CN115804342A - 一种铁皮石斛组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组织培养技术领域，且公开了一种铁皮石斛组织培养的方法，包括以下步骤：S1、制种，根据实际生产，选择优质高产并经过鉴定及检测的“优斛”铁皮石斛果荚，然后进行人工授粉，当蒴果开始完全成熟后，选择饱满的果实采收备用。该铁皮石斛组织培养的方法，是为了解决目前市面上的铁皮石斛的组织培养快速繁殖大多都选用茎尖、新芽、休眠芽为外植体，通过拟原球茎途径培养，用无菌种子产生原球茎组培方法鲜有报道，尽管这些方法优化了传统生产的培养基成分，操作简便，生产成本低，药用成分接近野生铁皮石斛，但存在繁殖率较低，分化慢，难于进行批量生产和工厂化生产等问题。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体为一种铁皮石斛组织培养的方法。
背景技术
铁皮石斛是著名的石斛品种，具有独特的药用价值，位列中华九大仙草之首，秦汉时期的《神农本草经》记载铁皮石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”，现代化学和药理研究表明，铁皮石斛的主要有效成分是多糖，多糖含量高达20-30％，因其所含的石斛多糖、生物碱、氨基酸、微量元素等成分具有增强机体的免疫能力，抗氧化，抗衰老，降低血糖，养阴生津，强肾益精，抑制肿瘤细胞，缓解体力疲劳等独特功效，但是由于野生铁皮石斛主要生长在崇山峻岭的悬崖峭壁之上，因其种子极小，每个蒴果含有大约2000粒种子，细如粉尘且无胚乳，在自然条件下萌发率极低，自然资源十分稀少，加上常年无节制采掘，野生资源日渐枯竭，自然产量难以满足目前市场需求。
目前市面上的铁皮石斛的组织培养快速繁殖大多都选用茎尖、新芽、休眠芽为外植体，通过拟原球茎途径培养，用无菌种子产生原球茎组培方法鲜有报道，尽管这些方法优化了传统生产的培养基成分，操作简便，生产成本低，药用成分接近野生铁皮石斛，但存在繁殖率较低，分化慢，难于进行批量生产和工厂化生产等问题，故而提出一种铁皮石斛组织培养的方法来解决上述所提出的问题。
发明内容
(一)解决的技术问题
本发明的目的是为了解决目前市面上的铁皮石斛的组织培养快速繁殖大多都选用茎尖、新芽、休眠芽为外植体，通过拟原球茎途径培养，用无菌种子产生原球茎组培方法鲜有报道，尽管这些方法优化了传统生产的培养基成分，操作简便，生产成本低，药用成分接近野生铁皮石斛，但存在繁殖率较低，分化慢，难于进行批量生产和工厂化生产等问题，而提出一种铁皮石斛组织培养的方法。
(二)技术方案
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种铁皮石斛组织培养的方法，包括以下步骤：
S1、制种，根据实际生产，选择优质高产并经过鉴定及检测的“优斛”铁皮石斛果荚，然后进行人工授粉，当蒴果开始完全成熟后，选择饱满的果实采收备用；
S2、组培育苗，选取合格的铁皮石斛的蒴果，除去表面的杂物，在超净工作台上首先进行消毒处理，然后用无菌水清洗干净，再放入次氯酸钠溶液中浸泡，最后再用无菌水冲洗3次至5次，接着在超净工作台上用无菌手术刀、无菌镊子将灭菌好的蒴果剖开，将种子密封贮藏于5毫升至10毫升的无菌玻璃瓶中，每瓶保存1个蒴果的种子，将装好种子的玻璃瓶置于冰箱中保存；
S3、萌发培养，用75％酒精擦拭装有种子的玻璃瓶表面，置于超净工作台上，用无菌镊子均匀撒播于萌发培养基表面，前期暗培养7天；
S4、分化培养，培养50天-60天左右，将原球茎均匀地转接到分化培养基上；
