CN1271919C - 八角莲的组培快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种八角莲的组培快速繁殖方法。包括外植体的选取与处理，诱导培养，增殖培养，生根培养，移栽等步骤。本发明以MS培养基为基础，加入了辅助剂：活性炭、6-苄基腺嘌呤、赤霉素、玉米素，用于八角莲丛生芽的诱导生长和壮苗生根两个关键阶段。采用本发明所提供的成套技术方法对八角莲进行组织培养和微繁，解决了八角莲难于快速繁殖及稳定生根的重要技术难题，达到了繁殖系数高，技术稳定的要求。可以为八角莲的工业化生产提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的育苗方法。

Description

八角莲的组培快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种八角莲的组培快速繁殖方法。

背景技术

植物是药物的天然宝库，人们利用药用植物的历史源远流长，全世界约有75％的人口以植物作为治疗预防疾病的药物来源(邢建民，2001)。人类已经从植物中发现了许多具有高度生理活性的药物，目前从植物来源的药物占药物总量的25％以上(郑光植，1987)。我国的传统中草药已有数千年的历史，至今仍在我国和许多国家和地区广为使用。但由于传统的中草药获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种的濒危甚至灭绝。同时随着自然生态环境的日益破坏，也进一步导致药用植物资源的匮乏。生物技术的蓬勃发展为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法，植物组织和细胞培养技术则是其中一个重要的手段。我国自1964年罗士韦教授首先报道了人参组织培养获得成功的研究成果以来，许多科学家先后从事了多种药用植物的组织培养研究。至今，我国药用植物的组织培养研究迅速发展。目前，世界各国对植物的药用开发和研究都十分重视，就以美国来说，其成药中有47％是以植物为原料制成的(谢启昆，1986)。为了解决药用植物的供需矛盾，人们采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽培的药用植物中，有不少名贵药材等生产周期较长，如人参、黄连，如果以常规方法育种或育苗，需要花费很长的时间；另有一些药用植物如贝母、番红花等，因繁殖系数小、耗种量大，导致育种速度很慢，生产成本增加。所以利用植物组织培养技术解决药用植物的植株再生与繁殖问题迫在眉睫。近年来，国内外在这方面已做了大量工作，已成功离体培养获得试管植株的药用植物至少有200种，如：云南黑节草、延龄草、高山红景天、莪术、水母雪莲、星花绣线菊、溪黄草、玉叶金花、辽东楤木等；其中包括一些具有抗癌有效成分的珍稀植物，如红豆杉、艾、黄杨、大戟属植物、长春花、米仔兰、狗牙花和香榧等。

八角莲Dysosma versipellis(Hance)M.Cheng是小檗科Berberidaceae八角莲属Dysosma的多年生草本植物，分布于我国湖南、湖北、浙江、江西、云南、贵州、四川、河南及陕西等地。生长于海拔400-1400米山坡沟谷杂木林下湿润处或阴湿溪谷草丛中。花期4-6月，果期7-9月。八角莲是我国传统中药中著名药用植物，主要取其根状茎供药用，具有化痰及清热解毒之功效，广泛应用于祛瘀解毒，治跌打损伤、关节酸痛、虫蛇咬伤，咽喉肿痛和疮疖等症。在现代医药领域，八角莲是著名抗癌药物VP-16、VM-26的主要原料。

