CN104585040B - 一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法，包括如下步骤：选取生长饱满的走马胎种子，表面消毒灭菌后经赤霉素处理，接种在萌发培养基上诱导形成幼芽，切取幼芽胚轴接入不定芽诱导培养基形成不定芽，再将不定芽切成带1～2个腋芽的小段接入芽增殖培养基中进行增殖培养，后切取生长健壮、长3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，并炼苗移栽。本发明的优点：能够利用小量走马胎材料快速增殖产生大量不定芽，成活率高达82.5%，为走马胎的工厂化育苗提供了一条有效的途。

Description

一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法。
背景技术
走马胎(Ardisia gigantifoliaStapf)是民间常用的跌打损伤药，根茎及全株具有祛风壮骨、活血化淤、消肿止痛、止血生肌等功效，可治疗类风湿关节炎，筋骨疼痛、跌打损伤、产后淤血、半身不遂、痈疽溃疡等。现代研究证明，走马胎富含三萜皂苷类、岩白菜素衍生物类、挥发油类等化合物，其中三萜皂苷类成分对多种肿瘤细胞活性都具有较强的抑制作用。如：从走马胎干燥根茎中提取分离的以西克拉敏 A 为母核的齐墩果烷型五环三萜皂苷化合物 AG4，对肺癌细胞 A549、肝癌细胞 Bel-7402、人胃腺癌细胞 BGC-823、人膀胱癌细胞 EJ、人宫颈癌细胞 HeLa、人肝癌细胞 HepG2、人乳腺癌细胞 MCF-7、人结肠腺癌细胞 LS180等9 种肿瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用。在我国西南地区，走马胎是一种药食同源植物，人们在蒸炖食物时经常加入走马胎的根茎一起煮，可起到强身健体、提高免疫力的作用。此外，当地人们劳作后就用走马胎的叶片煮水泡脚、洗澡等，以去除疲劳和体内湿气。
近年来市场上走马胎价格一直走高，一株长有胎盘的走马胎植株能卖到150～200元。在巨大利益驱动下人们采取掠夺式采挖，野生资源破坏严重，有些分布点已经很难见到走马胎的踪影。为了满足市场需求，人工种植势在必行。
然而，科技人员多年研究发现，走马胎开花座果率不到5%，多数情况下得不到种子。好不容易得到的种子也要经过漫长的时间才能萌发，通常10月份采收的种子要到次年6～7月份才能萌发。同时走马胎植株的年生长量较低，一年只有一条主枝生长而没有侧枝分化生长，即使剪掉主枝顶芽，植株也只是从剪口下方萌发一个侧芽，而极少有见萌发两个的。又因走马胎的枝叶亦具有良好的药用效果，如果进行扦插繁殖不仅插穗材料有限，而且还存在与药材争资源的现象。可见，利用播种和扦插方法繁育走马胎种苗十分有限。
组织培养技术在植物种苗繁育中已得到广泛应用，技术也相对成熟。利用组织培养技术繁殖走马胎种苗即可克服播种及扦插繁殖中的材料限制，又可在短期内获得大量优良种苗。目前，针对走马胎的研究多集中于生物学、生态资源及有效成分分析等领域，而对于走马胎种苗组织培养技术的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法，克服了常规方法繁殖走马胎种苗材料紧缺、速度慢等问题。
本发明以具有良好开发应用前景的走马胎为材料，通过特殊处理缩短种子萌发时间，再取种子萌发形成的幼芽胚轴为材料诱导产生大量不定芽，并对获得的不定芽进行继代增殖及生根，快速获得大量走马胎的种苗，从而实现了本发明的目的。
本发明一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法，包括以下步骤:
（1）选取生长饱满的走马胎种子，经表面消毒灭菌后加入浓度为100~150 mg/L的赤霉素水溶液，在温度为35±2℃、转速为130~138转/分钟的摇床上浸泡24h，无菌水清洗干净；
（2）将处理后的种子接入萌发培养基中获得幼芽，萌发培养基为：MS+6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L、0.1~0.2%活性炭，pH为5.8；
（3）切取幼芽胚轴接入不定芽诱导培养基中获得不定芽，胚轴不定芽诱导培养基为：WPM+6-BA 0.1～0.5 mg/L+KT 0.1～0.5 mg/L +NAA 0.1～0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（4）将不定芽切成带1～2个腋芽的小段接入芽增殖培养基中进行增殖培养，芽增殖培养基为：WPM+6-BA 0.1～0.5 mg/L+ZT 0.01～0.05 mg/L +NAA 0.01～0.1 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（5）切取生长健壮、长3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：WPM+NAA 0.1～1.0 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L、0.1~0.2%活性炭，pH为5.8；
（6）将生根试管苗在湿度为70～80%的室内散射光下炼苗10天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的树皮︰火烧土︰园土为1︰2︰2的混合基质中，成活率为66.7～82.5%。
所述步骤（2）中培养条件为温度28±2℃的暗培养。
所述步骤（3）、（4）、（5）中培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。
所述培养基中，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤；NAA为1-萘乙酸；KT为6-糠氨基嘌呤（激动素）；ZT为6-(4-羟基-3-甲基-2-丁烯基)氨基嘌呤（玉米素）。
