CN101176430B - 采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种生物技术领域的用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法。本发明将转基因青蒿外植体经过消毒后，置于微不定芽诱导培养基上，光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽；将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基中，使微不定芽伸长；切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上，产生出不定根；将生长健壮的完整植株移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化获得大量生长正常的转基因青蒿植株。本发明筛选出适合转基因青蒿微不定芽诱导和生根的培养基，转基因青蒿外植体微不定芽诱导率超过90％，不定芽生根率为100％，再生植株移栽存活率为100％，繁殖系数达到80-100。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体是一种采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种多用途的天然药物。
目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。另外，青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究者在根中没有检测到青蒿素，因此利用组织培养及细胞工程生产青蒿素的可行性也不高。
随着青蒿素生物合成途径研究的逐渐深入以及植物次生代谢工程的不断发展，利用转基因技术提高青蒿中青蒿素的含量是一种颇具前景的方法。目前，已有青蒿素含量较高的转基因青蒿。然而，转基因青蒿一般为杂合体，不具备遗传稳定性，后代中基因发生分离，不利于农业生产。从转基因青蒿培育纯系品种需要很长的时间，而且耗费大量的人力物力，这使得转基因青蒿的大面积推广受到了一定的限制。
经对现有技术的查新，现有文献中目前已有多种植物通过微不定芽技术快速繁殖成完整再生植株的报道。如果能通过微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿，将对保持转基因青蒿的遗传稳定性，对转基因青蒿的大面积推广、保障充足优质的青蒿种苗、提高青蒿素产量具有重要意义。目前尚未发现与本发明主题所提及的采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法。本发明中涉及的青蒿微不定芽诱导培养基、微不定芽伸长培养基、不定芽生根培养基和移栽基质用于本发明微不定芽组织培养的方法，建立了用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，能够在短时间内繁殖出大量的转基因青蒿苗，为转基因青蒿的大面积推广、保障充足优质的青蒿种苗、提高青蒿素产量奠定了坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明将转基因青蒿外植体经过消毒后，置于微不定芽诱导培养基上，经光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽；将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基上，使微不定芽伸长；切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上，产生出不定根；将生长健壮的完整植株移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化获得生长正常的转基因青蒿植株。
所述转基因青蒿外植体的消毒，是指：从转基因青蒿植株上剪取外植体，用75％酒精消毒20秒，无菌水清洗1遍，1.5％HgCl2消毒6分钟，无菌水清洗5-6遍。
所述外植体为含有生长点的幼嫩茎段，长1cm-2cm。
所述微不定芽诱导培养基，是通过在MS培养基中添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)、0.05mg/L萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉而得。其中MS培养基为Murashige and Skoog于1962公布。
所述经光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽，是指：培养温度为25±1℃，每天光照16小时，每14-20天继代培养一次，经过1-2次继代培养后在外植体周围长出大量微不定芽。
所述微不定芽伸长培养基为MS培养基，其中添加30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉。
所述使微不定芽伸长，是指：培养温度为25℃±1℃，每天光照16小时，经过14天-20天使微不定芽伸长。
所述不定芽生根培养基为1/2 MS培养基(即MS培养基用量的一半)，其中添加30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉。
所述产生出不定根，是指：培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过7天-14天可产生出不定根，从而形成完整的青蒿植株。
所述将生长健壮的完整植株移栽到盛有移栽基质的花盆中，是指：选取生长健壮的植株，移栽到装有移栽基质的穴盘中。
所述移栽基质为珍珠岩：泥炭，珍珠岩和泥炭的体积比为1∶1。
本发明采用微不定芽组织培养的方法，筛选出适合转基因青蒿微不定芽诱导和生根的培养基，转基因青蒿外植体微不定芽诱导率超过90％，不定芽生根率为100％，再生植株移栽存活率为100％，繁殖系数达到80-100，转基因青蒿微不定芽快速繁殖技术的建立，为快速繁殖出大量的转基因青蒿苗，对转基因青蒿的大面积推广、保障充足优质的青蒿种苗、提高青蒿素产量具有重要意义。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
转基因青蒿外植体的消毒和微不定芽的诱导
从转基因青蒿植株上剪取含有生长点的幼嫩茎段(1cm长)作为外植体。用75％酒精消毒20秒，无菌水清洗1遍，1.5％HgCl2消毒6分钟，无菌水清洗5遍。将消毒后的转基因青蒿外植体转移到微不定芽诱导培养基上，所述微不定芽诱导培养基为MS培养基+0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，每14天继代培养一次，经过1次继代培养后在外植体周围长出大量微不定芽(长度为1.5cm)。微不定芽诱导率达到91％。
转基因青蒿微不定芽的伸长和生根
将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基上，所述微不定芽伸长培养基为MS培养基+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过20天可使微不定芽伸长至5cm。切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上，所述不定芽生根培养基为1/2MS培养基+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过10天可产生出不定根，不定根的分化率为100％，从而形成完整的青蒿植株。
