CN1328951C - 石斛原球茎无激素培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及石斛原球茎无激素培养方法。其特点是：包括取石斛种子无菌试管苗诱导、原球茎诱导、原球茎驯化和原球茎繁殖和多糖合成调节四个主要工艺环节。采用本发明方法生产的霍山石斛原球茎生物量达到744.8gl^-1，增殖倍数为5.65，活性多糖产率达到13500mgl^-1。药理学实验证明采用本发明方法培养获得的多糖能显著促进昆明小白鼠脾细胞和巨噬细胞分别产生细胞干扰素(IFNγ)和肿瘤坏死因子(TNFα)，在细胞培养液中各自含量达到790.1pgml^-1和542.9pgml^-1，与野生霍山石斛多糖活性相当。本发明的方法操作方便，易于工业化大规模生产，对保存名贵珍稀药用植物资源和实现可持续开发具有重大的现实意义。

Description

石斛原球茎无激素培养方法

技术领域

本发明涉及中草药石斛的培养方法。

背景技术

药用石斛(Dendrobium)作为一种名贵中草药，最早见于《神农本草经》，具有除弊下气，补五脏虚劳赢瘦，强阴滋精之功效，被誉为“中华九大鲜草之首”，《本草衍义》、《本草纲目》及《本草纲目拾遗》等历代本草也倍加推崇，素有“千斤草”之称，驰名中外，被药用植物界称为药界“大熊猫”。在临床及中药复方中被广泛使用，含有石斛多糖、生物碱等多种活性成分，现代药理研究表明，药用石斛对增强机体免疫力、抑制肿瘤生长具有显著疗效。

一直以来，市场上流通的石斛主要是以采集野生为主，产量日益减少，加之生态条件特殊，环境日趋恶化，导致石斛资源越来越少，许多品种如霍山石斛等已濒临灭绝，难以满足市场的需求，据统计霍山石斛(Dendrobium huoshanense)在其主产地霍山县每年干货重量不到1kg，因此保存珍稀名贵药用霍山石斛资源，并实现其可持续开发利用拯待解决。

当前，对包括霍山石斛在内的药用石斛的研究主要集中在试管苗组织快繁上，然而石斛试管苗生长周期长，一般需要8个月左右，另一方面移栽成功率低的问题一直没有得到很好的解决，严重制约了现代中药企业的发展。

发明内容

本发明的目的是：提供一种生长周期短的、易于工业化大规模生产的石斛原球茎无激素培养方法。

实现上述发明目的的具体技术方案如下：

1、石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于：

A、无菌试管苗诱导：取石斛种子，在固体MS培养基上、温度25±2℃下光照诱导7个月，光照条件为30umol m^-2s^-1、16h/天，得无菌试管苗；

B、原球茎诱导：取无菌试管苗茎段外殖体，在固体MS培养基上、温度25±2℃下光照培养20天，光照条件为30umol m^-2s^-1、16h/天，得原球茎；

C、原球茎驯化：将诱导出的原球茎，在温度25±2℃、无激素MS培养基条件下，经16次继代培养脱激素，每代生长周期为30天，且为暗培养，所述暗培养是指无光照培养；

D、原球茎繁殖和多糖合成调节：将暗培养获得的原球茎，在最优生长培养基上、温度25±2℃、30umol m^-2s^-1、16h/天下光照培养30天后，在培养基上补加70g·L^-1的蔗糖调节多糖合成，继续培养6天，即可收获原球茎。

2、根据上述1所述的石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于：所述固体MS培养基：由1900mg·L^-1硝酸钾、1650mg·L^-1硝酸胺、170mg·L^-1磷酸二氢钾、370mg·L^-1七水合硫酸镁、332.25mg·L^-1氯化钙、16.9mg·L^-1一水合硫酸锰、8.6mg·L^-1七水合硫酸锌、6.2mg·L^-1硼酸、0.83mg·L^-1碘化钾、0.25mg·L^-1钼酸钠、0.025mg·L^-1五水合硫酸铜、0.025mg·L^-1氯化钴、27.85mg·L^-1七水合硫酸亚铁、37.25mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、2.0mg·L^-1甘氨酸、0.1mg·L^-1维生素B1、0.5mg·L^-1维生素B6、0.5mg·L^-1烟酸、100mg·L^-1肌醇、30g·L^-1蔗糖混合组成。

3、根据上述1所述的石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于：所述最优生长培养基：由35g·L^-1蔗糖、3030mg·L^-1硝酸钾、1.0mg·L^-1维生素B1、50mg·L^-1肌醇、499.5mg·L^-1氯化钙、370mg·L^-1七水合硫酸镁、27.85mg·L^-1七水合硫酸亚铁、17.25mg·L^-1七水合硫酸锌和84.5mg·L^-1一水合硫酸锰、85mg·L^-1磷酸二氢钾、3.1mg·L^-1硼酸、0.42mg·L^-1碘化钾、0.13mg·L^-1钼酸钠、0.013mg·L^-1五水合硫酸铜、0.013mg·L^-1氯化钴、18.63mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、1.0mg·L^-1甘氨酸、0.25mg·L^-1维生素B6、0.25mg·L^-1烟酸、50mg·L^-1肌醇混合组成。

