CN101103701B

CN101103701B - 温郁金脱毒及快速繁殖方法

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Publication number: CN101103701B
Application number: CN2007100707027A
Authority: CN
Inventors: 姜维梅; 沈瑛瑛; 傅承新
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-08-06
Filing date: 2007-08-06
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2027-08-06
Also published as: CN101103701A

Abstract

本发明公开了一种温郁金的脱毒及组培快速繁殖方法。包括外植体的选取与处理，诱导培养、再生植株的病毒鉴定、增殖培养、移栽等步骤。本发明以MS培养基为基础，加入植物生长调节剂：6-苄基腺嘌呤、激动素、α-柰乙酸、硫酸腺嘌呤等用于温郁金顶端分生组织的诱导培养及丛生芽的增殖和生根两个关键阶段。采用本发明所提供的成套技术方法对温郁金进行组织培养和快繁，解决了温郁金因营养繁殖所造成的病毒积累，品质下降，产量降低的难题，达到了繁殖系数高，技术稳定的要求。可以为温郁金的工厂化生产提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的育苗方法。

Description

温郁金脱毒及快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种温郁金脱毒及快速繁殖方法。

背景技术

植物是药物的天然宝库，人类利用药用植物来防病治病已有几千年历史。全世界约有75％的人口以植物作为治疗疾病的药物来源(刑建民，2001)。当今的处方药有25％左右来自于药用植物(邱德有，2000)。随着经济和医疗保健事业的飞速发展，中药资源的需求出现了空前的增长，从中药中提取有效成分应用于化妆品、食品及工业原料的研究也越来越深入，这些原因在不同程度上加大了中药资源的压力。加之长期以来，对开发利用中药资源的认识不足，一些地区不同程度上对中药资源进行了掠夺式的过度采收，致使很多中药资源蕴含量下降，甚至枯竭，一些种类濒临灭绝(黄璐琦，2001)。生物技术的蓬勃发展为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法。植物组织和细胞培养技术则是其中一个重要的手段。近年来，国内外在这方面已做了大量工作，已成功离体培养获得试管植株的药用植物有200多种。

温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)是姜科Zingiberaceae姜黄属Curcuma多年生草本。温郁金入药早在7世纪的唐代编著的药典《新修本草》中就有记载。浙江瑞安是该药材的道地产区，分布在瑞安飞云江畔的仙降、马屿、陶山及永嘉一带，也是全国温郁金的唯一产区，被列为“浙八味”之一(郑坚，2004)。

温郁金是全国郁金三个品种(广郁金、川郁金、温郁金)之一，温郁金同株作物三种药材——郁金、莪术、姜黄(浙江植物志，1993)。郁金(块根)具有行气祛淤，清心解郁，利胆退黄之功(李敏，2004)；莪术(主根茎)有破淤、行气、消积和止痛的功能(国家药典委员会，2005)；姜黄(侧根茎)具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、降血脂、抗癌、抗早孕、抗凝血、降压、保肝、护肝等多种功能(王琰，2001)。

温郁金根茎和块根的主要活性物质为挥发油和姜黄素类成分。挥发油主要成分为倍半萜类，已分离并鉴定出了20余个成分，其中莪术醇、莪术二酮、莪术酮和榄香烯等为挥发油主要的抗癌和抗生育活性成分。姜黄素类主要包括姜黄素(Curcumin)、去甲氧基姜黄素(Demethoxycurcumin)和双去甲氧基姜黄素(Bidemethoxycurcumin)(黄可新，2000；李艳萍，2000；张炜，2006)。此外温郁金中还有生物碱、树脂类、糖类、甾醇类、脂肪酸、多肽类等成分。

近年来从温郁金的莪术油中分离出一种新型抗癌活性物质榄香烯，研制成疗效好、副作用小的新型抗肿瘤药物，使得温郁金的发展有了新的契机(郑坚，2004)。由于温莪术挥发油含量较其他莪术高(林观样，2006)，因此，温莪术成了各药厂的选购目标。随着莪术油制剂市场持续扩大，温郁金的种植和生产规模也随之扩大，2006年温郁金种植面积达4000多亩。

由于温郁金开花少，种子多不充实，所以生产上采用根茎繁殖，即用“种姜”。这样造成耗种量大。加之长期进行营养繁殖，造成温郁金品种单一，病毒化严重，品质下降，产量降低(李国栋，2002；李敏，2006)。因此培育出有效成分含量高、高产、适应性强、抗病虫害、抗逆性强的优良品种势在必行。

