CN101103700B

CN101103700B - 三叶青的组培快速繁殖方法

Info

Publication number: CN101103700B
Application number: CN2007100707012A
Authority: CN
Inventors: 姜维梅; 赵云鹏; 傅承新
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-08-06
Filing date: 2007-08-06
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2027-08-06
Also published as: CN101103700A

Abstract

本发明公开一种三叶青的组培快速繁殖方法。包括外植体的选取与处理，诱导培养，增殖培养，生根培养，移栽等步骤。本发明以MS培养基为基础，加入了辅助剂：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、6-苄基腺嘌呤、激动素、玉米素、萘乙酸、吲哚丁酸等，用于三叶青丛生芽诱导、壮苗及生根三个关键阶段的组织培养。本发明的优点：(1)三叶青的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵染和农药残留的影响，严格控制三叶青药材的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(3)可以保存三叶青的种质资源，同时有利于保护野生资源，减少对自然资源的破坏。

Description

三叶青的组培快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种三叶青的组培快速繁殖方法。

背景技术

植物是药物的天然宝库，人类利用药用植物来防病治病已有几千年历史。全世界约有75％的人口以植物作为治疗疾病的药物来源(刑建民，2001)。当今的处方药有25％左右来自于药用植物(邱德有，2000)。随着经济和医疗保健事业的飞速发展，中药资源的需求出现了空前的增长，从中药中提取有效成分应用于化妆品、食品及工业原料的研究也越来越深入，这些原因在不同程度上加大了中药资源的压力。加之长期以来，对开发利用中药资源的认识不足，一些地区不同程度上对中药资源进行了掠夺式的过度采收，致使很多中药资源蕴含量下降，甚至耗竭，一些种类濒临灭绝(黄璐琦，2001)。生物技术的蓬勃发展为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法。植物组织和细胞培养技术则是其中一个重要的手段。近年来，国内外在这方面已做了大量工作，已成功离体培养获得试管植株的药用植物有200多种。

三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)为葡萄科崖爬藤属多年生常绿草质蔓生藤本。异名为蛇附子(《植物名实图考》)，石抱子(《江西草药》)，金线吊葫芦、三叶对(《浙江民间常用草药》等，为民间常用的中草药(中药辞海，1993)。三叶青常生长于山坡或山沟，溪谷两旁林下阴处。主要分布在浙江、江西、福建、湖北、湖南，广东、四川、贵州、云南、台湾等地(浙江植物志，1993)。三叶青以块根或全草入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，用于治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经不调、咽痛、瘰疬等症，具有很好的疗效(中药辞海，1993)。有关三叶青的化学成分研究近几年非常热门，三叶青不同部位化学成分的鉴定也有较多报道。三叶青根中含槲皮素、山柰酚、山柰酚一3一O一新橙皮糖苷、β-谷甾醇、胡萝卜苷及6‘一O-苯甲酰基胡萝卜苷(杨大坚，1998：李瑛琦，2003)。三叶青地上部分含蒲公英萜醇、蒲公英萜酮、β一谷甾醇及麦角甾醇(刘东，1999)。药理实验表明三叶青提取物具有一定的肿瘤抑制作用(杨大坚，1998；丁钢强，2005；冯正权，2006)、显著的抗病毒及抗出血热的作用(杨学楼，1989；杨大坚，1998)和明显的消炎、镇痛与解热作用(资古明，1989；黄真，2005)及保肝作用(伍昭龙，2006；钟晓明，2006)。大鼠经口急性毒性实验表明(江月仙，2005)，按急性毒性分级标准判定，属实际无毒；进一步小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验结果均为阴性，说明三叶青未显示有致突变性。临床上主要用于抗癌及抗艾滋病毒、治疗血液病与心脑血管疾病、肝炎、脑膜炎、急性支气管炎、肺炎、肠炎及咽喉炎等感染性疾病，小儿外感高热等(伍昭龙，2006)。