MS主要包含以下成分：(1) NH4NO3 1650 mg/L、(2)KNO3 1900 mg/L、(3)CaCl2﹒2H2O 440 mg/L、(4)MgSO4﹒7H2O 370 mg/L、(5)KH2PO4 170 mg/L、(6)Na2-EDTA 37.3 mg/L、(7)FeSO4﹒7H2O 27.8 mg/L、(8)MnSO4﹒4H2O 22.3 mg/L、(9)ZnSO4﹒7H2O 8.6 mg/L、(10)H3BO3 6.2 mg/L、(11)KI 0.83 mg/L、(12)Na2MoO4﹒2H2O 0.25 mg/L、(13)CuSO4﹒5H2O 0.025 mg/L、(14)CoCl2﹒6H2O 0.025 mg/L、(15)盐酸硫胺素VB1 0.1 mg/L、(16)烟酸0.5 mg/L、(17)肌醇100 mg/L、(18)甘氨酸2 mg/L、(19)盐酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L。
WPM主要包含以下成分：(1) NH4NO3 400 mg/L、(2) CaCl2﹒2H2O 96 mg/L、(3)Ca(NO3)2﹒4H2O 556 mg/L、(4)MgSO4﹒7H2O 370 mg/L、(5)KH2PO4 170 mg/L、(6)K2SO4 990 mg/L、(7)H3BO3 6.2 mg/L、(8)MnSO4﹒H2O 17.7 mg/L、(9)ZnSO4﹒7H2O 8.6 mg/L、(10)Na2MoO4﹒2H2O 0.25 mg/L、(11)CuSO4﹒5H2O 0.025 mg/L、(12) FeSO4﹒7H2O 27.8 mg/L、(13) Na2-EDTA 37.3 mg/L、(14) 肌醇100 mg/L、(15) 甘氨酸2 mg/L、(16) 烟酸0.5 mg/L、(17)烟酸硫胺素1.0 mg/L、(18)盐酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L。
所述走马胎种子为，从广西植物研究所走马胎种质圃中采集果皮呈深红色的成熟果实，室内去除果肉、种皮，并用自来水清洗干净，生长饱满的种子。
所述种子消毒灭菌为，在超净工作台上，先用体积分数为70~75%的酒精溶液浸泡30秒，再用质量分数为15%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10~15分钟，后用无菌水冲冼5次，无菌滤纸吸干表面的水分备用。
赤霉素具有打破种子休眠、促进萌发的作用，常用于提高萌发困难种子的萌发效率，但赤霉素作为一种植物生长调节物质，要根据特定物种严格控制浓度范围和作用时间，否则效果不明显，或损伤甚至杀死作用材料。
赤霉素处理种子时的浸泡条件也是影响效果的一个重要因素，较高温度有利于药剂渗透、提高种子内各种酶的活性；使用摇床则可以防止缺氧，并使浓度保持一致从而减少误差。
所述赤霉素水溶液的优选浓度为100~120 mg/L，浸泡时间为24 h，作用温度为35±2℃，摇床转速为130~138转/分钟。
所述赤霉素水溶液与种子体积比为5︰1。
所述种子萌发培养基优选为：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L、0.2%活性炭，pH为5.8。
所述胚轴不定芽诱导培养基优选为：WPM+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
所述芽继代增殖培养基优选为：WPM+6-BA 0.2 mg/L+ZT 0.02 mg/L +NAA 0.05 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
所述生根培养基优选为：WPM+NAA 0.5 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L、0.2%活性炭，pH为5.8。
采用本发明方法，经过步骤（1）处理的走马胎种子，在步骤（2）的种子萌发培养基中培养5～7天胚根萌发伸长，40～50天胚轴伸长2～3cm，并且子叶展开形成幼芽，萌发率达85.2～97.5%。
将步骤（2）中获得的幼芽胚轴切分成1cm长的小段，接种于步骤（3）的胚轴不定芽诱导培养基中，培养45天胚轴上半部能形成8～15个不定芽，诱导率达87.6～94.6%。
将步骤（3）中获得的不定芽切成带1～2个腋芽的小段接种于步骤（4）的芽继代增殖培养基中，培养60天的增殖倍数为3.7～5倍，并且芽苗粗壮长势良好。
将生长健壮高度达到3～4cm的单芽接入步骤（5）的生根诱导培养基中，培养30天能形成4～7条、长2～10cm的白色粗壮根，生根率达77.6～90.4%。
将生根后的试管苗经室内炼苗后，移栽于经甲基托布津消毒的树皮：火烧土：园土为1：2：2的混合基质中，30天的成活率为66.7～82.5%。
本发明的优点为：
本发明方法有效地解决了走马胎种苗传统生产过程中繁殖材料不足、时间长、效率低等问题。
本发明方法建立了一套利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法，包括种子播前处理、种子萌发诱导培养、胚轴不定芽诱导培养、芽继代增殖及生根培养技术。播种40～50天形成胚轴长2～3cm的幼苗,萌发率达85.2～97.5%；胚轴接种45天诱导形成8～15个不定芽，诱导率87.6～94.6%；芽继代60天繁殖系数为3.7～5倍，单芽生根率77.6～90.4%，生根苗移栽成活率为66.7～82.5%。采用本发明方法繁殖走马胎种苗，具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强等特点，能在较短时间内获得大量走马胎种苗，对走马胎种质资源保护和可持续利用具有重要意义，应用前景非常广阔。
