动素)+0.1mg/L NAA+0.3％蔗糖+7g/L琼脂粉；

将分化芽从愈伤组织上剥离，然后转入生根培养基中继续培养，此阶段中，所用生根培养基为：1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2％蔗糖+6g/L琼脂粉；

在培养过程中，自继代培养至生根培养阶段，均在光照条件下进行，光照强度为1000lx，光照时间为12h/d，培养的室温为25℃。

经过上述体系的培养，得到再生的香椿幼苗，经炼苗后，清洗除去苗基部的培养基，移栽至灭菌基质中继续培育，得到香椿植株。

而由本发明原材料外植体的获取和制备、培养体系的构建以及后续培的整体流程也可以得知的是，本发明方法适用范围广，能够以相同的培养基和流程体用于不同香椿外植体的培养，这不仅扩大了外植体的来源范围，也简化了香椿离体组织快速繁殖的步骤，同时还降低了成本，具有大规模推广和应用的价值。

实施例1

1.培养基配制

1)种子萌发培养基：1/2MS+0.5mg/L GA₃+0.05mg/L NAA+0.3％蔗糖+7g/L琼脂粉，pH为6.0；

2)愈伤诱导培养基：MS+0.15mg/L TDZ+0.3mg/L NAA+0.3％蔗糖+7g/L琼脂粉，pH为6.0；

3)愈伤分化培养基：MS+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.3％蔗糖+7g/L琼脂粉，pH为6.0；

4)生根培养基：1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2％蔗糖+6g/L琼脂粉，pH为6.0。

2.外植体选择

1)无菌苗外植体

将香椿种子去壳，除去杂物，用水清洗2次。然后将种子置于烧杯中浸泡，放置于25℃恒温箱中(12h)。除去漂浮的种子，清洗下层的种子，并将其置于盘子中用湿纱布盖上，放置于25℃恒温箱中(12h)。取少许种子，放于培养皿中，用75％酒精溶液消毒20s，再用0.1％升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗4-6次后用无菌滤纸吸干水分后，播于种子萌发培养基中进行萌发，待香椿种子萌发至两片真叶长出时备用。

2)成熟组织外植体

选取生长健壮、无病虫害，长势强的香椿植株。剪取当年生枝条上的完展叶片，置于75％酒精溶液中消毒20s，再用0.1％升汞溶液消毒8min，无菌水冲洗5-7次后用无菌滤纸吸干，置于灭菌培养皿上切成如图1所示的0.5cm²的香椿叶块备用。

选择4-6月生长良好、长势好的当年新萌发枝条，截取尚未木质化的幼嫩部分，去掉可见叶，置于流水中冲洗30min。然后，在无菌室内的超净工作台上，依次用75％酒精处理45s，0.1％升汞灭菌10min。然后，用无菌水冲洗3-5次，将无菌茎段材料分别剪成0.5-1.0cm长的小茎段备用。

3.培养及移栽

1)将萌发25-30d的无菌小香椿苗在超净工作台上取出置于灭菌的培养皿上，用锋利的手术刀分别将子叶、真叶及下胚轴切下，分别接于愈伤诱导培养基上进行愈伤诱导培养；形成香椿愈伤组织后，转到愈伤分化培养基上诱导芽分化；

2)将灭菌的成熟小叶块或幼嫩茎段组织放置于愈伤诱导培养基上培养，每10-14d继代培养一次，直至如图2所示，切面开始出现愈伤组织；待愈伤长大，并形成如图3所示的香椿愈伤组织后，转移至愈伤分化培养基上继续培养数周至幼芽分化，得到图4所示长有分化芽的香椿愈伤组织；

3)将由无菌苗外植体、成熟组织叶块以及茎段愈伤形成的分化芽小心切离并插入生根培养基中进行生根培养，培养大约25-30d，待分化芽长出3-5条根时可以进行后续的移栽实验；

