CN102524072B - 用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，是先配制冰片母液；再于MS固态培养基或MS液态培养基中加入冰片母液制成含冰片的固态MS培养基或液态MS培养基；然后将黄花蒿无菌芽头在该固态MS培养基上培养，或者将黄花蒿枝条在该液态MS培养基中浸泡后扦插在营养土中培养。本发明通过冰片处理黄花蒿枝条，能有效地提高不定根的发生频率和单株黄花蒿不定根的数量，操作简单，不使用激素，安全无残留，无环境污染，有效降低黄花蒿无性繁殖的生产成本，提高黄花蒿无性繁殖速度和效率，对大面积推广高产黄花蒿优异种质资源有重要意义。
Description
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种用冰片(borneol)高效诱导黄花蒿产生不定根方法。
背景技术：
青蒿素是具有我国自主知识产权的化合物实体，是我国学者首次从黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离得到的一种倍半萜内酯过氧化物，目前是治疗疟疾的特效药。随着近年疟疾发病率的逐年增长，青蒿素的国际市场需求量呈日益增长的趋势。进一步的药理研究证明，青蒿素及其类似物对多种肿瘤细胞具有毒性作用，包括乳腺癌细胞、血癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞、中枢神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞等，而对正常细胞损伤很小，并且与传统化疗药物不存在交叉耐药性。因此，青蒿素及其类似物有望被开发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药，具有广泛的应用前景，从而导致青蒿素的市场进一步扩大，青蒿素的需求量将进一步上升。
然而，目前药用青蒿素均是从黄花蒿植株中提取分离而得。由于黄花蒿中青蒿素含量非常低（0.01%-0.8%），导致青蒿素的生产成本过高。虽然现在已经能够人合成青蒿素，但由于难度大、产量、成本高，不具备商业化生产的可能性。利用组织培养及基因工程技术来获得青蒿素含量较高的青蒿素新品种是一种很有吸引力的方法，但生根频率非常低一直制约黄花蒿组织培养以及转基因成功的瓶颈问题。此外，由于黄花蒿具有自交不亲和性，因此，无性繁殖是保持优异种质的最有效的手段。但在采用侧枝扦插的方式进行黄花蒿优良品种无性繁殖时，也存在生根率低、成活率不高的问题。因此，如何高效诱导黄花蒿产生不定根是目前青蒿素生产中急需解决的重大技术问题。虽然，通过生长素如IBA或NAA，可在一定程度上促进黄花蒿不定根的形成，但生根时间长、生根率低，无法满足生产需求，并且过量使用人工合成激素，一方面会导致生产成本高，另外一方面产生残留、污染环境。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，利用冰片处理黄花蒿，诱导其产生不定根，有效提高了黄花蒿不定根的产生，不但提高生根率，而且还提高单株不定根的数量，缩短了生根的时间。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，该方法是先将冰片溶解于二甲基亚砜中，配制成100g/L的冰片母液；再于MS固态培养基中于凝固前加入冰片母液制成含2-6mg/L冰片的固态MS培养基；然后将黄花蒿无菌芽头在该固态MS培养基上培养3-5周，培养条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600-3000 lx光照，温度24-26℃，相对湿度60-70%；上述冰片和二甲基亚砜皆为分析纯。
上述黄花蒿无菌芽头是将黄花蒿种子加入质量浓度为0.5-1%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒18-20min，次氯酸钠溶液以淹盖住种子为宜，并滴加吐温20，使吐温20体积终浓度为0.01%，浸泡过程中不断晃动，然后取出种子，用无菌水冲洗4次后移至1/2MS固态培养基中，1周后转置MS固态培养基上培养5周得到，种子在1/2MS固态培养基和MS固态培养基上培养的条件为：每天 16h光照，8h黑暗，2600-3000 lx光照，温度24-26℃，相对湿度60-70%。
上述黄花蒿无菌芽头也可以是将黄花蒿芽头加入质量浓度为0.5-1%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒18-20min，次氯酸钠溶液以淹盖住芽头为宜，并滴加吐温20，使吐温20体积终浓度为0.01%，浸泡过程中不断晃动，然后取出芽头，用无菌水冲洗4次后，在无菌条件下，将消毒后的芽头保留3-4cm得到。
本发明采用的另一种技术方案是：一种用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，该方法是先将冰片溶解于二甲基亚砜中，配制成100g/L的冰片母液；再于MS液态培养基中加入冰片母液制成含80-110mg/L冰片的液态MS培养基；然后将黄花蒿枝条在上述液态MS培养基中浸泡10-20min之后扦插在营养土中培养2-4周，培养条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600-3000 lx光照，温度24-26℃，相对湿度60-70%。