由于本种植物用途广泛、药效显著，毫无节制地狂采滥挖，加上三叶青对生长环境要求苛刻，这种珍贵的草药现已濒临灭绝。现有的三叶青野生资源根本难以满足日益增长的医药领域的需要。为了保护野生的三叶青资源，同时又能满足医药工业的应用，因此有必要建立三叶青的离体再生体系，这对丰富植物组织培养的理论和应用生物技术保护种质资源以及满足临床应用等均有重要意义。

然而，由于野生三叶青对生境要求苛刻(须生长在海拔700米的深山密林和悬崖峭壁的背阴面，上面要有散射光，旁边要有细水渗出，下面要有树叶覆盖，常年气温保持在18℃左右)，生长周期长，黄酮类及酚类物质含量高，非常容易褐化，导致常规的组织培养技术十分难于对其进行快繁。

迄今为止，在国内外未见关于三叶青组织培养快繁成功的报道。我们通过大量试验，终于摸索出一套成熟的方法，成功实现了三叶青的组培快繁，可以快速培育出大量幼苗，为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。

参考文献：

1.丁钢强，郑军献，魏克民等.三叶青提取物对肝癌细胞HepG2及原代大鼠肝细胞的体外毒作用研究.浙江预防医学，2005，17(9)：1-2

2.冯正权，倪克锋，何煜等.三叶青黄酮诱导SGC-7901胃癌细胞凋亡的实验研究中国临床药理学与治疗学，2006，11(6)：669-672

3.黄璐琦，李慧，陈京荔.珍稀濒危中药资源保护的相关问题探讨.世界科学技术——中药现代化，2001，3(6)：46-49

4.黄真，毛庆秋，魏佳平.三叶青提取物抗炎、镇痛及解热作用的实验研究.中国新药杂志，2005，14(7)：861-864

5.江月仙，郭伟娣.三叶青的毒理学研究.中华医学研究杂志，2005，5(8)：774-776

6.李瑛琦，陆文超，于治国.三叶青的化学成分研究.中草药，2003，34(11)：982-983

7.刘东，杨峻山.中国特有植物三叶青化学成分的研究.中国中药杂志，1999，24(10)：611-612

8.邱德有.试论药用植物有效成分基因调控的研究进展.世界科学技术——中药现代化，2000，2(3)：30-34

9.伍昭龙，吕江明，李春艳等.三叶青对CC14致肝损伤大鼠血清五项生化指标水平的影响.甘肃中医学院学报，2006，23(4)：11-13

10.伍昭龙，吕江明.中药三叶青的研究现状.中国民族民间药杂志，2006，(78)：15-18

11.邢建民，赵德修，叶和春等.水母雪莲细胞生物反应器悬浮培养.植物学报，2000，42(1)：98-101

12.杨大坚，刘红亚，李新中等.破石珠化学成分研究.中国中药杂志，1998，23(7)：419-421

13.杨学楼，罗经，孙松柏等.中药三叶青抗病毒作用的研究.湖北中医杂志，1989，(4)：40-41

14.浙江植物志编写组.浙江植物志(第四卷).杭州：浙江科学技术出版社，1993，129

15.资古明，吉兰，胡建成等.金线吊葫芦消炎镇痛的药理研究.中草药，1989，20(2)：27-29

16.中国药科大学.中药辞海(第一卷).北京：中国医药科技出版社，1993，172-173

17.钟晓明，毛庆秋，黄真等.三叶青提取物对四氯化碳致急性肝损伤小鼠的保护作用及急性毒性实验.中成药，2006，28(3)：422-424

文中所提及的缩写字母的以及见如下缩略词表：

MS Murashige and Skoog MS培养基

medium

BA 6-benzyladenine 6-苄基腺嘌呤

KT kinetin 激动素

NAA α-naphthaleneacetic acid α-柰乙酸

IBA indole-3-butyric acid 吲哚丁酸

ZT zeatin 玉米素

GA₃ gibberellic acid3 赤霉素

PVP polyvinylpyrrolidone 聚乙烯吡咯烷酮

AC Activated charcoal 活性炭

发明内容

本发明的目的是提供一种三叶青的组培快速繁殖方法。

三叶青的组培快速繁殖方法的步骤如下：

1)优选完整的腋芽为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗30～40分钟后，置于75％酒精中处理20～30秒，然后在经0.1％的升汞Hgcl₂消毒6～10分钟后用无菌水冲洗，将腋芽接种于诱导培养基中，诱导培养为MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l；