病毒病害是农业生产中愈来愈突出的问题。由于病毒对寄主植物细胞的绝对寄生性和植物没有动物那样的免疫代谢系统，使得植物一旦被病毒侵染就终生处于被病毒危害的状态。这使得植物病毒病的防治较其它植物病害的防治更为困难，常给农业生产带来灾难性的损失。迄今，尚缺乏特异性较强的只对病毒而不对植株产生药害的药剂。自上个世纪50年代发现通过植物组织培养可以去除病毒以来，在生产上已被广泛应用，并将其纳人常规良种无性繁殖的一个重要程序。

植物组织培养是目前最有效的去除病毒的方法，几乎对所有病毒有效(还可去除其他病原体，如细菌、真菌、类菌质体等)，周期短，效率高，与快速繁殖相结合。此外由于不使用化学药剂，可以减少污染、防止公害，因而具有良好的经济效益和社会效益。目前已在生产中得到大面积推广应用的如脱毒马铃薯、甘薯、草莓、葡萄、甘蔗、菠萝、香蕉、生姜、大蒜以及林木、花卉、珍贵中药材(贝母、番红花、半夏等)等，均取得了巨大的经济效益和社会效益。因此将植物脱毒复壮技术用于药用植物的良种选育，不仅为其产业化发展及进一步的开发利用奠定基础，而且对传统中药的现代化开发利用也是有益的启发和探索。

迄今为止，在国内外尚未见关于温郁金脱毒及快速繁殖的报道。我们通过大量实验，终于摸索出一套成熟的方法，成功实现了温郁金的脱除病毒及离体快繁，可以快速培育出大量种苗，为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。

参考文献：

1.国家药典委员会.中华人民共和国药典2005版.一部，2005：94

2.黄可新，陶正明，张安将等.温莪术化学成分的研究.中国中药杂志，2000，25(3)：163-164

3.黄璐琦，李慧，陈京荔.珍稀濒危中药资源保护的相关问题探讨.世界科学技术——中药现代化，2001，3(6)：46-49

4.李国栋，许付，沈爱军.莪术油的研究进展.中国药学杂志，2002，37(11)：806-809

5.李敏，王琦，付福友.不同品种郁金的SRAP研究.中草药，2006，37(8)：1255-1258

6.李敏，唐远，付福友等.郁金的研究进展.世界科学技术-中医药现代化，综述，2004，6(2)：35-39

7.李艳萍.中药郁金的化学成分研究.西北大学学报(自然科学版)，2000，30(5)：411-414

8.林观样，蔡进章，潘晓军等.温莪术传统生产技术调查.中药材，2006，29(9)：887-888

9.邱德有.试论药用植物有效成分基因调控的研究进展.世界科学技术——中药现代化，2000，2(3)：30-34

10.王琰，王慕邹.姜黄属常用中药的研究进展.中国药学杂志，2001，36(2)：80-84

11.邢建民，赵德修，叶和春等.水母雪莲细胞生物反应器悬浮培养.植物学报，2000，42(1)：98-101

12.张炜，刘雯，覃洁萍.中药莪术的研究概况.广西科学院学报，2006，22(S)：481-486

13.郑坚，陈秋夏，张旭乐等.温州山区主要中药材(植物药)生产现状与发展对策.浙江林业科技，2004，24(3)：63-67

14.浙江植物志编写组.浙江植物志(第七卷).杭州，浙江科学技术出版社，1993，477-478

文中所提及的缩写字母的以及见如下缩略词表：

MS Murashige and Skoog medium MS培养基

BA 6-benzyladenine 6-苄基腺嘌呤

KT kinetin 激动素

NAA α-naphthaleneacetic acid α-柰乙酸

AdS adenine sulphate 硫酸腺嘌呤

发明内容

本发明的目的是提供一种温郁金的组培快速繁殖方法。

温郁金的脱毒及快速繁殖方法包括如下步骤：

1)将温郁金根状茎放在温度36～38℃下4～5周，取出根状茎，用400～500倍百菌清浸泡30～40分钟后，置于底部打若干小洞的塑料周转箱中，以细沙铺底和覆盖，浇透水，将周转箱置于23～27℃温室下催芽培养20～25天，定期喷水，待培育的芽长至1～2公分时，选用顶芽及腋芽流水冲洗30～40分钟后，置于75％酒精中处理20～30秒，然后用0.1％HgCl₂灭菌处理6～10分钟后用无菌水冲洗3～5次后用于茎尖的剥离与接种；

