CN114303950A - 一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：S1：采集铁皮石斛成熟无病虫害，种龄6‑8个月的未开裂蒴果作为外植体，对其进行灭菌处理；S2：横向切开蒴果，将无菌种子均匀地撒播在诱导培养基中，培养30天后获得铁皮石斛原球茎；S3：将铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基中，培养30‑60天后获得个大饱满的铁皮石斛原球茎；S4：将个大饱满的铁皮石斛原球茎转接到分化培养基中，培养40‑60天后获得铁皮石斛小苗；S5：将铁皮石斛小苗转接到含有有机添加物的生根培养基中，培养50天后获得铁皮石斛健壮苗，本发明通过对铁皮石斛原球茎增殖培养，提高了铁皮石斛的成苗产量及质量，获得的铁皮石斛组培苗植株健壮，生长能力强，可适于工厂化生产。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法。
背景技术
铁皮石斛为兰科石斛属石斛组植物，因为花姿优美、花色鲜艳、气味芳香、花期较长、茎干特异等特点而具备很强的功能观赏作用，既是很好的鲜切花材料，又可当作高档的插花，也可用于菜肴上碟的装饰花材，用途极为广泛，实用价值很高。铁皮石斛中所含的化学成分、药理活性及在临床上应用的可能性也一直是植物天然产物研究的热点之一，石斛的生物活性成分多糖、石斛碱、酚类、必需氨基酸、倍半萜类、甾体类、芪类和木质素类等，具有降血压、降血脂、消炎止痛、保护神经、抑制肿瘤活性、对抗衰老等功效。
由于铁皮石斛的生境十分特殊，多附生于树上和石上，它的外形特征十分富于变化，加上品种繁多，因此，历来铁皮石斛药材十分复杂，而且常常混淆严重，给品种鉴定带来一定困难。其次，由于石斛的生境十分特殊，铁皮石斛在自然条件下生长的环境较苛刻，铁皮石斛的种子，极小、无胚乳，需结合共生菌才能正常萌发，故实生苗的栽培难度较大。
铁皮石斛的观赏性以及药用保健性市场需求量较大，但是，目前人工繁育种植仍存在一定的限制，研究开发出有质量有产量的铁皮石斛是缓解资源稀缺的可行性措施。利用铁皮石斛种子组织培养技术繁殖试管苗是解决石斛种苗的有效途径。因此，急需开发一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法以解决上述技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，通过对铁皮石斛原球茎增殖培养，提高了铁皮石斛的成苗产量及质量，获得的铁皮石斛组培苗植株健壮，生长能力强，可适于工厂化生产，具有广阔的应用前景，有利于推广应用。
为了实现上述目的，本发明提供的一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：
S1：采集铁皮石斛成熟无病虫害，种龄6-8个月的未开裂蒴果作为外植体，先经过自来水反复冲洗，再使用洗洁精浸泡10min后，用自来水冲洗6-8次，沥干水分，放置在超净工作台上备用，在超净工作台上，将经过预处理的蒴果先使用75％酒精溶液灭菌30s，之后使用无菌水冲洗至少3次，然后用3.25％次氯酸钠溶液处理5-6min，之后再用无菌水冲洗至少6次，放置于无菌纸上吸干水分，待入瓶；
S2：用充分灼烧后的解剖刀横向切开S1处理得到的蒴果，用镊子夹住蒴果，将无菌种子均匀地撒播在诱导培养基中，培养30天后获得铁皮石斛原球茎；
S3：将S2诱导获得的铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基中，培养30-60天后获得个大饱满的铁皮石斛原球茎；
S4：将S3增殖获得的个大饱满的铁皮石斛原球茎转接到分化培养基中，培养40-60天后获得铁皮石斛小苗；
S5：将S4分化获得的铁皮石斛小苗转接到含有有机添加物的生根培养基中，培养50天后获得铁皮石斛健壮苗，所述生根培养基以MS为基础培养基，有机添加物为100g/L西瓜汁，并添加1.0mg/L的萘乙酸，1.0mg/L的吲哚丁酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述生根培养基的pH值为5.8。
优选地，在S2中，所述诱导培养基以MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖和8g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.8。
优选地，在S3中，所述增殖培养基以1/2MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述增殖培养基的pH值为5.8。
优选地，在S4中，所述分化培养基以MS为基础培养基，添加2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述分化培养基的pH值为5.8。
优选地，在S2中，培养室温度为(24±2)℃，光照12h/d，光照强度为1500-2000Lx。
本发明提供的一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，具有如下有益效果。