S5、壮苗与生根培养，分化培养60天左右，转接到壮苗与生根培养基上，组培苗达到合格苗标准后，即可进行大棚炼苗马上驯化培养。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
优选地，所述步骤S1中在4月至6月对铁皮石斛果荚开花期间进行人工授粉，在人工授粉后进行挂牌标记，在10月至11月将铁皮石斛果荚储存。
优选地，所述在对铁皮石斛果荚储存时应该选取成熟果荚，铁皮石斛果荚为外种壳黄青色、完好无裂则是成熟果荚。
优选地，所述步骤S2中消毒处理为采用75％酒精浸润蒴果表面25秒至35秒，采用0.5％的次氯酸钠溶液进行浸泡，浸泡时间为10分钟至20分钟。
优选地，所述步骤S2中冰箱的温度为3至5℃，在冰箱内的保存时间为4个月至6个月。
优选地，所述步骤S3中萌发培养基的基本培养基为改良MS培养基，前期暗培养7天的条件为：培养温度为25℃±2℃下，光照强度为1000LUX至1500LUX，光照时间为10小时/天。
优选地，所述步骤S4中分化培养基的基本培养基为改良MS培养基，培养条件为：培养温度为25℃±2℃下，光照强度为2000LUX，光照时间为10小时/天。
优选地，所述步骤S5中壮苗与生根培养基为MS培养基，培养条件为：培养温度为25℃±2℃下，光照强度为2000LUX至2500LUX，光照时间为10小时/天。
(三)有益效果
与现有技术相比，本申请的技术方案具有以下有益技术效果：
1、本发明组培育苗步骤对合格的铁皮石斛的蒴果进行了全面彻底的消毒，保证种子播种后培养基不感染；
2、本发明萌发培养和分化培养步骤设定特定的培养条件，使得铁皮石斛种子的发芽率大于85％，保证品种纯正，与传统种苗扩繁相比，种苗的扩繁速度得到大幅提高,分化快，易于进行批量生产和工厂化生产；
3、本发明以萌发培养基、分化培养基和壮苗与生根培养基配合植株在种子、育苗和生根阶段的生长需求，更加有针对性，提高植物生长效率；
4、本发明只需要65天左右即可从种子阶段至生根完成，植物离开培养室，大大缩短培养室的耗电量。
附图说明
图1为本发明一种铁皮石斛组织培养的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，由图1给出，一种铁皮石斛组织培养的方法，包括以下步骤：
S1、制种，根据实际生产，选择优质高产并经过鉴定及检测的“优斛”铁皮石斛果荚，然后进行人工授粉，当蒴果开始完全成熟后，选择饱满的果实采收备用，在4月至6月对铁皮石斛果荚开花期间进行人工授粉，在人工授粉后进行挂牌标记，在10月至11月将铁皮石斛果荚储存，在对铁皮石斛果荚储存时应该选取成熟果荚，铁皮石斛果荚为外种壳黄青色、完好无裂则是成熟果荚；
S2、组培育苗，选取合格的铁皮石斛的蒴果，除去表面的杂物，在超净工作台上首先进行消毒处理，然后用无菌水清洗干净，再放入次氯酸钠溶液中浸泡，最后再用无菌水冲洗3次，接着在超净工作台上用无菌手术刀、无菌镊子将灭菌好的蒴果剖开，将种子密封贮藏于5毫升的无菌玻璃瓶中，每瓶保存1个蒴果的种子，将装好种子的玻璃瓶置于冰箱中保存，消毒处理为采用75％酒精浸润蒴果表面25秒，采用0.5％的次氯酸钠溶液进行浸泡，浸泡时间为10分钟，冰箱的温度为3℃，在冰箱内的保存时间为4个月；
S3、萌发培养，用75％酒精擦拭装有种子的玻璃瓶表面，置于超净工作台上，用无菌镊子均匀撒播于萌发培养基表面，前期暗培养7天，萌发培养基的基本培养基为改良MS培养基，前期暗培养7天的条件为：培养温度为23℃下，光照强度为1000LUX，光照时间为10小时/天；