附图说明
图1为实施例1播种40天的走马胎幼苗；
图2 为实施例1培养30天胚轴形成的不定芽生长情况；
图3 为实施例1培养60天胚轴形成的不定芽生长情况；
图4 为实施例1增殖培养30天芽生长情况；
图5 为实施例1生根培养30天的生根苗；
图6 为实施例1生根苗移栽30天的生长情况。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的阐述，但不是对本发明的限制。实施例中未注明具体条件及操作的实验方法，按照常规方法，或按照说明书上制造商提供的要求进行。除非特别定义，本发明中所使用的专业用语均为本领域科技人员熟悉的含义。
培养基的制备：按照常规方法配制培养基，调节pH值为5.8，分装后124℃灭菌25 min，备用。
种子采集、处理及消毒：从广西植物研究所走马胎种质圃采集果皮呈深红色，没有病虫危害生长良好的成熟果实，去掉果肉和种皮，并用自来水清洗干净，选取生长饱满的种子。在超净工作台上，先用体积分数为70~75%的酒精溶液浸泡30秒，再用质量分数为15%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10~15分钟，后用无菌水冲冼5次，无菌滤纸吸干表面的水分备用。
实施例 1
利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法，包括以下具体步骤:
(1) 选取生长饱满的走马胎种子，经表面消毒灭菌后加入浓度为120 mg/L的赤霉素水溶液，溶液与种子的体积比为5︰1，在温度为35±2℃、转速为130~138转/分钟的摇床上浸泡24h，无菌水清洗干净。
(2) 将处理后的种子接种在萌发培养基中，萌发培养基为：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L、0.2%活性炭，pH为5.8；培养条件为温度28±2℃的暗培养。培养5～7天胚根萌发伸长，40～50天胚轴伸长2～3cm，并且子叶展开形成幼芽，萌发率达97.5%，参见图1。
(3) 种子萌发后，切取幼芽胚轴接入不定芽诱导培养基中诱导不定芽，胚轴不定芽诱导培养基为：WPM+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养30天胚轴形成的不定芽生长情况，参见图2；培养45天胚轴上半部能形成8～15个不定芽，诱导率94.6%；培养60天胚轴形成的不定芽生长情况，参见图3。
(4) 将不定芽切成带1～2个腋芽的小段接入芽增殖培养基中进行增殖培养，芽增殖培养基为：WPM+6-BA 0.2 mg/L+ZT 0.02 mg/L +NAA 0.05 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养60天的增殖倍数为5倍，并且芽苗粗壮长势良好，参见图4。
(5) 切取生长健壮、长3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：WPM+NAA 0.5 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L、0.2%活性炭，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养30天能形成4～7条、长2～10cm的白色粗壮根，生根率达90.4%，参见图5。
(6) 将生根试管苗在湿度为70%左右的室内散射光下进行炼苗10天，后洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的树皮︰火烧土︰园土为1︰2︰2的混合基质中，成活率为82.5%，参见图6。
实施例 2
利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法，包括以下具体步骤:
(1) 选取生长饱满的走马胎种子，经表面消毒灭菌后加入浓度为150 mg/L的赤霉素水溶液，溶液与种子的体积比为5︰1，在温度为35±2℃、转速为130~138转/分钟的摇床上浸泡24h，无菌水清洗干净。
(2) 将处理后的种子接种在萌发培养基中，萌发培养基为：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L、0.2%活性炭，pH为5.8；培养条件为温度28±2℃的暗培养。培养40天萌发率为85.2%。
(3) 种子萌发后，切取幼芽胚轴接入不定芽诱导培养基中诱导不定芽，胚轴不定芽诱导培养基为：WPM+6-BA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养45天诱导率87.6%。
(4) 将不定芽切成带1～2个腋芽的小段接入芽增殖培养基中进行增殖培养，芽增殖培养基为：WPM+6-BA 0.5 mg/L+ZT 0.02 mg/L +NAA 0.05，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养60天的增殖倍数为3.7倍。
(5) 继代增殖培养后，切取生长健壮、长3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：WPM+NAA 1.0 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L、0.2%活性炭，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养30天生根率达83.5%。
(6) 将生根试管苗在湿度为70%左右的室内散射光下进行炼苗10天，后洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的树皮︰火烧土︰园土为1︰2︰2的混合基质中，成活率为66.7%。
实施例 3