上述黄花蒿枝条是选取生长旺盛的黄花蒿主枝或侧枝，倾斜剪切成15-30cm的黄花蒿枝条。
上述提及的冰片和二甲基亚砜（DMSO）为市售产品；所述的冰片分子式 为C10H18O，又名龙脑、2-莰醇。
所述的MS固态培养基是植物组织培养用的标准MS培养基，并经过高温灭菌（120℃，20min），在凝固前加入冰片母液配成含相应浓度冰片的固态MS培养基；所述的MS液态培养基也是植物组织培养用的标准MS液态培养基，不需要灭菌。所述的1/2MS固态培养基是现有常用培养基。
如此，本发明利用冰片处理黄花蒿，诱导其产生不定根，能有效地提高黄花蒿组培苗不定根的发生率和单株黄花蒿不定根的数量，且根系发育良好，移栽成活率高，且操作简单，不使用激素，安全无残留，无环境污染，有效降低黄花蒿无性繁殖的生产成本，提高黄花蒿无性繁殖速度和效率。为大量生产黄花蒿组培再生植株以及黄花蒿的扦插繁殖奠定了坚实的基础，对大面积推广高产黄花蒿优异种质资源具有重要意义，同时对其他难生根的植物组培苗的培养也具有重要参考价值。
附图说明：
图1是采用本发明方法诱导黄花蒿枝条产生的不定根图一。
图2是采用本发明方法诱导黄花蒿无菌芽头产生的不定根的图二。
具体实施方式：
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1：
将黄花蒿种子置于1.5mL离心管中，加入质量浓度为0.5%的次氯酸钠溶液浸泡消毒20min，次氯酸钠溶液以淹盖住种子为宜，并滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.01%（体积浓度），浸泡过程中不断晃动，然后倒掉次氯酸钠溶液，将种子用无菌水冲洗4次，将无菌种子转移至1/2MS固态培养基，1周后转置MS固态培养基上继续培养5周，取生长出的芽头转置含2mg/L冰片的固态MS培养基上诱导生根。结合参见图2，4周后96%的芽头生根，继续在该固态MS培养基上培养1周，将生根的黄花蒿苗移栽至土壤中，2周后97%的移栽苗成活。培养条件均为：每天 16h光照，8h黑暗，2600～3000 lx光照，温度24～26℃，相对湿度60～70%。
实施例2：
将黄花蒿种子置于1.5mL离心管中，加入质量浓度为1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒18min，次氯酸钠溶液以淹盖住种子为宜，并滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.01%（体积浓度），浸泡过程中不断晃动，然后倒掉次氯酸钠溶液，将种子用无菌水冲洗4次，将无菌种子转移至1/2MS固态培养基，1周后转置MS固态培养基上培养5周，取长出的芽头转置含4mg/L冰片的固态MS培养基上诱导生根。2周后93%以上的芽头生根，继续在该固态MS培养基上培养1周，将生根的黄花蒿苗移栽至土壤中，2周后98%的移栽苗成活。培养条件均为：每天 16h光照，8h黑暗，2600～3000 lx光照，温度24～26℃，相对湿度60～70%。
实施例3：
将黄花蒿种子播种于土壤中，定期浇水，进行常规的田间管，2个月后将黄花蒿芽头剪切下来，加入质量浓度为0.8%的次氯酸钠溶液浸泡消毒19min，次氯酸钠溶液以淹盖住芽头为宜，并滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.01%（体积浓度），浸泡过程中不断晃动，然后取出芽头，用无菌水冲洗4次，在无菌条件下，将消毒后的芽头的下端切去一部分，保留3-4cm，然后转至含6mg/L冰片的固态MS培养基上诱导生根。4周后97%的芽头生根，继续在该固态MS培养基上培养1周后移栽至土壤中，2周后97%的移栽苗成活。芽头在固态MS培养基上培养的条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600～3000 lx光照，温度24～26℃，相对湿度60～70%。
实施例4：
将黄花蒿种子置于1.5mL离心管中，加入质量浓度为0.5%的次氯酸钠溶液浸泡消毒20min，次氯酸钠溶液以淹盖住种子为宜，并滴加吐温20，使吐温20终浓度为0.01%（体积浓度），浸泡过程中不断晃动，然后倒掉次氯酸钠溶液，将种子用无菌水冲洗4次后转移至1/2MS固态培养基，1周后转置MS固态培养基上继续培养5周，从黄花蒿植株中选取生长旺盛的主枝或侧枝，倾斜剪切成15-30cm黄花蒿枝条，浸泡在含80mg/ml冰片的液体MS培养基中20min，扦插上述冰片处理后的黄花蒿枝条于营养土中，并进行生根期间的温度、湿度和营养管理（生根期间的温度、湿度和营养管理为现有常用技术，在此不再赘述）。3周后96%的扦插枝条生根，将已生根的侧枝移栽至大田，移栽后定期浇水，进行常规的田间管理，2周后100%的移栽苗成活。培养条件均为：每天 16h光照，8h黑暗，2600～3000 lx光照，温度24～26℃，相对湿度60～70%。