4、根据上述1所述的石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于：

A、取石斛种子经1％的次氯酸钠溶液灭菌后，无菌双重蒸馏水冲洗，接种于盛20ml固体MS培养基的100ml三角瓶中，在温度25±2℃下光照诱导7个月，光照条件为30umol m^-2s^-1、16h/天，获得4-6cm长的无菌试管苗；

B、无菌试管苗培养，取无菌试管苗茎段外殖体2-3cm，即从无菌试管苗上截取2-3的茎，接种于附加1.4mg·L^-1萘乙酸NAA和0.1mg·L^-1激动素KT的固体MS培养基上，在温度25±2℃下，光照诱导20天，光照条件为30umol m^-2s^-1、16h/天，获得原球茎；

C、原球茎驯化，将诱导出的原球茎，在温度25±2℃、无激素MS培养基条件下，经16次继代培养脱激素，每代生长周期为30天，且为暗培养，即无光照培养；

D、原球茎繁殖和多糖合成调节，将暗培养获得的原球茎，在最优生长培养基上、温度25±2℃、30umol m^-2s^-1、16h/天下光照培养30天后，在培养基上补加70g·L^-1的蔗糖调节多糖合成，继续培养6天，即可收获原球茎。

本发明的有益技术效果体现在几个方面：

1、本发明中的原球茎实质上是体细胞胚，是试管苗生长发育的必经阶段，具有成熟植株相同的生长发育潜能。石斛原球茎的生长周期仅为1个月左右，大大缩短了生长周期，且活性多糖含量与试管苗中相当。

2、本发明成功诱导出能长期保存的石斛原球茎；根据研究发现的原球茎生长与多糖合成间的反相关系，建立石斛原球茎二步培养法(原球茎生长和多糖合成两个培养阶段)；利用无激素培养技术大量培养霍山石斛原球茎，解决霍山石斛种质资源保存和资源紧缺并实现其可持续开发问题，在国内外均属首次，打破了以往成规的以试管苗快繁为主体的研究思想，大大缩短了生长周期；利用原球茎能快速增殖的特点，建立的无激素培养体系，在短时间内能提供大量的目的原材料。

3、利用霍山石斛原球茎繁殖速度快、生长周期短的特点发明的无激素培养方法，原球茎生物量达到744.8g·L^-1，增殖倍数为5.65，活性多糖产率达到13500mg·L^-1。药理学实验证明采用本发明方法获得的多糖能显著促进昆明小白鼠脾细胞和巨噬细胞分别产生细胞干扰素(IFNγ)和肿瘤坏死因子(TNFα)，在细胞培养液中各自含量达到790.1pg ml^-1和542.9pg ml^-1，与野生霍山石斛多糖活性相当。

4、外源激素不利于人的健康，本发明的无激素培养方法在一定程度上不仅给中药生产企业解决了脱激素困难的问题，避免了由于长期使用外源激素而导致的品种变异的缺陷，以及生态条件如气候、土壤、季节及病虫害等因素对石斛生长的影响。

5、节省了试管苗培育和移栽过程中的大量人力和物力，而且不存在化肥、农药及其它环境有害物质的污染，解决了中药安全问题。

6、本发明的方法操作方便，易于工业化大规模生产，对保存名贵珍稀药用植物资源和实现可持续开发具有重大的现实意义。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。

实施例：

下面以野生霍山石斛为例，说明本发明的培养方法。

取野生霍山石斛种子(采自安徽省霍山县大别山区)经1％的次氯酸钠溶液灭菌60min后，无菌双重蒸馏水冲洗3遍，接种于盛20ml固体MS培养基的100ml三角瓶中，于25±2℃下光照，光照条件为30umol m^-2s^-1、16h/天，诱导7个月后获得4-6cm长的无菌试管苗。固体MS培养基由下述成分组成：1900mg·L^-1硝酸钾、1650mg·L^-1硝酸胺、170mg·L^-1磷酸二氢钾、370mg·L^-1七水合硫酸镁、332.25mg·L^-1氯化钙、16.9mg·L^-1一水合硫酸锰、8.6mg·L^-1七水合硫酸锌、6.2mg·L^-1硼酸、0.83mg·L^-1碘化钾、0.25mg·L^-1钼酸钠、0.025mg·L^-1五水合硫酸铜、0.025mg·L^-1氯化钴、27.85mg·L ^-1七水合硫酸亚铁、37.25mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、2.0mg·L^-1甘氨酸、0.1mg·L^-1维生素B1、0.5mg·L^-1维生素B6、0.5mg·L^-1烟酸、100mg·L^-1肌醇、30g·L^-1蔗糖。

取2-3cm无菌试管苗茎段外殖体接种于附加萘乙酸NAA(1.4mg·L^-1)和激动素KT(0.1mg·L^-1)的固体MS培养基上，于25±2℃下光照，光照条件为30umol m^-2s^-1、16h/天，诱导20天后获得原球茎，诱导率达到81％。