2)将生长于诱导培养基上外植体转接于

MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、MS+BA0.5mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l或MS+ZT1mg/l+PVP0.5g/l上的培养基上进行增殖培养；

3)将进行增殖培养的高度为3～4公分壮苗转入生根培养基中，生根培养基为1/2MS+NAA0.3mg/l或1/2MS+BA 0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA₃0.2mg/l；

4)将已生根的植株取出，栽培于珍珠岩∶泥炭土为1∶1～2的混合基质上。

所述的将腋芽接种于诱导培养基中：将所选取的腋芽接种于诱导培养基中，培养2～3周，看到有许多绿色的芽点和小的不定芽出现，诱导培养基的pH值5.8～6.0，培养温度25～27℃，每天光照时间为16小时，光照强度为35～40μmol.m^-2.s^-1。

所述的将生长于诱导培养基上芽转接于增殖培养基上进行增殖培养：培养20～25天，可见小芽可长成3～4公分的无根苗，每个芽的周围有2～6个新芽出现，将丛生芽在无菌条件下取出，用解剖刀分开，置于上述增殖培养基中培养，在20～25天内，各芽再生出一至数个新芽。

所述将高度为3～4公分的壮苗转入生根培养基中：首先在黑暗条件下培养2～3天，随后转到光下培养7～10天可诱导形成根，再培养20～25天形成发达的根系。

所述的将已生根的植株取出，栽培于珍珠岩∶泥炭土为1∶1～2的混合基质上：将装有生根幼苗的培养容器置于自然温度、光照的环境下锻炼5～7天，然后打开瓶盖，放置1～2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土为1∶1的混合基质培养20～35天，开始的10～14天温度为23～25℃，相对湿度为70～80％。

本发明的优点：(1)三叶青的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵染和农药残留的影响，严格控制三叶青药材的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(3)在组培过程中进行脱毒处理，提高三叶青的品质，有效解决野生三叶青品质不稳定，外观和有效成分不匀的问题，为生产道地药材和产后加工销售提供保障条件。(4)该技术方法解决了三叶青快速繁殖和稳定生根的重要技术环节，达到技术稳定，繁殖系数高的要求，可应用于工业化生产的目的。(5)使用本发明提供的组培快繁技术得到的三叶青幼苗进行人工栽培，可以得到个体差异小，品质均一的三叶青成品，可以为临床应用提供品质稳定的原材料。(6)可以保存三叶青的种质资源，同时有利于保护野生资源，减少对自然资源的破坏。

具体实施方式

三叶青的组培快繁技术，包括外植体的选取与处理、诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽等步骤。具体地操作中，可优选三叶青的腋芽为培养材料。经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗30～40分钟后，75％酒精处理20～30秒，0.1％HgCl₂(内加2～3滴吐温T-20)灭菌处理6～10分钟，无菌水冲洗3～5次后，接种于MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l的启动培养基中进行诱导培养。在温度为25～27℃，每天光照16小时，光强35～40μmol.m^-2.s^-1的温室中培养15～20天。然后将每个外植体基部得到的从生芽切开，置于MS+BA0.5mg/l+PVP0.5g/l、MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1.0mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l或MS+ZTlmg/l+PVP0.5g/l培养基中进行增殖培养。培养条件同上述诱导培养基。20～30天后，每个外植体可以得到2～6株绿色健壮、高度达到3～4公分的植株。将需要生根的幼苗转移至1/2MS+NAA 0.3mg/l或1/2MS+BA0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA₃0.2mg/l培养基上进行生根培养。培养条件同上述诱导培养。7～10天后可以看到有根原基形成，20～25天完成生根。将装有生根植株的培养容器取出，于自然环境下放置5～7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置1～2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩：泥炭土(1∶1)的混合基质上。开始10天保持环境温度23～25℃，相对湿度在70％～80％，随后即可逐渐过渡到自然的环境条件。炼苗一个月后移栽到大田，可达到90％的存活率。