转基因青蒿再生植株的移栽
选取生长健壮的植株，洗去根部的培养基，移栽到装有移栽基质的穴盘中，所述移栽基质中的成分为珍珠岩和泥炭，其比例为1∶1。通过驯化1周，可获得大量生长正常的转基因青蒿植株，移栽存活率为100％。繁殖系数达到80。
实施例2
转基因青蒿外植体的消毒和微不定芽的诱导
从转基因青蒿植株上剪取含有生长点的幼嫩茎段(1.5cm长)作为外植体。用75％酒精消毒20秒，无菌水清洗1遍，1.5％HgCl2消毒6分钟，无菌水清洗5遍。将消毒后的转基因青蒿外植体转移到微不定芽诱导培养基上，所述微不定芽诱导培养基为MS培养基+0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，每14天继代培养一次，经过1次继代培养后在外植体周围长出大量微不定芽(长度为1.5cm)。微不定芽诱导率达到94％。
转基因青蒿微不定芽的伸长和生根
将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基上，所述微不定芽伸长培养基为MS培养基+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过20天可使微不定芽伸长至5cm。切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上，所述不定芽生根培养基为1/2 MS培养基+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过10天可产生出不定根，不定根的分化率为100％，从而形成完整的青蒿植株。
转基因青蒿再生植株的移栽
选取生长健壮的植株，洗去根部的培养基，移栽到装有移栽基质的穴盘中，所述移栽基质中的成分为珍珠岩和泥炭，其比例为1∶1。通过驯化1周，可获得大量生长正常的转基因青蒿植株，移栽存活率为100％。繁殖系数达到90。
实施例3
转基因青蒿外植体的消毒和微不定芽的诱导
从转基因青蒿植株上剪取含有生长点的幼嫩茎段(2cm长)作为外植体。用75％酒精消毒20秒，无菌水清洗1遍，1.5％HgCl2消毒6分钟，无菌水清洗5遍。将消毒后的转基因青蒿外植体转移到微不定芽诱导培养基上，所述微不定芽诱导培养基为MS培养基+0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.05mg/L萘乙酸(NAA)+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，每20天继代培养一次，经过1次继代培养后在外植体周围长出大量微不定芽(长度为1.5cm)。微不定芽诱导率达到98％。
转基因青蒿微不定芽的伸长和生根
将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基上，所述微不定芽伸长培养基为MS培养基+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过20天可使微不定芽伸长至5cm。切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上，所述不定芽生根培养基为1/2 MS培养基+3％蔗糖+0.65％琼脂粉。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过10天可产生出不定根，不定根的分化率为100％，从而形成完整的青蒿植株。
转基因青蒿再生植株的移栽
选取生长健壮的植株，洗去根部的培养基，移栽到装有移栽基质的穴盘中，所述移栽基质中的成分为珍珠岩和泥炭，其比例为1∶1。通过驯化1周，可获得大量生长正常的转基因青蒿植株，移栽存活率为100％。繁殖系数达到100。
上述实施例可以快速繁殖出大量的转基因青蒿植株，对于转基因青蒿的大面积推广、保障充足优质的青蒿种苗、提高青蒿素产量具有重要意义。
Claims (7)
1.一种采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，其特征在于，将转基因青蒿外植体经过消毒后，置于微不定芽诱导培养基上，经光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽，将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基上，使微不定芽伸长，切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上，产生出不定根，将生长健壮的完整植株移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化获得生长正常的转基因青蒿植株；
所述的转基因青蒿外植体为含有生长点的幼嫩茎段；
所述微不定芽诱导培养基为MS培养基，其中添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉；
所述微不定芽伸长培养基为MS培养基，其中添加30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉；
所述不定芽生根培养基为1/2MS培养基，其中添加30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉；
所述移栽基质为珍珠岩：泥炭，珍珠岩和泥炭的体积比为1∶1。
2.根据权利要求1所述采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，其特征是，所述转基因青蒿外植体的消毒，是指：从转基因青蒿植株上剪取外植体，用酒精消毒，无菌水清洗，再HgCl2消毒，无菌水清洗。
3.根据权利要求2所述采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，其特征是，用75％酒精消毒20秒，无菌水清洗1遍，再1.5％HgCl2消毒6分钟，无菌水清洗5遍。
4.根据权利要求1或2所述采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，其特征是，所述的幼嫩茎段的长度为1cm-2cm。
5.根据权利要求1所述采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，其特征是，所述经光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽，是指：培养温度为25℃±1℃，每天光照16小时，每14天-20天继代培养一次，经过1次继代培养后在外植体周围长出大量微不定芽。
6.根据权利要求1所述采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，其特征是，所述使微不定芽伸长，是指：培养温度为25℃±1℃，每天光照16小时，经过20天使微不定芽伸长。
7.根据权利要求1所述采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，其特征是，所述产生出不定根，是指：培养温度为25℃±1℃，每天光照16小时，经过10天产生出不定根。
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