CN103109745B

CN103109745B - 一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法

Info

Publication number: CN103109745B
Application number: CN201310074450.0A
Authority: CN
Inventors: 顾地周; 顾川岳; 陆爽; 姜云天; 朱俊义; 程广有; 禚玲玲; 张学士; 王秋爽; 付航; 潘雨
Original assignee: Tonghua Normal University
Current assignee: Tonghua Normal University
Priority date: 2013-03-10
Filing date: 2013-03-10
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2033-03-10
Also published as: CN103109745A

Abstract

本发明涉及一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法。其步骤如下：（1）将烤烟型烟草品种的种子播于苗盘中，待种子萌发得处理后茎尖作为外植体备用。（2）茎尖接种至附加吲哚乙酸0.02～0.05mg·L^-1和赤霉素1.50～1.70mg·L^-1，食用白糖10g·L^-1，琼脂条8.5g·L^-1的基本培养基中进行脱除烟草花叶病毒培养；（3）培养温度控制在52～54℃，培养48～54d后，实现烟草花叶病毒脱除。（4）当茎尖生长至1.0cm时，即可切割0.05cm的茎尖进一步开展无毒苗培养，可直接应用于无花叶病毒烟草种苗的工厂化生产。腋芽萌发生长及茎段基部生根培养，成苗率可达99.3%。无毒苗成活率达95.0%以上。

Description

一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法

技术领域　

本发明涉及一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，属于植物繁殖技术。

背景技术

在现有技术中，烟草（Nicotiana tabacum）是茄科烟草属一年生草本植物。烟草除应用于卷烟工业，还可在开发食品和药物资源方面有诸多潜在用途。烟叶富含蛋白质，利用鲜烟叶提取蛋白，其亩产量可超过大豆，其他作物更无法相比。烟叶提取的蛋白可制作多种食品，剩下的烟叶仍可用作卷烟的原料。从烟叶中提取烟碱制成医药可防治人们的病患，制成农药可防治农作物害虫，其前景也是可观的。烟草是著名的模式作物，可当作生物反应器将其他作物的抗癌、抗艾滋病以及有益于人们健康的基因导入烟草，使其充分表达后利用生物技术提取，进一步加工成药物。如美国科学家已成功培养出抗体烟草，从中提取抗癌和抗病毒干挠素，对肺癌有良好的治疗作用。瑞典科学家将人体基因注入烟草植株，从收获的烟叶中提出血液蛋白质活化剂，可医治心脏病等。由此看出，烟草有益于健康的潜在用途并不比用作卷烟所起的经济效益少。

目前，为适应卷烟工业的需要，在全国烟草种植区内大力发展烤烟种植，但是国内烟叶总体质量较低，与国外特别是美国的烟叶相比有一定差距。出口国外价格低，使用价值不高，只能用作填充料。除烟草种植区划、施肥、成熟度、烤烟设施和工艺外，大多是烟草病毒病的存在，导致烟草产量和质量的降低。烟草病毒病主要有普通花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、马铃薯Y病毒病、蚀纹病毒病。我国各烟区都普遍发生，以云南、贵州、四川、黑龙江、吉林和辽宁等省受害较重。据调查，受害烟田达30%～70%。使烟叶内在品质下降，失去烘烤价值。

以上病毒中，危害较大且普遍的病毒为花叶病毒Tobacco mosaic virus(TMV) ，该病毒病自苗床期至大田成株期均可发生。移栽后20天到现蕾期，为发病高峰期，打顶后田间病株仍旱上升趋势，但主要在烟杈上显症，为害不大。幼苗被侵染后，新叶的叶脉组织变浅绿色，呈半透明的“明脉症”，迎光透视可见病叶大小叶脉十分清晰，几天后叶片形成黄绿相间的“花叶症”。大田期，烟株受侵染后，首先在心叶上发现“明脉”现象，尔后呈现花叶、泡斑、畸形、坏死等典型症状。轻型花叶只在叶片上形成黄绿相间的斑驳，叶形不变。以往防治多采用高效、高毒、高残留的化学药物进行防治，这就导致烟草中含有农药残留，使烟草质量和价格降低。我国应该坚持科技兴烟，提高烤烟质量，以抗病强品种选育和无病毒烟苗研究为方向的发展模式。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种方法简单、操作方便、效果好的试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法。

本发明的技术解决方案是：一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其步骤如下：

（1）将烤烟型烟草品种的种子播于苗盘中，待种子萌发且苗长至3～5 cm时，得处理后茎尖作为外植体备用。

（2）茎尖接种至附加吲哚乙酸0.02～0.05 mg·L^-1和赤霉素1.50～1.70 mg·L^-1，食用白糖10 g·L^-1，琼脂条8.5 g·L^-1的基本培养基中进行脱除烟草花叶病毒培养；基本培养基成份及使用用量：174 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，360 mg·L^-1KNO₃，122.5 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，218 mg·L^-1KH₂PO₄；18.4 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，24.9 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；12.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，7.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.32 mg·L^-1KI。优选吲哚乙酸0.02 mg·L^-1和赤霉素1.50 mg·L^-1。