上述技术中诱导、增殖及生根步骤的培养基的pH值均为5.8～6.0，培养温度25～27℃，每天光照16小时，光照强度35～40μmol.m^-2.s^-1。

使用本发明将三叶青的腋芽接种后，20～30天可诱导形成丛生芽，一般诱导率达到78～95％。在此基础上继代培养，丛生芽可大量繁殖，大约每25天继代一次，平均增殖倍数为5.4。把继代后的丛生芽转移到本发明提供的生根培养基中20～25天可大量发根，出根率在90％左右，培养30～45天可出瓶炼苗。

采用上述措施的本发明，掌握了三叶青组织培养中丛生芽的诱导和生长，壮苗、生根等关键阶段的技术，成功解决了三叶青组培中生根困难、增殖率低、成活率低等困难，使三叶青这一珍稀药用植物实现快速育苗、工厂化栽培成为可能。使用本发明同时可以有效地保护这一珍稀野生植物资源、减少私挖滥采、形成可持续利用和合理开发相互协调的良性循环。

本发明的优点体现在：提供了三叶青的组织培养和快速繁殖技术，摸索出了快速繁殖及其稳定生根等重要环节的关键性技术，一个外植体一年就可克隆繁殖出数万株后代，为该药用植物的商品化生产提供了一套切实可行的生产技术路线，可以应用于三叶青的大规模工业化生产。

本发明采用下述非限定性实施例作进一步的说明。

实施例1

取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗30分钟后，置于75％酒精中处理30秒，然后用0.1％HgCl₂(内加2滴吐温T-20)灭菌处理6分钟后用无菌水冲洗3次后，接种于MS+BA1.0mg/l培养基上，培养室的温度为25℃，光照强度为35μmol.m^-2.s^-1，培养15天，可见每个外植体上有3～6个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l上培养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止褐化。培养20天后，将需要生根的三叶青植株转移至1/2MS+NAA0.3mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培养。20天可生根。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置1天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1)混合基质上。保持环境相对湿度在70％左右。最初两周避免直射光照射，一个月后移栽到大田中，可达到85％的存活率。

实施例2

取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗40分钟后，置于75％酒精中处理20秒，然后用0.1％HgCl₂(内加3滴吐温T20)灭菌处理10分钟后用无菌水冲洗5次后，接种于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培养基上，培养室的温度为27℃，光照强度为40μmol.m^-2.s^-1，培养20天，可见每个外植体上有4～7个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+BA0.5mg/l+PVP0.5g/l上培养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止褐化。培养20天后，将需要生根的三叶青植株转移至1/2MS+NAA0.3mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培养。20天可生根。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，洗净培养基，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶2)混合基质上。保持环境相对湿度在80％左右。最初两周避免直射光照射，一个月后移栽到大田中，可达到85％的存活率。

实施例3

取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗30分钟后，置于75％酒精中处理30秒，然后用0.1％HgCl₂(内加2滴吐温T-20)灭菌处理8分钟后用无菌水冲洗4次后，接种于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培养基上，培养室的温度为25℃，光照强度为36μmol.m^-2.s^-1，培养20天，可见每个外植体上有4～7个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+KT1mg/l+PVP0.5g/l上培养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止褐化。培养20天后，将需要生根的三叶青植株转移至1/2MS+BA0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA₃0.2mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培养。25天可生根。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，洗净培养基，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1)混合基质上。保持环境相对湿度在80％。一个月后移栽到大田中，可达到85％的存活率。