2)将灭菌后1～2公分顶芽或腋芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点，带一个叶原基，切为0.1～0.2毫米见方的小块，接种于诱导培养基中进行诱导培养，诱导培养基为：MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/l、MS+BA2.0mg/l+NAA1.0mg/l、MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L+AdS30mg/l或MS+KT2mg/l+NAA 1.0mg/l；

3)采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒，反应结果用连续波长生物测读仪于405nm处读取OD值，烟草花叶病毒的阳性对照采用确定含烟草花叶病毒的烟草新鲜叶，阴性对照采用健康烟草；黄瓜花叶病毒的阳性对照采用确定含黄瓜花叶病毒的黄瓜新鲜叶组织，阴性对照采用健康黄瓜叶片；样品OD₄₀₅值/阴性对照OD₄₀₅值明显≥2，判为阳性；样品OD₄₀₅值/阴性对照OD₄₀₅值明显＜2，判为阴性，样品的OD₄₀₅值用SPSS数据处理系统进行分析；

4)将生长于诱导培养基上经过病毒检测确定为无病毒的植株转接于增殖培养基上，增殖培养基为：MS+BA1mg/l、MS+BA2mg/l、MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l。

5)在增殖培养基上植株一步成苗，移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土为1∶1～2∶0.5～1的混合基质上。

所述的诱导培养基中的pH值为5.8～6.0，培养温度25～27℃，每天光照时间为16h，光照强度为35～40μmol.m^-2.s^-1。

所述的将鉴定为无病毒的生长在诱导培养基上的植株转接于增殖培养基上进行增殖培养：培养15～20天，可见植株基部出现4～10个新芽，将长的新芽在无菌条件下取出，直接放在增殖培养基上或将芽纵切为4份，每一份接种在增殖培养基上，在15～20天内，各培养容器内的芽可再生出4～10个芽。

所述的在增殖培养基上植株一步成苗，移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土为1∶1～2∶0.5～1的混合基质上：将生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5～7天，然后打开瓶盖，放置1～2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土为1∶2∶1的混合基质培养20～35天，开始10～14天，保持温度为23～25℃，相对湿度为70～80％。

本发明的优点：(1)温郁金的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵染和农药残留的影响，严格控制温郁金药材的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(3)先对材料进行脱毒处理，经双抗体夹心酶联(DAS-ELISA)反应鉴定植株的脱毒效果。应用脱毒苗进行快速繁殖，提高温郁金的品质，有效解决温郁金品质不稳定，外观和有效成分不匀的问题，为生产道地药材和产后加工销售提供保障条件。(4)该技术方法解决了温郁金快速繁殖和稳定生根的重要技术环节，达到技术稳定，繁殖系数高的要求，可应用于工业化生产的目的。(5)使用本发明提供的脱毒快繁技术得到的温郁金幼苗进行人工栽培，可以得到个体差异小，品质均一的温郁金成品(郁金、莪术、姜黄)，可以为生产莪术油等提供品质稳定的原材料。

具体实施方式

温郁金的脱毒快繁技术，包括外植体的选取与处理，诱导培养，再生植株叶片的病毒检测，增殖与生根培养，移栽等步骤。具体地操作中，可优选温郁金的顶芽、腋芽为培养材料。将温郁金根状茎放在温度36～38℃下4～5周，取出根状茎，用400～500倍百菌清浸泡30～40分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(23～27℃)下催芽培养20～25天(定期喷水)。待培育的芽长至1～2公分时，直接选用顶芽和腋芽进行表面灭菌处理或将带有萌发芽的根状茎置于35～37℃的光照培养箱中放置20～24h后再进行表面灭菌处理：流水冲洗30～40分钟，75％酒精处理20～30秒，0.1％HgCl₂(内加2～3滴吐温T-20)灭菌处理6～10分钟，无菌水冲洗3～5次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后1～2公分顶芽或腋芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)切为0.1～0.2毫米见方的小块，接种于MS+BA2.0mg/l+NAA0.5～1.0mg/l、MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L+AdS30mg/l或MS+KT2.0mg/l+NAA1.0mg/L的诱导培养基中进行诱导培养。在温度为25～27℃，每天光照16h，光强35～40μmol.m^-2.s^-1的温室中培养15～20天。然后将每瓶中的有芽抽出，有叶形成的植株分株培养并编号，以便于进行病毒的检测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)法进行检测。将检测的无毒苗的芽切开，置于MS+BA1～2mg/L或BA1mg/l+NAA0.2mg/L培养基中进行增殖培养。培养条件同上述诱导培养基。30～40天后，每个培养瓶中可以得到4～10株绿色健壮、生根很好的植株。将装有生根植株的培养容器取出，于自然环境下放置5～7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置1～2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土(1∶1～2∶0.5～1)的混合基质上。开始10天保持环境温度23～25℃，相对湿度在70％～80％，随后即可逐渐过渡到自然的环境条件。炼苗一个月后移栽到大田，可达到90％的存活率。

