CN102948368B - 一种铁皮石斛的组织培养方法 - Google Patents

一种铁皮石斛的组织培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛的组织培养方法，包括以下步骤：首先在播种培养基中黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发25～35天后，转接入原球茎增殖培养基中增殖培养25～35天，然后依次经过原球茎分化培养基中分化培养40～50天，继代培养基中继代培养55～65天，壮苗培养基中壮苗培养55～65天和生根培养基中生根培养40～50天，本发明铁皮石斛组织培养快繁方法，可不受季节约束，全年可进行工厂化生产，且环境容易控制，铁皮石斛种子无菌萌发率高达96.8%以上；本发明提高继代增殖倍数，快速繁育大量优质种苗，并附加前体物质，有效积累铁皮石斛试管苗的石斛多糖含量。

Description

一种铁皮石斛的组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种铁皮石斛栽培方法技术，具体涉及一种铁皮石斛的组织培养方法。
背景技术
铁皮石斛是著名的石斛品种，具有独特的药用价值。秦汉时期的《神农本草经》记载铁皮石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”；现代化学和药理研究表明，铁皮石斛的主要有效成分是多糖，多糖含量高达20%～30%。因其所含的石斛多糖、生物碱、氨基酸、微量元素等成分具有增强机体的免疫能力，抗氧化，抗衰老，降低血糖，养阴生津，强肾益精，抑制肿瘤细胞，缓解体力疲劳等独特功效。但是由于野生铁皮石斛主要生长在崇山峻岭的悬崖峭壁之上，因其种子极小，每个蒴果含有大约2000粒种子，细如粉尘且无胚乳，在自然条件下萌发率极低，自然资源十分稀少。加上常年无节制采掘，野生资源日渐枯竭，自然产量不能满足目前市场需求。本申请人通过现代生物工程植物组织培养技术，实现了铁皮石斛种质资源的保护和种苗优质快繁，实现了铁皮石斛的合理生产开发应用。
目前均采用植物组织培养技术快速繁育大量优质铁皮石斛组培苗，在不同的生产阶段调整培养基的营养成分。本发明所要解决的技术问题之一是在于提供一种铁皮石斛试管苗的快速繁育方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铁皮石斛的组织培养方法。
本发明采用如下技术方案：
铁皮石斛的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）、播种：选取4-6个月龄的饱满蒴果，用75%酒精进行表面消毒后，将其种子均匀洒在播种培养基上，所述的播种培养基配方为：1/2MS+白糖2%+马铃薯汁15%，黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发25～35天后，即可转接入原球茎增殖培养基，种子萌发率可达96.30%；
（2）、原球茎增殖和分化：
将步骤（1）萌发的种子接入原球茎增殖培养基中增殖培养25～35天，所述的原球茎增殖培养基配方为：1/2MS + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L）+白糖2%+马铃薯汁10%，然后再将种子接入原球茎分化培养基中分化培养40～50天，所述的原球茎分化培养基的配方为：1/2MS + 6-BA（0.2-0.5mg/L）+ 萘乙酸（0.2-0.5mg/L）+白糖2%+马铃薯汁10%；
（3）、继代培养：
将步骤（2）分化培养后的原球茎转入继代培养基中继代培养55～65天，所述的继代培养基的配方为：B5培养基+ 萘乙酸（0.5-1.0mg/L）+白糖2%；
（4）、壮苗生根培养：
将步骤（3）继代培养后小苗接入壮苗培养基中壮苗培养55～65天，所述的壮苗培养基的配方为：B5培养基+ 萘乙酸（05-1.5mg/L）+白糖2%；然后再接入生根培养基中生根培养40～50天得到壮苗，所述的生根培养基的配方为：1/2MS +萘乙酸（05-1.5mg/L）+白糖2%。
所述的所有培养基均附加活性炭0.5‰，pH值调为6.1-6.5，培养条件控制为光照（2000-3000lux，10-12h/d）、温度25±2℃、湿度60-80%。
所述的MS培养基的配方（mg/L）为：KNO3   1900；NH4NO3  1650；KH2PO4   170；MgSO4·7H2O  370；CaCl2·2 H2O  440；KI  0.83；H3BO3   6.20；MnSO4·4H2O   22.3；ZnSO4·7H2O  8.60；Na2MoO4·2 H2O   0.25；CuSO4·5 H2O   0.025；CoCl2·6 H2O   0.025；Na2·EDTA·2 H2O   37.30；FeSO4·7 H2O   27.80；肌醇  100；甘氨酸  2.00；盐酸硫胺素 0.10；盐酸吡哆醇0.50和烟酸0.50。