S4、分化培养，培养50天左右，将原球茎均匀地转接到分化培养基上，分化培养基的基本培养基为改良MS培养基，培养条件为：培养温度为23℃下，光照强度为2000LUX，光照时间为10小时/天；
S5、壮苗与生根培养，分化培养60天左右，转接到壮苗与生根培养基上，组培苗达到合格苗标准后，即可进行大棚炼苗马上驯化培养，壮苗与生根培养基为MS培养基，培养条件为：培养温度为23℃下，光照强度为2000LUX，光照时间为10小时/天。
实施例2，由图1给出，一种铁皮石斛组织培养的方法，包括以下步骤：
S1、制种，根据实际生产，选择优质高产并经过鉴定及检测的“优斛”铁皮石斛果荚，然后进行人工授粉，当蒴果开始完全成熟后，选择饱满的果实采收备用，在4月至6月对铁皮石斛果荚开花期间进行人工授粉，在人工授粉后进行挂牌标记，在10月至11月将铁皮石斛果荚储存，在对铁皮石斛果荚储存时应该选取成熟果荚，铁皮石斛果荚为外种壳黄青色、完好无裂则是成熟果荚；
S2、组培育苗，选取合格的铁皮石斛的蒴果，除去表面的杂物，在超净工作台上首先进行消毒处理，然后用无菌水清洗干净，再放入次氯酸钠溶液中浸泡，最后再用无菌水冲洗5次，接着在超净工作台上用无菌手术刀、无菌镊子将灭菌好的蒴果剖开，将种子密封贮藏于10毫升的无菌玻璃瓶中，每瓶保存1个蒴果的种子，将装好种子的玻璃瓶置于冰箱中保存，消毒处理为采用75％酒精浸润蒴果表面35秒，采用0.5％的次氯酸钠溶液进行浸泡，浸泡时间为20分钟，冰箱的温度为5℃，在冰箱内的保存时间为6个月；
S3、萌发培养，用75％酒精擦拭装有种子的玻璃瓶表面，置于超净工作台上，用无菌镊子均匀撒播于萌发培养基表面，前期暗培养7天，萌发培养基的基本培养基为改良MS培养基，前期暗培养7天的条件为：培养温度为27℃下，光照强度为1500LUX，光照时间为10小时/天；
S4、分化培养，培养60天左右，将原球茎均匀地转接到分化培养基上，分化培养基的基本培养基为改良MS培养基，培养条件为：培养温度为27℃下，光照强度为2000LUX，光照时间为10小时/天；
S5、壮苗与生根培养，分化培养60天左右，转接到壮苗与生根培养基上，组培苗达到合格苗标准后，即可进行大棚炼苗马上驯化培养，壮苗与生根培养基为MS培养基，培养条件为：培养温度为27℃下，光照强度为2500LUX，光照时间为10小时/天。
实施例3，由图1给出，一种铁皮石斛组织培养的方法，包括以下步骤：
S1、制种，根据实际生产，选择优质高产并经过鉴定及检测的“优斛”铁皮石斛果荚，然后进行人工授粉，当蒴果开始完全成熟后，选择饱满的果实采收备用，在4月至6月对铁皮石斛果荚开花期间进行人工授粉，在人工授粉后进行挂牌标记，在10月至11月将铁皮石斛果荚储存，在对铁皮石斛果荚储存时应该选取成熟果荚，铁皮石斛果荚为外种壳黄青色、完好无裂则是成熟果荚；
S2、组培育苗，选取合格的铁皮石斛的蒴果，除去表面的杂物，在超净工作台上首先进行消毒处理，然后用无菌水清洗干净，再放入次氯酸钠溶液中浸泡，最后再用无菌水冲洗4次，接着在超净工作台上用无菌手术刀、无菌镊子将灭菌好的蒴果剖开，将种子密封贮藏于7.5毫升的无菌玻璃瓶中，每瓶保存1个蒴果的种子，将装好种子的玻璃瓶置于冰箱中保存，消毒处理为采用75％酒精浸润蒴果表面30秒，采用0.5％的次氯酸钠溶液进行浸泡，浸泡时间为15分钟，冰箱的温度为4℃，在冰箱内的保存时间为5个月；
S3、萌发培养，用75％酒精擦拭装有种子的玻璃瓶表面，置于超净工作台上，用无菌镊子均匀撒播于萌发培养基表面，前期暗培养7天，萌发培养基的基本培养基为改良MS培养基，前期暗培养7天的条件为：培养温度为25℃下，光照强度为1250LUX，光照时间为10小时/天；