1.本发明通过有效的灭菌方式，可使铁皮石斛组织培养过程达到零污染，使每一外植体得到有效利用，解决了组培技术中的污染问题。采用西瓜汁作为生根培养基的有机添加物，可以显著改善铁皮石斛的生长状况。
2.本发明通过诱导铁皮石斛原球茎进行组织培养，具有与植株同样的物质代谢和形态发育潜能，不仅繁殖系数高，生长迅速，而且基本不会导致品种变异，可以保持品种的稳定遗传性，可同时兼具质量与产量。
附图说明
图1为显微镜下铁皮石斛原球茎的生长过程图；
图2为铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基的状态图；
图3为增殖获得的个大饱满的铁皮石斛原球茎；
图4为分化获得的铁皮石斛小苗；
图5为生根获得的铁皮石斛健壮苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。
本发明提供的一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：
S1：采集铁皮石斛成熟无病虫害，种龄6-8个月的未开裂蒴果作为外植体，先经过自来水反复冲洗，再使用洗洁精浸泡10min后，用自来水冲洗6-8次，沥干水分，放置在超净工作台上备用，在超净工作台上，将经过预处理的蒴果先使用75％酒精溶液灭菌30s，之后使用无菌水冲洗至少3次，然后用3.25％次氯酸钠溶液处理5-6min，之后再用无菌水冲洗至少6次，放置于无菌纸上吸干水分，待入瓶。
S2：用充分灼烧后的解剖刀横向切开S1处理得到的蒴果，用镊子夹住蒴果，将无菌种子均匀地撒播在诱导培养基中，培养30天后获得铁皮石斛原球茎；培养室温度为(24±2)℃，光照12h/d，光照强度为1500-2000Lx；所述诱导培养基以MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖和8g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.8。
S3：将S2诱导获得的铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基中，培养30-60天后获得个大饱满的铁皮石斛原球茎。所述增殖培养基以1/2MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述增殖培养基的pH值为5.8。
S4：将S3增殖获得的个大饱满的铁皮石斛原球茎转接到分化培养基中，培养40-60天后获得铁皮石斛小苗。所述分化培养基以MS为基础培养基，添加2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述分化培养基的pH值为5.8。
S5：将S4分化获得的铁皮石斛小苗转接到含有有机添加物的生根培养基中，培养50天后获得铁皮石斛健壮苗，所述生根培养基以MS为基础培养基，有机添加物为100g/L西瓜汁，并添加1.0mg/L的萘乙酸，1.0mg/L的吲哚丁酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述生根培养基的pH值为5.8。
实施例1
本发明提供的一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：
S1：采集铁皮石斛成熟无病虫害，种龄7个月的未开裂蒴果作为外植体，先经过自来水反复冲洗，再使用洗洁精浸泡10min后，用自来水冲洗7次，沥干水分，放置在超净工作台上备用，在超净工作台上，将经过预处理的蒴果先使用75％酒精溶液灭菌30s，之后使用无菌水冲洗3次，然后用3.25％次氯酸钠溶液处理6min，之后再用无菌水冲洗6次，放置于无菌纸上吸干水分，待入瓶。
S2：用充分灼烧后的解剖刀横向切开S1处理得到的蒴果，用镊子夹住蒴果，将无菌种子均匀地撒播在诱导培养基中，培养30天后获得铁皮石斛原球茎，培养室温度为(24±2)℃，光照12h/d，光照强度为1800Lx。所述诱导培养基以MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖和8g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.8。如图1所示，为显微镜下铁皮石斛原球茎的生长过程图。
S3：将S2诱导获得的铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基中，如图2所示，为铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基的状态图。培养40天后获得个大饱满的铁皮石斛原球茎。所述增殖培养基以1/2MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述增殖培养基的pH值为5.8。如图3所示，为增殖获得的个大饱满的铁皮石斛原球茎。
S4：将S3增殖获得的个大饱满的铁皮石斛原球茎转接到分化培养基中，培养60天后获得铁皮石斛小苗。所述分化培养基以MS为基础培养基，添加2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述分化培养基的pH值为5.8。如图4所示，为分化获得的铁皮石斛小苗。