研究表明，八角莲的根状茎和根富含鬼臼毒素、去氢鬼臼毒素和脱氧鬼臼毒素等有效成分(刘长军1997，陈敏亨1979)，其中主要有效成分是鬼臼毒素(Podophyllotoxin)，在植物体中含量可达1.4％，具有抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性。但是天然成分鬼臼毒素的毒副作用太大，不适合直接临床药用(King1946)，而是通过化学修饰(Creaven.1975)生成鬼臼毒素衍生物VP-16、VM-26等抗癌药物，这两种药物临床测试具有广谱抗癌活性，对睾丸癌、白细胞癌、淋巴肉癌、神经胶质瘤、霍杰金氏症等多种癌症有特殊疗效，现在已经广泛应用于临床。但是由于八角莲对生境要求严格，加之多年来生态环境的破坏，适合其生长的环境越来越少；又由于其具有重要的药用价值，招到滥挖乱采、过度利用，再加上本身的繁育机制不良，导致野生八角莲的分布范围和数量锐减，濒于灭绝。现在八角莲已经被列为国家三级濒危保护植物。现有的八角莲野生资源根本难以满足日益增长的医药领域的需要。因此，为了满足日益增大的药用需求，同时保护八角莲的野生资源，利用组培快繁技术，实现人工栽培是最好的解决方法。然而，由于野生八角莲对生境要求苛刻，繁殖机制不良，不仅是导致其濒危的原因，而且导致常规的组织培养技术十分难于对其进行快繁。迄今为止，在国内外尚未见关于八角莲组织培养快繁成功的报道。我们通过大量试验，历时三年终于摸索出一套成熟的方法，成功实现了八角莲的组培快繁，可以快速培育出大量幼苗，为实现工业化人工栽培八角莲提供可能。八角莲的组培快繁技术方法的成功建立，可以为大规模人工栽培药用植物八角莲提供种苗，为现代科技农业提供了一种切实可行的开发项目。

参考文献

邢建民，赵修德等.2000，水母雪莲细胞生物反应器悬浮培养.植物学报，42(1)：98-101.

郑光植.1987，植物次生代谢细胞工程研究的新进展：第六届国际植物组织与细胞培养会议评述.植物生理学通讯，(2)：75-79.

谢启昆.1986，药用植物组织培养.上海，上海科学技术出版社.刘长军，侯嵩生.1997，抗癌活性物质鬼臼类木脂素的研究进展.天然产物研究与开发，9(3)：81～89.

陈毓亨.1979，我国鬼臼类植物资源的研究.药学学报，14(2)：101-106.King L S，et al.1946，The similarity of the effect of podophyllin and colchicine and

their use in the treatment of condylomata acuminata acuminata.Since，104：244.Creaven P J，etal.1975，PTG a new antineoplastic epipodophyllotoxin，ibid，18：227.

Damayanthi Y.，Lown JW，1998，Curr.Med.Chem.，5(3)：205.

文中所提及的缩写字母的意义见如下缩略词表：

MS        Murashige and Skoog medium          MS培养基

2，4-D    2，4-dichlorophenoxy acetic acid    2，4-二氯苯氧乙酸

NAA       α-naphthal acetic acid             α-萘乙酸

IAA       indole-3-acetic acid                引哚乙酸

BA        6-benzylaminopurine                 6-苄氨基嘌呤

KT        kinetin                             激动素

GA        gibberellic acid                    赤霉素

AC        activated charcoal                  活性炭

PVP       polyvinglypyrrolidon                聚乙烯吡咯烷酮

ZT        zeatin                              玉米素

IBA       indolebutyic aci                    引哚丁酸

发明内容

本发明的目的是提供一种八角莲的组培快速繁殖方法。

方法的步骤如下：

1)外植体的选取与处理：选用八角莲的芽作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75％酒精中处理10-30秒，然后再经0.1-0.15％的升汞消毒1-10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，接种于诱导培养基中；

2)诱导培养：使用MS+BA 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L作为诱导培养基，将所选取的芽接种于上述培养基中，PH值为5.8，培养温度23-27℃，每天光照16小时，光照强度1000LX；

3)增殖培养：将生长于诱导培养基上外植体转接于MS+BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+GA0.2mg/L+PVP0.5mg/L上进行连续培养，PH值为5.8，培养温度23-27℃，每天光照16小时，光照强度1000LX；

4)生根培养：选择1/2MS+BA0.5mg/L+ZT0.5mg/L作为生根培养基，PH值为5.8，培养温度23-27℃，每天光照16小时，光照强度1000LX；