4)对组培香椿苗进行炼苗移栽试验，选择如图4所示的株高2-3cm、展开叶3-5片、并有3-5条根的香椿组培植株，揭开培养瓶的封口膜，练苗5-7天，然后用自来水冲洗去苗基部的培养基，移栽到已灭过菌的腐殖质与碎炉渣以3∶2的比例混合的基质中进行培育。

培育的前期适当遮阴并保持湿度在85-95％，逐步降至70％，15d后去掉薄膜罩，定期喷洒40％多菌灵800倍液杀菌，5-7d一次，共计2-3次，生根苗生长为再生植株，成活率达到83％。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种香椿离体组织快速繁殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a)无菌外植体获取

将香椿种子冲洗后浸种，然后消毒，播撒于种子萌发培养基中进行培养，得到无菌幼苗，然后将无菌幼苗进行剪切处理，分别得到无菌幼苗叶片切块以及无菌幼苗下胚轴切段；

摘取香椿新发幼叶以及新发幼嫩枝条，并冲洗、消毒，然后分别进行剪切处理，分别得到成熟组织叶块以及成熟组织茎段；

b)愈伤诱导及植株再生

分别将无菌幼苗叶片切块、无菌幼苗下胚轴切段、成熟组织叶块和成熟组织茎段接种于愈伤诱导培养基中，待愈伤组织形成后，转移至愈伤分化培养基中继续培养至出现分化芽；然后，将分化芽从愈伤组织上剥离，并接入生根培养基中继续培养；

c)再生组织移栽

选取长出不定根的试管苗，移出栽培室，并进行炼苗；然后，移栽至灭菌基质中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中香椿种子的消毒为依次经酒精消毒和升汞消毒；

优选的，所述酒精消毒为采用75％酒精溶液进行消毒，并消毒20s；

优选的，所述升汞消毒为采用0.1％升汞溶液进行消毒，并消毒8min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述种子萌发培养基为添加有GA₃、NAA、蔗糖以及琼脂的1/2MS基本培养基；

优选的，所述种子萌发培养基中GA₃的含量为0.5mg/L，NAA的含量为0.05mg/L，蔗糖的含量为0.3％，琼脂的含量为7g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述培养的温度为25±5℃，光照时数为12h，光照强度为1000-2000lx。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中香椿新发幼叶以及新发幼嫩枝条的消毒为依次经酒精消毒和升汞消毒；

优选的，所述酒精消毒为采用75％酒精溶液进行消毒，并消毒45s；

优选的，所述升汞消毒为采用0.1％升汞溶液进行消毒，并消毒8～10min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述愈伤诱导培养基为添加有TDZ、NAA、蔗糖以及琼脂的MS基本培养基；

优选的，所述愈伤诱导培养基中TDZ的含量为0.15mg/L,NAA的含量为0.3mg/L，蔗糖的含量为0.3％，琼脂的含量为7g/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述愈伤分化培养基为添加有6-BA、KT、NAA、蔗糖以及琼脂的MS基本培养基；

优选的，所述愈伤分化培养基中，6-BA的含量为0.1mg/L，KT的含量为0.5mg/L，NAA的含量为0.1mg/L，蔗糖的含量为0.3％，琼脂的含量为7g/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述生根培养基为添加有NAA、蔗糖以及琼脂粉的1/2MS基本培养基；

优选的，所述生根培养基中，NAA的含量为0.5mg/L，蔗糖的含量为0.2％，琼脂粉的含量为6g/L。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述基质为经过灭菌的腐殖质和碎炉渣混合基质；

优选的，基质中腐殖质和碎炉渣的质量为3:2。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中进行移栽后，幼苗前期在适当遮荫的条件下培育，然后在自然光照条件下培育，并定期灭菌；

优选的，幼苗前期遮荫培育过程中，环境的湿度首先保持在85～95％，然后逐步降低至70％；

优选的，所述定期灭菌为采用40％多菌灵800倍液进行灭菌；

更优选的，所述定期灭菌为每隔5～7天进行一次灭菌，并灭菌2～3次。