S5：将S4分化获得的铁皮石斛小苗转接到含有有机添加物的生根培养基中，培养50天后获得铁皮石斛健壮苗，所述生根培养基以MS为基础培养基，有机添加物为100g/L西瓜汁，并添加1.0mg/L的萘乙酸，1.0mg/L的吲哚丁酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述生根培养基的pH值为5.8。如图5所示，为生根获得的铁皮石斛健壮苗。
在实施例1中，S2产生的铁皮石斛原球茎深绿色、个体大、饱满、有圆锥状芽。S3增殖的铁皮石斛原球茎深绿色且致密。S4铁皮石斛原球茎分化出小苗较多，苗较粗壮，呈翠绿色居多，生长速度较快。S5铁皮石斛植株强壮，根系粗壮，生根较多，具体生长指标如表1所示。
实施例2
一种铁皮石斛种子组织培养方法，包括如下步骤：
S1：采集铁皮石斛成熟无病虫害，种龄7个月的未开裂蒴果作为外植体，先经过自来水反复冲洗，再使用洗洁精浸泡10min后，用自来水冲洗7次，沥干水分，放置在超净工作台上备用，在超净工作台上，将经过预处理的蒴果先使用75％酒精溶液灭菌30s，之后使用无菌水冲洗3次，然后用3.25％次氯酸钠溶液处理6min，之后再用无菌水冲洗6次，放置于无菌纸上吸干水分，待入瓶。
S2：用充分灼烧后的解剖刀横向切开S1处理得到的蒴果，用镊子夹住蒴果，将无菌种子均匀地撒播在诱导培养基中，培养30天后获得铁皮石斛原球茎，培养室温度为(24±2)℃，光照12h/d，光照强度为1800Lx。所述诱导培养基以MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖和8g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.8。
S3：将S2诱导获得的铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基中，培养40天后获得个大饱满的铁皮石斛原球茎。所述增殖培养基以1/2MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述增殖培养基的pH值为5.8。
S4：将S3增殖获得的个大饱满的铁皮石斛原球茎转接到分化培养基中，培养60天后获得铁皮石斛小苗。所述分化培养基以MS为基础培养基，添加2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述分化培养基的pH值为5.8。
S5：将S4分化获得的铁皮石斛小苗转接到含有有机添加物的生根培养基中，培养50天后获得铁皮石斛健壮苗，所述生根培养基以MS为基础培养基，有机添加物为100g/L香蕉汁，并添加1.0mg/L的萘乙酸，1.0mg/L的吲哚丁酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述生根培养基的pH值为5.8。
在实施例2中，S2产生的铁皮石斛原球茎深绿色、个体大、饱满、有圆锥状芽。S3增殖的铁皮石斛原球茎深绿色且致密。S4铁皮石斛原球茎分化出小苗较多，苗较粗壮，呈翠绿色居多，生长速度较快。S5铁皮石斛植株健壮，根系较细，生根少，具体生长指标如表1所示。
实施例3
一种铁皮石斛种子组织培养方法，包括如下步骤：
S1：采集铁皮石斛成熟无病虫害，种龄7个月的未开裂蒴果作为外植体，先经过自来水反复冲洗，再使用洗洁精浸泡10min后，用自来水冲洗7次，沥干水分，放置在超净工作台上备用，在超净工作台上，将经过预处理的蒴果先使用75％酒精溶液灭菌30s，之后使用无菌水冲洗3次，然后用3.25％次氯酸钠溶液处理6min，之后再用无菌水冲洗6次，放置于无菌纸上吸干水分，待入瓶。
S2：用充分灼烧后的解剖刀横向切开S1处理得到的蒴果，用镊子夹住蒴果，将无菌种子均匀地撒播在诱导培养基中，培养30天后获得铁皮石斛原球茎，培养室温度为(24±2)℃，光照12h/d，光照强度为1800Lx。所述诱导培养基以MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖和8g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.8。
S3：将S2诱导获得的铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基中，培养40天后获得个大饱满的铁皮石斛原球茎。所述增殖培养基以1/2MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述增殖培养基的pH值为5.8。
S4：将S3增殖获得的个大饱满的铁皮石斛原球茎转接到分化培养基中，培养60天后获得铁皮石斛小苗。所述分化培养基以MS为基础培养基，添加2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述分化培养基的pH值为5.8。