（3）培养温度控制在52～54 ℃，培养48～54 d后，实现烟草花叶病毒脱除。

（4）当茎尖生长至1.0 cm时，即可切割0.05 cm的茎尖进一步开展无毒苗培养。

步骤（1）中处理是指将2 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水冲洗8次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切取0.05～0.20 cm的茎尖。

进行脱毒种苗高效快繁体系的建立；具体是待无毒茎尖生长至1.0～1.5 cm和基部生根后，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留2叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述基本培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养。

进行炼苗和移栽；具体是待无毒茎段基部发出3～5条根且长至1.0 cm以上，苗高达2 cm时，从培养瓶中取出试管苗，在含有5 mg·L^-1高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经300倍液多菌灵消毒过的腐烂松针、草炭土和细河砂＝3:2:1混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在70%，温度控制在22±2 ℃，每天自然光照10 h，每天中午揭开部分塑料薄膜进行通风换气30 min，10 d后揭去薄膜，每天早晨喷洒清水1次，无毒苗成活率达95.0%以上。

本发明的优点是：1、本发明开展了烟草脱毒技术研究，直接以无菌系烟草茎尖（小于1.0 cm）为材料，采用茎尖和高温联合脱毒的集成方法对烟草进行了脱毒，并取得了显著效果，解决了以往茎尖脱毒需要茎尖极小和高温脱毒导致植株生长发育变态后植株活力差及死亡，操作难度大，脱毒不完全等缺点。2、利用脱毒后的植株茎节采用节增殖方式的一步成苗对脱毒苗进行了快速繁殖，此方法解决了以往方法的不足，并对为无公害栽培烟草提供优质种苗，可直接应用于无花叶病毒烟草种苗的工厂化生产，对烟草行业的生产和发展具有重要意义。3、腋芽萌发生长及茎段基部生根培养，成苗率可达99.3%。无毒苗成活率达95.0%以上。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 外植体材料来源与处理

烟草种子为烤烟型红花烟草品种，将种子播于苗盘中，待种子萌发且苗长至3～5 cm时，将2 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水冲洗8次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切取1.0 cm的茎尖作为外植体备用。

1.2 烟草花叶病毒完全脱除的茎尖长度、培养温度和培养时间筛选

基本培养基成份及使用用量：174 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，360 mg·L^-1KNO₃，122.5 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，218 mg·L^-1KH₂PO₄；18.4 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，24.9 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；12.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，7.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.32 mg·L^-1KI。基本培养基中附加吲哚乙酸IAA0.02～0.05 mg·L^-1和赤霉素GA₃ 1.50～1.70 mg·L^-1，添加食用白糖10 g·L^-1，琼脂条8.5 g·L^-1，pH 5.8。将外植体材料嫩茎尖分别切割成0.40～0.80 cm的大小接种到培养基中，待基部生根后，置于温度为30～50 ℃条件下，培养15～42 d过程中，每隔3天检测脱毒率。为了提高烟草花叶病毒的脱除速度和脱毒率，采用均匀设计法设计实验，每个处理数接种茎尖数为10 个，重复3次取平均值，选用U₁₀(10³)均匀表，筛选烟草花叶病毒全部脱除的最佳茎尖长度、培养温度和培养时间。

病毒检测方法采用试纸条法进行烟草花叶病毒的快速检测，将试纸条的胶体金复合物端插入300～400 μL离心后的检测样品中，10 min后可根据检测线和质控线颜色变化来判断是否脱除病毒的简易方法，当检测线和质控线都出现红色时，证明病毒未脱除；只有质控线变红时，说明病毒已脱除。脱毒率计算方法：脱毒率(%)=(无病毒茎尖数/接入茎尖总数)×100%。

1.3 烟草脱毒苗的高效快繁体系建立和炼苗移栽

以全部脱毒的茎尖为材料，将无毒茎尖接种至附加吲哚乙酸IAA0.02～0.05 mg·L^-1和赤霉素GA₃ 1.50～1.70 mg·L^-1，食用白糖10 g·L^-1，琼脂条8.5 g·L^-1的基本培养基中，调节培养基pH至 5.8，在温度(24±2)℃，光照强度1200 lx，光照周期12 h·d^-1条件下培养。待茎尖生长至需要高度和茎尖基部生根时，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留2叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养。培养一段时间后，待茎段生根和苗生长到一定高度时，统计计算出增殖周期和倍数。

待无毒茎段基部发出一定数量根且长至需要高度时，从培养瓶中取出试管苗，在含有高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经多菌灵消毒过的腐烂松针、草炭土和细河砂(3:2:1)混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，每天注意自然光照，通风换气，待苗成活并开始生长后揭去薄膜，每天适当喷洒清水。