所述的B5培养基的配方（mg/L）为：KNO3   2500；(NH4)2SO4    134；NaH2PO4·H2O   150；MgSO4·7 H2O   250；CaCl2·2 H2O   150；KI  0.75；H3BO3 -  3.0；MnSO4·4 H2O   10；ZnSO4·7H2O   2.0；Na2MoO4·2 H2O   0.25；CuSO4·5 H2O  0.025；CoCl2·6 H2O  0.025；Na2·EDTA·2 H2O  37.3；FeSO4·7 H2O   27.8；肌醇 100；甘氨酸 2；盐酸硫胺素 0.1；盐酸吡哆醇 0.5和烟酸 0.5。
本发明的有益效果：
1、上述铁皮石斛组织培养快繁方法，可不受季节约束，全年可进行工厂化生产，且环境容易控制。
2、解决了铁皮石斛品种易退化和变异、种苗参差不齐等问题，生产的铁皮石斛试管苗品质较高，性状优良，一致性好，具有广阔的市场前景。
3、使铁皮石斛种子无菌萌发率高达96.8%以上。
4、提高继代增殖倍数，快速繁育大量优质种苗，并附加前体物质，有效积累铁皮石斛试管苗的石斛多糖含量，显著提高了铁皮石斛试管苗的质量，同时将试管苗的生长周期从原来的18个月缩短至15个月。
具体实施方式
实施例1：铁皮石斛的组织培养方法，包括以下步骤：
（1）、播种：选取4-6个月龄的饱满蒴果，用75%酒精进行表面消毒后，将其种子均匀洒在播种培养基上，所述的播种培养基配方为：1/2MS+白糖2%+马铃薯汁15%，黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发25～35天后，即可转接入原球茎增殖培养基，种子萌发率可达96.30%；
（2）、原球茎增殖和分化：
将步骤（1）萌发的种子接入原球茎增殖培养基中增殖培养25～35天，所述的原球茎增殖培养基配方为：1/2MS + 萘乙酸（0.2-0.5mg/L）+白糖2%+马铃薯汁10%，然后再将种子接入原球茎分化培养基中分化培养40～50天，所述的原球茎分化培养基的配方为：1/2MS + 6-BA（0.2-0.5mg/L）+ 萘乙酸（0.2-0.5mg/L）+白糖2%+马铃薯汁10%；
（3）、继代培养：
将步骤（2）分化培养后的原球茎转入继代培养基中继代培养55～65天，所述的继代培养基的配方为：B5+ 萘乙酸（0.5-1.0mg/L）+白糖2%；
（4）、壮苗生根培养：
将步骤（3）继代培养后小苗接入壮苗培养基中壮苗培养55～65天，所述的壮苗培养基的配方为：B5+ 萘乙酸（05-1.5mg/L）+白糖2%；然后再接入生根培养基中生根培养40～50天得到壮苗，所述的生根培养基的配方为：1/2MS +萘乙酸（05-1.5mg/L）+白糖2%。
所述的所有培养基均附加活性炭0.5‰，pH值调为6.1-6.5，培养条件控制为光照（2000-3000lux，10-12h/d）、温度25±2℃、湿度60-80%。
所述的MS培养基的配方（mg/L）为：KNO3   1900；NH4NO3  1650；KH2PO4   170；MgSO4·7H2O  370；CaCl2·2 H2O  440；KI  0.83；H3BO3   6.20；MnSO4·4H2O   22.3；ZnSO4·7H2O  8.60；Na2MoO4·2 H2O   0.25；CuSO4·5 H2O   0.025；CoCl2·6 H2O   0.025；Na2·EDTA·2 H2O   37.30；FeSO4·7 H2O   27.80；肌醇  100；甘氨酸  2.00；盐酸硫胺素 0.10；盐酸吡哆醇0.50和烟酸0.50。
所述的B5培养基的配方（mg/L）为：KNO3   2500；(NH4)2SO4    134；NaH2PO4·H2O   150；MgSO4·7 H2O   250；CaCl2·2 H2O   150；KI  0.75；H3BO3 -  3.0；MnSO4·4 H2O   10；ZnSO4·7H2O   2.0；Na2MoO4·2 H2O   0.25；CuSO4·5 H2O  0.025；CoCl2·6 H2O  0.025；Na2·EDTA·2 H2O  37.3；FeSO4·7 H2O   27.8；肌醇 100；甘氨酸 2；盐酸硫胺素 0.1；盐酸吡哆醇 0.5和烟酸 0.5。
铁皮石斛种子无菌萌发率高达96.8%以上。提高继代增殖倍数，快速繁育大量优质种苗，并附加前体物质，有效积累铁皮石斛试管苗的石斛多糖含量，显著提高了铁皮石斛试管苗的质量，同时将试管苗的生长周期从原来的18个月缩短至15个月。