上述技术中诱导及增殖步骤的pH值均为5.8，培养温度25～27℃，每天光照16小时，光照强度35～40μmol.m^-2.s^-1。

使用本发明将温郁金的芽接种后，30～40天可诱导形成丛生芽，诱导率达到100％，并且根系生长健壮。在此基础上进行继代培养，丛生芽大量繁殖，大约20～30天继代一次，平均增殖倍数为8.1倍。采用上述措施的本发明，掌握了温郁金脱毒快繁过程中无毒苗的诱导及病毒检测、丛生芽的诱导、增殖和生根同步进行等关键技术问题，使温郁金这一经济植物在传统的栽种模式中由于病毒病导致的品质衰退和产量下降等问题得到了有效的解决。

本发明的优点体现在：提供的温郁金脱毒和快速繁殖技术，一个外植体一年就可繁殖出数万株无毒苗，为该药用植物的商品化生产提供了一套切实可行的生产技术路线，可以应用于温郁金的大规模工业化生产。

本发明采用下述非限定性实施例作进一步的说明。

实施例1

取采自温州瑞安的温郁金根状茎放在36℃温度下5周，取出根状茎，用400倍百菌清浸泡30分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(27℃)下催芽培养20天(定期喷水)。待培育的芽长至1～2公分时，选用顶芽及腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗40分钟后，置于75％酒精中处理20秒，然后用0.1％HgCl₂(内加2滴吐温T-20)灭菌处理6分钟后用无菌水冲洗3次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后1～2公分芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)，切为0.1～0.2毫米见方的小块，接种于MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L培养基上，培养室的温度为25℃，培养20天，可见每个外植体上有2-3个新芽出现，将长出芽的外植体在无菌条件下取出，分单株培养并编号，进行病毒的检测。结果黄瓜花叶病毒的脱毒率达到70％；烟草花叶病毒的脱毒率达到80％。将未检测到病毒的植株上部的叶子切除，保留基部0.5公分茎段(含腋芽)，将此茎段放置于MS+BA1mg/l上培养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，扩繁系数达到4。培养20天后，又可以重复上述操作。如果要移栽炼苗，则需在增殖培养基上再生长10～20天。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置1天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土(1∶2∶0.5)混合基质上。保持环境湿度在70％。一个月后移栽到大田中，可达到90％的存活率。

实施例2

取采自温州瑞安的温郁金根状茎放在38℃温度下4周，取出根状茎，用500倍百菌清浸泡40分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(23℃)下催芽培养27天(定期喷水)。待培育的芽长至1～2公分时，将根状茎及其萌动的芽转入37℃的光照培养箱中培养24小时，使病毒弱化，然后选用顶芽及腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗30分钟后，置于75％酒精中处理30秒，然后用0.1％HgCl₂(内加3滴吐温T-20)灭菌处理10分钟后用无菌水冲洗5次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后1～2公分芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)切为0.1～0.2毫米见方的小块，接种于MS+BA2.0mg/l+NAA1.0mg/L培养基上，培养室的温度为27℃，培养15天，可见每个外植体上有2～3个新芽出现，将长出芽的外植体在无菌条件下取出，分单株培养并编号，进行病毒的检测。结果黄瓜花叶病毒的脱毒率达到82％；烟草花叶病毒的脱毒率达到88％。将未检测到病毒的植株上部的叶子切除，保留基部0.5～1公分茎段(含顶芽)，将此茎段纵切为4，每一部分接入增殖培养基MS+BA2mg/l上进行连续培养，以达到快速增殖的目的。此种方法增殖系数达到9.3。培养20天后，又可以重复上述操作。如果要移栽炼苗，则需在增殖培养基上再生长10～20天。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土(1∶2∶1)混合基质上。保持环境湿度在80％。一个月后移栽到大田中，可达到90％的存活率。