利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法，包括以下具体步骤:
(1) 选取生长饱满的走马胎种子，经表面消毒灭菌后加入浓度为100 mg/L的赤霉素水溶液，溶液与种子的体积比为5︰1，在温度为35±2℃、转速为130~138转/分钟的摇床上浸泡24h，无菌水清洗干净。
(2) 将处理后的种子接种在萌发培养基中，萌发培养基为：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L、0.2%活性炭，pH为5.8；培养条件为温度28±2℃的暗培养。培养40天萌发率为89.5%。
(3) 种子萌发后，切取幼芽胚轴接入不定芽诱导培养基中诱导不定芽，胚轴不定芽诱导培养基为：WPM+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.2 mg/L +NAA 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养45天诱导率90.1%。
(4) 将不定芽切成带1～2个腋芽的小段接入芽增殖培养基中进行增殖培养，芽增殖培养基为：WPM+6-BA 0.1 mg/L+ZT 0.05 mg/L +NAA 0.1，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养60天的增殖倍数为4.5倍
(5) 切取生长健壮、长3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：WPM+NAA 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉5 g/L、蔗糖30 g/L、0.2%活性炭，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。培养30天生根率达73.3%。
(6) 将生根试管苗在湿度为70%左右的室内散射光下进行炼苗10天，后洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的树皮︰火烧土︰园土为1︰2︰2的混合基质中，成活率为75%。

Claims (8)

1.一种利用走马胎幼芽胚轴快速繁殖其种苗的方法，其特征在于包括以下步骤:
（1）选取生长饱满的走马胎的种子，经表面消毒灭菌后加入浓度为100~150 mg/L的赤霉素水溶液，在温度为35±2℃、转速为130~138转/分钟的摇床上浸泡24h，无菌水清洗干净；
（2）将处理后的种子接种在萌发培养基中获得幼芽，萌发培养基为：MS+6-BA 0.5～1.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L、0.1~0.2%活性炭，pH为5.8；
（3）切取幼芽胚轴接入不定芽诱导培养基中获得不定芽，胚轴不定芽诱导培养基为：WPM+6-BA 0.1～0.5 mg/L+KT 0.1～0.5 mg/L +NAA 0.1～0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（4）将不定芽切成带1～2个腋芽的小段，接入芽增殖培养基中进行继代增殖培养，芽增殖培养基为：WPM+6-BA 0.1～0.5 mg/L+ZT 0.01～0.05 mg/L +NAA 0.01～0.1 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（5）切取生长健壮、长3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：WPM+NAA 0.1～1.0 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L、0.1~0.2%活性炭，pH为5.8；
（6）将生根试管苗在湿度为70～80%的室内散射光下炼苗10天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的树皮︰火烧土︰园土为1︰2︰2的混合基质中，成活率为66.7～82.5%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述赤霉素水溶液的浓度为100~120 mg/L，赤霉素水溶液与走马胎种子的体积比为5︰1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述萌发培养条件为温度28±2℃的暗培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）、（4）、（5）中所述培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述萌发培养基为：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L、0.1~0.2%活性炭，pH为5.8。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述胚轴不定芽诱导培养基为：WPM+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述芽增殖培养基为：WPM+6-BA 0.2 mg/L+ZT 0.02 mg/L +NAA 0.05 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）所述生根培养基为：WPM+NAA 0.5 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L、0.1~0.2%活性炭，pH为5.8。
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