5)移栽：将已生根的植株取出，移栽到珍珠岩和泥炭土混合的基质上，珍珠岩∶泥炭土的体积比为1∶1-1.5。

本发明的优点：(1)八角莲的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵袭和农药残留的影响，严格控制八角莲的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(3)在组培过程进行脱毒处理，提高八角莲品质，有效解决野生八角莲品质不稳定，外观和有效成分不匀的问题，为生产地道药材和产后加工销售提供保障条件。(4)该技术方法解决了八角莲快速繁殖及其稳定生根的重要技术环节，达到了技术稳定，繁殖系数高的要求，可应用于工业化生产的目的。(5)使用本发明提供的组培快繁技术得到的八角莲幼苗进行人工栽培，可以得到个体差异小，品质均一的八角莲成品，可以为生产鬼臼毒素提供品质稳定的原材料。(6)可以保存八角莲的种质资源，同时有利于保护八角莲野生资源，减少对自然资源的破坏。

具体实施方式

八角莲的组培快繁技术，包括外植体的选取与处理，诱导培养，增殖培养，生根培养，移栽等步骤。具体地操作中，可优选八角莲完整的芽为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗30分钟后，置于75％酒精中处理30秒，然后在经0.1％的升汞(HgCl)消毒8分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，接种于MS+BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L培养基中进行诱导培养。在温度25±2℃，每天光照16小时，光照强度1000LX的条件下培养15-20天。然后将每瓶中得到的多个芽分别切开，置于MS+BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+GA0.2mg/L+PVP0.5mg/L培养基中进行增殖培养。培养条件同上述诱导培养。20-30天后每个培养瓶中都可以得到一株绿色健壮的幼苗，将需要生根的幼苗转移至1/2MS+BA0.5mg/L+ZT0.5mg/L培养基上进行生根培养。培养条件同上述诱导培养。25-30天左右即生根完成。将已生根的植株取出，于自然环境下放置5-7天，打开瓶盖，洗净培养基，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1-1.5)的混合基质上。前7天保持环境温度25±2℃，湿度在70％左右，随后即可逐渐过渡到自然的环境条件。炼苗一个月后移栽到大田中，可达到80％的存活率。

上述技术中诱导、增殖和生根步骤的PH值均为5.8，培养温度25±2℃，每天光照16小时，光照强度1000LX。

使用本发明将八角莲的芽接种后，20-25天可诱导形成丛生芽，一般诱导率可达75-90％。在此基础上继代培养，丛生芽可大量增殖，大约每25天继代一次，平均增殖倍数为3.3倍。把继代后的丛生芽转移到本发明提供的生根培养基中25-35天可大量发根，出根率在80％左右，培养30-45天后即可出瓶炼苗。

采用上述措施的本发明，掌握了八角莲组织培养中丛生芽的诱导和生长，壮苗生根两个关键阶段的技术，成功解决了八角莲组培中生根困难、增殖率低、成活率低等困难，使八角莲这一濒危重要药用植物实现快速育苗、工厂化栽培成为可能。使用本发明同时可以有效地保护这一珍稀野生植物资源、减少私挖滥采、形成可持续利用和合理开发相互协调的良性循环。

本发明的优异性体现在：提供了八角莲的植物组织培养和快速繁殖技术，摸索出了快速繁殖及其稳定生根等重要环节的关键性技术，一个外植体一年就可克隆繁殖出数万株后代，为该药用植物的商品化生产提供了一套切实可行的生产技术路线，可以应用于八角莲的大规模工业化生产。

本发明采用下述非限定性实施例作进一步的说明。

实施例1

取采自峨眉山的八角莲的芽，用自来水洗净，再流水冲洗半个小时后进行表面消毒，消毒方法为：70％酒精浸泡30s后，用无菌水冲洗两次，再用0.1％升汞100ml(加入2-3滴吐温T-20)消毒8min，最后用无菌水冲洗干净。接入灭菌后的培养基MS+BA0.5mg/L+ZT1.0mg/L上。温度25±2℃培养15天，可见每个外植体上有5左右个新芽出现。将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将每个芽用解剖刀分开，分别置于装有上述相同的培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+GA0.2mg/L+PVP0.5mg/L上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP防止褐化。培养20天后，将需要生根的八角莲植株转移至1/2MS+BA0.5mg/L+ZT0.5mg/L培养基上进行生根培养。30天左右即可生根。将已生根的植株取出，于自然环境下放置5-7天，打开瓶盖，洗净培养基，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1)混合的基质上。保持环境湿度在70％左右。一个月后移栽到大田中，可达到75％的存活率。