诱导出的原球茎在无激素MS培养基上经16次继代培养脱激素后，生长处于稳定状态(基本无分化苗)，取生长旺盛的原球茎用于培养，在原球茎生长和多糖合成的动力学考察的基础上优化培养基。每代生长周期为30天，暗培养，所述暗培养是指无光照培养。

取生长旺盛的原球茎在最优生长培养基上，25±2℃下光照，光照条件为30umolm^-2s^-1、16h/天，培养30天后，补加70g·L^-1的蔗糖调节多糖合成，继续培养6天收获原球茎。最优生长培养基由下述成分混合组成：35g·L^-1蔗糖、3030mg·L^-1硝酸钾、1.0mg·L^-1维生素B1、50mg·L^-1肌醇、499.5mg·L^-1氯化钙、370mg·L^-1七水合硫酸镁、27.85mg·L^-1七水合硫酸亚铁、17.25mg·L^-1七水合硫酸锌和84.5mg·L^-1一水合硫酸锰、85mg·L^-1磷酸二氢钾、3.1mg·L^-1硼酸、0.42mg·L^-1碘化钾、0.13mg·L^-1钼酸钠、0.013mg·L^-1五水合硫酸铜、0.013mg·L^-1氯化钴、18.63mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、1.0mg·L^-1甘氨酸、0.25mg·L^-1维生素B6、0.25mg·L^-1烟酸、50mg·L^-1肌醇。

收获的原球茎既可用于试管苗繁殖，制作人工种子，进行种间杂交选育新品种，又可为中药生产企业提供原材料、直接提取活性成分如活性多糖等进行中药生产，进而实现名贵珍稀石斛资源的保存和可持续开发。

Claims (3)

1、石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于：

A、无菌试管苗诱导：取石斛种子，在固体MS培养基上、温度25±2℃下光照诱导7个月，光照条件为30umolm^-2s^-1、16h/天，得无菌试管苗；

B、原球茎诱导：取无菌试管苗茎段外殖体，在附加1.4mg·L^-1萘乙酸NAA和0.1mg·L^-1激动素KT的固体MS培养基上、温度25±2℃下光照培养20天，光照条件为30umolm^-2s^-1、16h/天，得原球茎；

C、原球茎驯化：将诱导出的原球茎，在温度25±2℃、无激素MS培养基条件下，经16次继代培养脱激素，每代生长周期为30天，且为暗培养，所述暗培养是指无光照培养；

D、原球茎繁殖和多糖合成调节：将暗培养获得的原球茎，在生长培养基上、温度25±2℃、30umolm^-2s^-1、16h/天，光照培养30天后，在培养基上补加70g·L^-1的蔗糖，调节多糖合成，继续培养6天，收获原球茎；

所述生长培养基：由35g·L^-1蔗糖、3030mg·L^-1硝酸钾、1.0mg·L^-1维生素B₁、50mg·L^-1肌醇、499.5mg·L^-1氯化钙、370mg·L^-1七水合硫酸镁、27.85mg·L^-1七水合硫酸亚铁、17.25mg·L^-1七水合硫酸锌、84.5mg·L^-1一水合硫酸锰、85mg·L^-1磷酸二氢钾、3.1mg·L^-1硼酸、0.42mg·L^-1碘化钾、0.13mg·L^-1钼酸钠、0.013mg·L^-1五水合硫酸铜、0.013mg·L^-1氯化钴、18.63mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、1.0mg·L^-1甘氨酸、0.25mg·L^-1维生素B6、0.25mg·L^-1烟酸和50mg·L^-1肌醇组成。

2、根据权利要求1所述的石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于：所述固体MS培养基：由1900mg·L^-1硝酸钾、1650mg·L^-1硝酸胺、170mg·L^-1磷酸二氢钾、370mg·L^-1七水合硫酸镁、332.25mg·L^-1氯化钙、16.9mg·L^-1一水合硫酸锰、8.6mg·L^-1七水合硫酸锌、6.2mg·L^-1硼酸、0.83mg·L^-1碘化钾、0.25mg·L^-1钼酸钠、0.025mg·L^-1五水合硫酸铜、0.025mg·L^-1氯化钴、27.85mg·L^-1七水合硫酸亚铁、37.25mg·L^-1乙二胺四乙酸二钠、2.0mg·L^-1甘氨酸、0.1mg·L^-1维生素B1、0.5mg·L^-1维生素B6、0.5mg·L^-1烟酸、100mg·L^-1肌醇和30g·L^-1蔗糖组成。

3、根据权利要求1所述的石斛原球茎无激素培养方法，其特征在于：

A步骤的操作方法是：取石斛种子经1％的次氯酸钠溶液灭菌后，无菌双重蒸馏水冲洗，接种于盛有20ml固体MS培养基的100ml三角瓶中，在温度25±2℃下光照诱导7个月，光照条件为30umolm^-2s^-1、16h/天，获得4-6cm长的无菌试管苗；

B步骤的操作方法是：取无菌试管苗茎段外殖体2-3cm，接种于附加1.4mg·L^-1萘乙酸NAA和0.1mg·L^-1激动素KT的固体MS培养基上，在温度25±2℃下，光照诱导20天，光照条件为30umolm^-2s^-1、16h/天，获得原球茎。