实施例3

取采自温州瑞安的温郁金根状茎放在温度37℃下4周，取出根状茎，用400倍百菌清浸泡30分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(25℃)下催芽培养25天(定期喷水)。待培育的芽长至1～2公分时，将根状茎及其萌动的芽转入37℃的光照培养箱中培养24小时，使病毒弱化，然后选用顶芽及腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗30分钟后，置于75％酒精中处理30秒，然后用0.1％HgCl₂(内加2滴吐温T-20)灭菌处理8分钟后用无菌水冲洗4次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后1～2公分芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)切为0.1～0.2毫米见方的小块，接种于MS+BA2.0mg/l+NAA0.5mg/L+AdS30mg/l培养基上，培养室的温度为25℃，培养20天，可见每个外植体上有4～6个新芽出现，将长出芽的外植体在无菌条件下取出，分单株培养并编号，进行病毒的检测。将未检测到病毒的植株上部的叶子切除，保留基部0.5～1公分茎段(含顶芽)，将此茎段纵切为4，每一部分接入增殖培养基MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l上进行连续培养，以达到快速增殖的目的。此方法繁殖系数能达到10.7。培养20天后，又可以重复上述操作。如果要移栽炼苗，则需在增殖培养基上再生长10～20天。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土(1∶1∶1)混合基质上。保持环境湿度在70％。一个月后移栽到大田中，可达到90％的存活率。

实施例4

取采自温州瑞安的温郁金根状茎放在36℃温度下5周，取出根状茎，用500倍百菌清浸泡40分钟后，置于大的塑料周转箱中(底部打若干小洞)，以细沙铺底和覆盖(浇透水)，将周转箱置于温室环境(25℃)下催芽培养25天(定期喷水)。待培育的芽长至1～2公分时，将根状茎及其萌动的芽转入37℃的光照培养箱中培养24小时，使病毒弱化，然后选用顶芽及腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗30分钟后，置于75％酒精中处理30秒，然后用0.1％HgCl₂(内加2滴吐温T-20)灭菌处理10分钟后用无菌水冲洗4次后用于茎尖的剥离与接种。将灭菌后1～2公分芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点(带一个叶原基)切为0.1～0.2毫米见方的小块，接种于MS+KT2.0mg/l+NAA1.0mg/L培养基上，培养室的温度为26℃，培养20天，可见外植体上先出现根的分化，每个外植体上出现4～6条根，继续生长14～20天，才出现芽的分化。将长出芽的外植体在无菌条件下取出，分单株培养并编号，进行病毒的检测。将未检测到病毒的植株上部的叶子切除，保留基部0.5～1公分茎段，将此茎段纵切为4，每一部分接入增殖培养基MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l上进行连续培养，以达到快速增殖的目的。此种方法增殖系数达到8.3。培养20天后，又可以重复上述操作。如果要移栽炼苗，则需在增殖培养基上再生长10～20天。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土(1∶2∶1)混合基质上。保持环境湿度在80％。一个月后移栽到大田中，可达到90％的存活率。

Claims

1.一种温郁金的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将温郁金根状茎放在温度36～38℃下4～5周，取出根状茎，用400～500倍百菌清浸泡30～40分钟后，置于底部打若干小洞的塑料周转箱中，以细沙铺底和覆盖，浇透水，将周转箱置于23～27℃温室下催芽培养20～25天，定期喷水，待培育的芽长至1～2厘米时，选用顶芽及腋芽流水冲洗30～40分钟后，置于75％酒精中处理20～30秒，然后用0.1％HgCl₂灭菌处理6～10分钟后用无菌水冲洗3～5次后用于茎尖的剥离与接种；

2)将灭菌后1～2厘米顶芽或腋芽，在40倍体视显微镜下剥离茎尖生长点，带一个叶原基，切为0.1～0.2毫米见方的小块，接种于诱导培养基中进行诱导培养，诱导培养基为：MS+BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L、MS+BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L、MS+BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+AdS30mg/L或MS+KT2.0mg/L+NAA1.0mg/L；

4)将生长于诱导培养基上经过病毒检测确定为无病毒的植株转接于增殖培养基上，增殖培养基为：MS+BA1mg/L、MS+BA2mg/L、MS+BA1mg/L+NAA0.2mg/L；

5)将生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5～7天，然后打开瓶盖，放置1～2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶灭菌菜园土∶草炭土为1∶2∶1的混合基质培养20～35天，开始10～14天，保持温度为23～25℃，相对湿度为70～80％；

2.根据权利要求1所述的一种温郁金的脱毒及快速繁殖方法，其特征在于将鉴定为无病毒的生长在诱导培养基上的植株转接于增殖培养基上进行增殖培养：培养15～20天，可见植株基部出现4～10个新芽，将长的新芽在无菌条件下取出，直接放在增殖培养基上或将芽纵切为4份，每一份接种在增殖培养基上，在15～20天内，各培养容器内的芽可再生出4～10个芽。