实施例2

取采自峨眉山的八角莲的芽，用自来水洗净，再流水冲洗半个小时后70％酒精浸泡30s后，用无菌水冲洗两次，再用0.1％升汞100ml(加入2-3滴吐温T-20)消毒15min，最后用无菌水冲洗干净。用无菌纸吸干，切成1厘米左右，接种在培养基MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+GA0.2mg/L中。培养温度25±2℃，光照强度1500LX，光照时间10-12h/d。培养20天，可见外植体上有5-7个新芽出现。将长有数个芽的外植体在无菌条件下取出，用解剖刀把每个芽切开，转接于1/2MS+BA0.2mg/L+IBA0.5mg/L+PVP0.05％培养基上进行生根培养。培养30天左右即可生根。将已生根的植株取出，于自然温度和光照条件下放置5-7天，打开瓶盖，洗净培养基，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1)混合的基质上。保持环境湿度在70％左右，最初两周避免直射光照射，炼苗一个月后就可以移栽到大田中，可达到存活率75％以上。

实施例3

取采自峨眉山的八角莲的芽，用自来水洗净，再流水冲洗半个小时后进行表面消毒，消毒方法为：70％酒精浸泡30s后，用无菌水冲洗两次，再用0.1％升汞100ml(加入2-3滴吐温T-20)消毒10min，最后用无菌水冲洗干净。接入灭菌后的培养基MS+BA0.5mg/L+ZT1.0mg/L上。黑暗条件下培养1～2天，再转入40W双管日光灯下培养，光强为2000lx，温度保持在25±2℃，培养15天，可见每个外植体上有5左右个新芽出现。将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将每个芽用解剖刀分开，分别置于装有上述连续培养基的培养容器中培养，在10-20天内，各培养容器内的芽可再生出数个新芽。将生长于诱导培养基上外植体转接于MS+BA0.5mg/L+ZT0.5mg/L+GA0.1mg/L+PVP0.5mg/L上进行连续培养。将需要生根的八角莲植株转移至1/2MS+BA0.5mg/L+ZT0.2mg/L培养基上进行生根培养。25天左右即可生根。将已生根的植株取出，于自然环境下放置5-7天，打开瓶盖，洗净培养基，将苗移栽到珍珠岩∶泥炭土(1∶1)混合的基质上。保持环境湿度在70％左右。一个月后移栽到大田中，可达到75％的存活率。

实施例4

炼苗与移栽：将实施例3得到的八角莲无菌苗，在自然光照下炼苗7天后开瓶。从培养基上钳取壮苗，移栽到以泥炭土∶珍珠岩(1∶1)为基质的12cm塑料盆，每盆1株，每15盆为一个单位。置于温室大棚中，保持最高昼温＜35℃，最低夜温＞18℃，相对湿度50～80％，遮光75％。移栽后用塑料膜覆盖，最初7天避免直射光照，每天对叶面喷1次水，7天后进行一次叶面追肥，并除去覆盖的塑料膜。以后每半个月浇一次1/2MS营养液。1个月后幼苗成活率达80％以上，可以移栽到大田种植。

Claims (1)

1.一种八角莲的组培快速繁殖方法，其特征在于：

1)外植体的选取与处理：选用八角莲的芽作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10-30分钟后，置于75％酒精中处理10-30秒，然后再经0.1-0.15％的升汞消毒1-10分钟后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，接种于诱导培养基中；

2)诱导培养：使用MS+BA 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L作为诱导培养基，将所选取的芽接种于上述培养基中，PH值为5.8，培养温度23-27℃，每天光照16小时，光照强度1000LX；

3)增殖培养：将生长于诱导培养基上外植体转接于MS+BA 1.0mg/L+ZT0.5mg/L+GA 0.2mg/L+PVP 0.5mg/L上进行连续培养，PH值为5.8，培养温度23-27℃，每天光照16小时，光照强度1000LX；

4)生根培养：选择1/2MS+BA 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L作为生根培养基，PH值为5.8，培养温度23-27℃，每天光照16小时，光照强度1000LX；

5)移栽：将已生根的植株取出，移栽到珍珠岩和泥炭混合的基质上，珍珠岩：泥炭土的体积比为1∶1-1.5。