2 结果与分析

2.1烟草茎尖长度、培养温度和培养时间对烟草花叶病毒脱除的影响

表1 影响烟草花叶病毒脱除主要因素的U₁₀(10³)试验设计与结果

数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=75.3-47.6X ₁+0.427X ₂+0.375X ₃，样本容量Ｎ=10，显著性水平α=0.05，复相关系数Ｒ=0.9734，剩余标准差S＝3.0800，检验值F _t＝36.07﹥临界值F _(0.05,3,6)＝4.757，回归方程具有显著性。烟草茎尖长度、培养温度和培养时间均对烟草花叶病毒脱除影响显著，说明烟草茎尖长度、培养温度和培养时间均是影响烟草花叶病毒脱除不可缺少的主要因素。通过计算烟草茎尖长度、培养温度和培养时间对烟草花叶病毒脱除的贡献值和贡献率可知，U ₁＝305，U ₁/U＝29.7%；U ₂＝68.3，U ₂/U＝6.64%；U ₃＝91.8，U ₃/U＝8.92%，说明3个因素对烟草花叶病毒脱除的贡献顺序为：烟草茎尖长度>培养时间>培养温度，又因烟草茎尖长度与脱毒率呈负相关，而培养温度和培养时间均与脱毒率呈正相关。所以，猜测烟草茎尖长度低于0.40 cm，培养温度和培养时间分别超过50 ℃和42 d时，烟草花叶病毒脱除率可能更高。为验证推测，又以烟草茎尖长度为0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10和0.05 cm，培养温度为50、52、54、56、58和60 ℃，培养时间为42、45、48、51、54、57和60 d开展12个水平的验证试验，重复3次。结果发现，烟草茎尖长度为(0.05～0.20 cm)、培养温度为(52～54 ℃)和培养时间为(48～54 d)时，烟草花叶病毒脱除率最高，脱毒率达100.0%，均高于表1所列10个处理的脱毒率。

因此，将烤烟型红花烟草品种的种子播于苗盘中，待种子萌发且苗长至3～5 cm时，将2 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水冲洗8次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切取0.05～0.20 cm的茎尖，接种至附加吲哚乙酸IAA0.02～0.05 mg·L^-1和赤霉素GA₃ 1.50～1.70 mg·L^-1，食用白糖10 g·L^-1，琼脂条8.5 g·L^-1的基本培养基中进行脱除烟草花叶病毒培养，培养温度控制在52～54 ℃，培养48～54 d后，烟草花叶病毒脱除率达100.0%。当茎尖生长至1.0 cm时，即可切割0.05 cm的茎尖进一步开展无毒苗培养。

2.2 脱毒种苗高效快繁体系的建立

根据1.3中方法，待无毒茎尖生长至1.0～1.5 cm和基部生根后，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留2叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养，成苗率可达99.3%。经过25 d的培养，每个小植株可切成5段，每瓶可接种8个茎段，每年可进行12次切割。

2.3 炼苗和移栽

根据1.3中方法，待无毒茎段基部发出3～5条根且长至1.0 cm以上，苗高达2 cm时，从培养瓶中取出试管苗，在含有5 mg·L^-1高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经300倍液多菌灵（常规杀菌剂）消毒过的腐烂松针、草炭土和细河砂(3:2:1)混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在70%，温度控制在(22±2) ℃，每天自然光照10 h，每天中午温度极度高时，适当揭开部分塑料薄膜进行通风换气30 min，10 d后揭去薄膜，每天早晨喷洒清水1次，无毒苗成活率达95.0%以上。

那么，年生产烟草无花叶病毒苗数为：∑年产种苗=(8×5¹²×99.3%×95.0%)株，可见本发明可直接应用于无花叶病毒烟草种苗的工厂化生产。本发明对烟草行业的生产和发展具有重要意义。

Claims

1. 一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于步骤如下：

（1）将烤烟型烟草品种的种子播于苗盘中，待种子萌发且苗长至3～5 cm时，得处理后茎尖作为外植体备用；所述的处理是指将2 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水冲洗8次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切取0.05～0.20 cm的茎尖；

（2）茎尖接种至附加吲哚乙酸0.02～0.05 mg·L^-1和赤霉素1.50～1.70 mg·L^-1，食用白糖10 g·L^-1，琼脂条8.5 g·L^-1的基本培养基中进行脱除烟草花叶病毒培养；基本培养基成份及使用用量：174 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，360 mg·L^-1KNO₃，122.5 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，218 mg·L^-1KH₂PO₄；18.4 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，24.9 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；12.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，7.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.32 mg·L^-1KI；

（3）培养温度控制在52～54 ℃，培养48～54 d后，实现烟草花叶病毒脱除；

2.按照权利要求1所述的一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于进行脱毒种苗高效快繁体系的建立；具体是待无毒茎尖生长至1.0～1.5 cm和基部生根后，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留2叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述基本培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养。

3.按照权利要求2所述的一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于进行炼苗和移栽；具体是待无毒茎段基部发出3～5条根且长至1.0 cm以上，苗高达2 cm时，从培养瓶中取出试管苗，在含有5 mg·L^-1高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经300倍液多菌灵消毒过的腐烂松针、草炭土和细河砂＝3:2:1混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在70%，温度控制在22±2 ℃，每天自然光照10 h，每天中午揭开部分塑料薄膜进行通风换气30 min，10 d后揭去薄膜，每天早晨喷洒清水1次，无毒苗成活率达95.0%以上。

4.按照权利要求1所述的一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于步骤（2）中吲哚乙酸0.02 mg·L^-1和赤霉素1.50 mg·L^-1。