实施例4

取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗30分钟后，置于75％酒精中处理30秒，然后用0.1％HgCl₂(内加2滴吐温T-20)灭菌处理8分钟后用无菌水冲洗4次后，接种于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培养基上，培养室的温度为26℃，光照强度为38μmol.m^-2.s^-1，培养20天，可见每个外植体上有4～7个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l上培养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止褐化。培养20天后，植株生长健壮，高度达到3～4公分，部分植株的基部出现根。将需要生根的三叶青植株转移至1/2MS+BA0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA₃0.2mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培养。25天可生根。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1)混合基质上。保持环境相对湿度在80％左右。一个月后移栽到大田中，可达到85％的存活率。

实施例5

取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理：流水冲洗40分钟后，置于75％酒精中处理20秒，然后用0.1％HgCl₂(内加2滴吐温T20)灭菌处理9分钟后用无菌水冲洗4次后，接种于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培养基上，培养室的温度为26℃，光照强度为36μmol.m^-2.s^-1，培养20天，可见每个外植体上有4～7个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+ZT1mg/l+PVP0.5g/l上培养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止褐化。培养20天后，植株高度达到4～5公分。将需要生根的三叶青植株转移至1/2MS+BA0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA₃0.2mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培养。25天即可生根。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1)混合基质上。保持环境相对湿度在80％左右。一个月后移栽到大田中，可达到85％的存活率。

实施例6

炼苗与移栽：将实施例5得到的三叶青试管苗，在自然光照下炼苗7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到以珍珠岩∶泥炭土(1∶1)为基质的12公分塑料盆，每盆1株，每15盆为一个单位。置于温室大棚中，保持最高昼温＜32℃，最低夜温＞18℃，保持环境相对湿度在70～80％，遮光70％。移栽后用塑料膜覆盖，每天对叶面喷1次水，10天后除去覆盖的塑料薄膜，20天浇一次1/4MS营养液。1个月后，幼苗成活率达到90％以上，可以移栽到大田。

Claims

1.一种三叶青的组培快速繁殖方法，其特征在于方法的步骤如下：

1)挑选完整的腋芽为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗30～40分钟后，置于75％酒精中处理20～30秒，然后再经0.1％的升汞Hgcl₂消毒6～10分钟后用无菌水冲洗，将腋芽接种于诱导培养基中，诱导培养基为MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l；

2)将生长于诱导培养基上外植体转接于MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、MS+BA0.5mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l或MS+ZT1mg/l+PVP0.5g/l的培养基上进行增殖培养；

3)将进行增殖培养的高度为3～4公分壮苗转入生根培养基中，生根培养基为1/2MS+NAA0.3mg/l或1/2MS+BA0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA₃0.2mg/l；

4)将已生根的植株取出，栽培于珍珠岩∶泥炭土为1∶1～2的混合基质上；

所述的将腋芽接种于诱导培养基中：将所选取的腋芽接种于诱导培养基中，培养2～3周，看到有许多绿色的芽点和小的不定芽出现，诱导培养基的pH值5.8～6.0，培养温度25～27℃，每天光照时间为16小时，光照强度为35～40μmol.m^-2.s^-1；

所述的将生长于诱导培养基上的芽转接于增殖培养基上进行增殖培养：培养20～25天，小芽长成3～4公分的无根苗，每个芽的周围有2～6个新芽出现，将丛生芽在无菌条件下取出，用解剖刀分开，置于上述增殖培养基中培养，在20～25天内，各芽再生出一至数个新芽。

2.根据权利要求1所述的一种三叶青的组培快速繁殖方法，其特征在于所述将高度为3～4公分的壮苗转入生根培养基中：首先在黑暗条件下培养2～3天，随后转到光下培养7～10天诱导形成根，再培养20～25天形成发达的根系。

3.根据权利要求1所述的一种三叶青的组培快速繁殖方法，其特征在于所述的将已生根的植株取出，栽培于珍珠岩∶泥炭土为1∶1～2的混合基质上：将装有生根幼苗的培养容器置于自然温度、光照的环境下锻炼5～7天，然后打开瓶盖，放置1～2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土为1∶1的混合基质培养20～35天，开始的10～14天温度为23～25℃，相对湿度为70～80％。