S5：将S4分化获得的铁皮石斛小苗转接到含有有机添加物的生根培养基中，培养50天后获得铁皮石斛健壮苗，所述生根培养基以MS为基础培养基，有机添加物为100g/L麦麸汁，并添加1.0mg/L的萘乙酸，1.0mg/L的吲哚丁酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述生根培养基的pH值为5.8。
在实施例3中，S2产生的铁皮石斛原球茎深绿色、个体大、饱满、有圆锥状芽。S3增殖的铁皮石斛原球茎深绿色且致密。S4铁皮石斛原球茎分化出小苗较多，苗较粗壮，呈翠绿色居多，生长速度较快。S5铁皮石斛植株健壮，根系较细，生根较少，具体生长指标如表1所示。
表1有机添加物对铁皮石斛生根壮苗的影响
| 有机添加物 | 株高/cm | 叶片数/片 | 根数/条 | 最大根长/cm | 生长状况 |
| 100g/L西瓜汁 | 1.71±0.21<sup>a</sup> | 7.1±0.83<sup>a</sup> | 4.8±0.51<sup>a</sup> | 2.30±0.18<sup>a</sup> | ++++ |
| 100g/L香蕉汁 | 1.23±0.15<sup>b</sup> | 5.1±0.32<sup>b</sup> | 3.0±0.52<sup>b</sup> | 1.43±0.80<sup>c</sup> | ++ |
| 100g/L麦麸汁 | 1.60±0.26<sup>ab</sup> | 7.6±1.03<sup>a</sup> | 4.0±0.58<sup>ab</sup> | 1.46±0.39<sup>b</sup> | +++ |
1.表中数据为平均值±标准差,同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.0.5)
2.+表示生长健壮程度，+越多表示生长状况越好
由表1可知，与香蕉汁和麦麸汁相比，采用西瓜汁作为生根培养基的有机添加物，可以显著改善铁皮石斛的生长状况。
本发明通过有效的灭菌方式，可使铁皮石斛组织培养过程达到零污染，使每一外植体得到有效利用，解决了组培技术中的污染问题。本发明通过诱导铁皮石斛原球茎进行组织培养，具有与植株同样的物质代谢和形态发育潜能，不仅繁殖系数高，生长迅速，而且基本不会导致品种变异，可以保持品种的稳定遗传性，可同时兼具质量与产量。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：采集铁皮石斛成熟无病虫害，种龄6-8个月的未开裂蒴果作为外植体，先经过自来水反复冲洗，再使用洗洁精浸泡10min后，用自来水冲洗6-8次，沥干水分，放置在超净工作台上备用，在超净工作台上，将经过预处理的蒴果先使用75％酒精溶液灭菌30s，之后使用无菌水冲洗至少3次，然后用3.25％次氯酸钠溶液处理5-6min，之后再用无菌水冲洗至少6次，放置于无菌纸上吸干水分，待入瓶；
S2：用充分灼烧后的解剖刀横向切开S1处理得到的蒴果，用镊子夹住蒴果，将无菌种子均匀地撒播在诱导培养基中，培养30天后获得铁皮石斛原球茎；
S3：将S2诱导获得的铁皮石斛原球茎转接到增殖培养基中，培养30-60天后获得个大饱满的铁皮石斛原球茎；
S4：将S3增殖获得的个大饱满的铁皮石斛原球茎转接到分化培养基中，培养40-60天后获得铁皮石斛小苗；
S5：将S4分化获得的铁皮石斛小苗转接到含有有机添加物的生根培养基中，培养50天后获得铁皮石斛健壮苗，所述生根培养基以MS为基础培养基，有机添加物为100g/L西瓜汁，并添加1.0mg/L的萘乙酸，1.0mg/L的吲哚丁酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述生根培养基的pH值为5.8。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在S2中，所述诱导培养基以MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖和8g/L的琼脂粉，所述诱导培养基的pH值为5.8。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在S3中，所述增殖培养基以1/2MS为基础培养基，添加1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述增殖培养基的pH值为5.8。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在S4中，所述分化培养基以MS为基础培养基，添加2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，0.1mg/L的萘乙酸，3％的蔗糖，8g/L的琼脂粉和1g/L的活性炭粉末，所述分化培养基的pH值为5.8。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子组织培养快速繁殖方法，其特征在于，在S2中，培养室温度为(24±2)℃，光照12h/d，光照强度为1500-2000Lx。
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