实施例5：
将黄花蒿种子播种于土壤中，2月后从黄花蒿植株中选取生长旺盛的主枝或侧枝，倾斜剪切成15-30cm黄花蒿枝条，浸泡在含100mg/ml冰片的液体MS培养基中15min，扦插上述冰片处理后的黄花蒿枝条于营养土中，并进行生根期间的温度、湿度和营养管理。结合参见图1，2周后98%的枝条生根，将已生根的侧枝移栽至大田，移栽后定期浇水，进行常规的田间管理，2周后100%的移栽苗成活。冰片处理后的黄花蒿枝条扦插在营养土中的培养条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600～3000 lx光照，温度24～26℃，相对湿度60～70%。
实施例6：
将黄花蒿种子播种于土壤中，2月后从黄花蒿植株中选取生长旺盛的主枝或侧枝，倾斜剪切成15-30cm黄花蒿枝条，浸泡在含110mg/ml冰片的MS液体培养基中10 min，扦插上述冰片处理后的黄花蒿枝条于营养土中，并进行生根期间的温度、湿度和营养管理。4周后98%的枝条生根，将已生根的侧枝移栽至大田，移栽后定期浇水，进行常规的田间管理，2周后100%的移栽苗成活。冰片处理后的黄花蒿枝条扦插在营养土中的培养条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600～3000 lx光照，温度24～26℃，相对湿度60～70%。
Claims (5)
1.一种用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，其特征在于：该方法是先将冰片溶解于二甲基亚砜中，配制成100g/L的冰片母液；再于MS固态培养基中于凝固前加入冰片母液制成含2-6mg/L冰片的固态MS培养基；然后将黄花蒿无菌芽头在该固态MS培养基上培养3-5周，培养条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600-3000 lx光照，温度24-26℃，相对湿度60-70%；上述冰片和二甲基亚砜皆为分析纯。
2.如权利要求1所述的用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，其特征在于：所述黄花蒿无菌芽头是将黄花蒿种子加入质量浓度为0.5-1%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒18-20min，次氯酸钠溶液以淹盖住种子为宜，并滴加吐温20，使吐温20体积终浓度为0.01%，浸泡过程中不断晃动，然后取出种子，用无菌水冲洗4次后移至1/2MS固态培养基中，1周后转置MS固态培养基上继续培养5周得到，种子在1/2MS固态培养基和MS固态培养基上培养的条件为：每天 16h光照，8h黑暗，2600-3000lx光照，温度24-26℃，相对湿度60-70%。
3.如权利要求1所述的用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，其特征在于：所述黄花蒿无菌芽头是将黄花蒿芽头加入质量浓度为0.5-1%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒18-20min，次氯酸钠溶液以淹盖住芽头为宜，并滴加吐温20，使吐温20体积终浓度为0.01%，浸泡过程中不断晃动，然后取出芽头，用无菌水冲洗4次后，在无菌条件下，将消毒后的芽头保留3-4cm，即得。
4.一种用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，其特征在于：该方法是先将冰片溶解于二甲基亚砜中，配制成100g/L的冰片母液；再于MS液态培养基中加入冰片母液制成含80-110mg/L冰片的液态MS培养基；然后将黄花蒿枝条在上述液态MS培养基中浸泡10-20min之后扦插在营养土中培养2-4周，培养条件：每天 16h光照，8h黑暗，2600-3000lx光照，温度24-26℃，相对湿度60-70%。
5.如权利要求4所述的用冰片高效诱导黄花蒿形成不定根的方法，其特征在于：所述黄花蒿枝条是选取生长旺盛的黄花蒿主枝或侧枝，倾斜剪切成15-30cm的黄花蒿枝条。
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Patent Citations (3)
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| "黄花蒿组培快繁与种质离体保存的研究";唐凤鸾等;《热带亚热带植物学报》;20081231;第16卷(第5期);第486-490页 * |
| "黄花蒿组织培养研究";贾秀山等;《生物技术通讯》;20080331;第19卷(第2期);第259-262页 * |
| 唐凤鸾等."黄花蒿组培快繁与种质离体保存的研究".《热带亚热带植物学报》.2008,第16卷(第5期),第486-490页. |
| 贾秀山等."黄花蒿组织培养研究".《生物技术通讯》.2008,第19卷(第2期),第259-262页. |
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