S4、分化培养，培养55天左右，将原球茎均匀地转接到分化培养基上，分化培养基的基本培养基为改良MS培养基，培养条件为：培养温度为25℃下，光照强度为2000LUX，光照时间为10小时/天；
S5、壮苗与生根培养，分化培养60天左右，转接到壮苗与生根培养基上，组培苗达到合格苗标准后，即可进行大棚炼苗马上驯化培养，壮苗与生根培养基为MS培养基，培养条件为：培养温度为25℃下，光照强度为2250LUX，光照时间为10小时/天。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制种，根据实际生产，选择优质高产并经过鉴定及检测的“优斛”铁皮石斛果荚，然后进行人工授粉，当蒴果开始完全成熟后，选择饱满的果实采收备用；
S2、组培育苗，选取合格的铁皮石斛的蒴果，除去表面的杂物，在超净工作台上首先进行消毒处理，然后用无菌水清洗干净，再放入次氯酸钠溶液中浸泡，最后再用无菌水冲洗3次至5次，接着在超净工作台上用无菌手术刀、无菌镊子将灭菌好的蒴果剖开，将种子密封贮藏于5毫升至10毫升的无菌玻璃瓶中，每瓶保存1个蒴果的种子，将装好种子的玻璃瓶置于冰箱中保存；
S3、萌发培养，用75％酒精擦拭装有种子的玻璃瓶表面，置于超净工作台上，用无菌镊子均匀撒播于萌发培养基表面，前期暗培养7天；
S4、分化培养，培养50天-60天左右，将原球茎均匀地转接到分化培养基上；
S5、壮苗与生根培养，分化培养60天左右，转接到壮苗与生根培养基上，组培苗达到合格苗标准后，即可进行大棚炼苗马上驯化培养。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，所述步骤S1中在4月至6月对铁皮石斛果荚开花期间进行人工授粉，在人工授粉后进行挂牌标记，在10月至11月将铁皮石斛果荚储存。
3.根据权利要求2所述的一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，所述在对铁皮石斛果荚储存时应该选取成熟果荚，铁皮石斛果荚为外种壳黄青色、完好无裂则是成熟果荚。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，所述步骤S2中消毒处理为采用75％酒精浸润蒴果表面25秒至35秒，采用0.5％的次氯酸钠溶液进行浸泡，浸泡时间为10分钟至20分钟。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，所述步骤S2中冰箱的温度为3至5℃，在冰箱内的保存时间为4个月至6个月。
6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，所述步骤S3中萌发培养基的基本培养基为改良MS培养基，前期暗培养7天的条件为：培养温度为25℃±2℃下，光照强度为1000LUX至1500LUX，光照时间为10小时/天。
7.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，所述步骤S4中分化培养基的基本培养基为改良MS培养基，培养条件为：培养温度为25℃±2℃下，光照强度为2000LUX，光照时间为10小时/天。
8.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，所述步骤S5中壮苗与生根培养基为MS培养基，培养条件为：培养温度为25℃±2℃下，光照强度为2000LUX至2500LUX，光照时间为10小时/天。
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