Claims (1)

1.一种铁皮石斛的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、播种：选取4-6个月龄的饱满蒴果，用75%酒精进行表面消毒后，将其种子均匀洒在播种培养基上，所述的播种培养基配方为：1/2MS+白糖2%+马铃薯汁15%，黑暗培养一周后转入光下培养，无菌萌发25～35天后，即可转接入原球茎增殖培养基，种子萌发率可达96.30%；
（2）、原球茎增殖和分化：
将步骤（1）萌发的种子接入原球茎增殖培养基中增殖培养25～35天，所述的原球茎增殖培养基配方为：1/2MS + 萘乙酸0.2-0.5mg/L+白糖2%+马铃薯汁10%，然后再将种子接入原球茎分化培养基中分化培养40～50天，所述的原球茎分化培养基的配方为：1/2MS + 6-BA 0.2-0.5mg/L + 萘乙酸0.2-0.5mg/L+白糖2%+马铃薯汁10%；
（3）、继代培养：
将步骤（2）分化培养后的原球茎转入继代培养基中继代培养55～65天，所述的继代培养基的配方为：B5培养基+ 萘乙酸0.5-1.0mg/L+白糖2%；
（4）、壮苗生根培养：
将步骤（3）继代培养后小苗接入壮苗培养基中壮苗培养55～65天，所述的壮苗培养基的配方为：B5培养基+ 萘乙酸0.5-1.5mg/L+白糖2%；然后再接入生根培养基中生根培养40～50天得到壮苗，所述的生根培养基的配方为：1/2MS +萘乙酸0.5-1.5mg/L+白糖2%；
所述的所有培养基均附加活性炭0.5‰，pH值调为6.1-6.5，培养条件控制为光照2000-3000lux，10-12h/d、温度25±2℃、湿度60-80%；
所述的MS培养基的配方按mg/L计为：KNO3   1900；NH4NO3  1650；KH2PO4   170；MgSO4·7H2O  370；CaCl2·2 H2O  440；KI  0.83；H3BO3   6.20；MnSO4·4H2O   22.3；ZnSO4·7H2O  8.60；Na2MoO4·2 H2O   0.25；CuSO4·5 H2O   0.025；CoCl2·6 H2O   0.025；Na2·EDTA·2 H2O   37.30；FeSO4·7 H2O   27.80；肌醇  100；甘氨酸  2.00；盐酸硫胺素 0.10；盐酸吡哆醇0.50和烟酸0.50；
    所述的B5培养基的配方按mg/L计为：KNO3   2500；(NH4)2SO4    134；NaH2PO4·H2O   150；MgSO4·7 H2O   250；CaCl2·2 H2O   150；KI  0.75；H3BO3 -  3.0；MnSO4·4 H2O   10；ZnSO4·7H2O   2.0；Na2MoO4·2 H2O   0.25；CuSO4·5 H2O  0.025；CoCl2·6 H2O  0.025；Na2·EDTA·2 H2O  37.3；FeSO4·7 H2O   27.8；肌醇 100；甘氨酸 2；盐酸硫胺素 0.1；盐酸吡哆醇 0.5和烟酸 0.5。
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