CN110612905B - 一种青兰属植物的组培快繁方法及其应用 - Google Patents

一种青兰属植物的组培快繁方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，公开了一种青兰属植物的组培快繁方法，包括无菌外植体的获得、诱导培养、分化培养、生根培养和炼苗移栽；其中，所述诱导培养具体为：取所述无菌外植体0.5～2.0cm，接种于诱导培养基，培养7～15d，得到愈伤组织；所述诱导培养的温度为24～28℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为2000～4000Lx；所述诱导培养基包括0.8～1.5MS培养基、6‑BA 0.5～1.0mg/L、IAA 0.1～0.3mg/L、2,4‑D 0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30g/L、琼脂5～7g/L、Vc 0.2～0.4mg/L和亚硝基铁氰化钠2.0～6.0mg/L，所述诱导培养基的pH＝5.6～6.2；本发明还公开了所述组培快繁方法的应用，所述组培快繁方法通过具有针对性的培养步骤、多植物激素组合的培养基成分和培养条件的限定，达到了高效率繁育青兰属植物的栽培苗的效果。

Description

一种青兰属植物的组培快繁方法及其应用
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种青兰属植物的组培快繁方法及其应用。
背景技术
青兰属(Dracocephalum)植物属唇形科(Labiatae)，草本，多年生，具木质根茎，稀一年生。茎常多数自根茎生出，直立，稀铺地，常不分枝或具少数分枝，稀生多数分枝，四棱形。叶对生，基出叶具长柄，茎生叶具短柄或无柄，常心状卵形或长圆形，或为披针形，边缘具圆齿或锯齿，或全缘，通常不分裂或羽状稀近于掌状深裂。轮伞花序密集成头状或穗状或稀疏排列；花通常蓝紫色，稀白色；苞片常倒卵形，常具锐齿或刺，稀全缘。青兰属植物化学成分复杂，主要可分为挥发油类、黄酮及黄酮苷类、植物甾醇类、有机酸及其酯类、无机元素等。国内外研究报道多为黄酮类化合物，也有二萜、三萜等。其中作为民间药应用的代表有毛建草。
毛建草(Dracocephalum rupestre Hance)，作为青兰属植物，多年生草本，具有典型的青兰属植物特征。其茎带紫色，叶三角状卵形，基部心形，具圆齿。轮伞花序密集成头状，稀穗状。花萼、花冠紫蓝色。据《内蒙古植物药志》记载，其具有清热、解表、止痛的功效，可用于治疗感冒头疼、咽疼、咳嗽、胸肋胀痛、黄疸性肝炎、吐血和痢疾等，为蒙古族习用药材。此外，毛建草叶片中含有总糖、粗多糖、总黄酮、蛋白质、维生素C、粗纤维和氮、磷、钾、钙、铁、镁、锰、铜、锌等物质；其茎、叶通过现代工艺与传统工艺相结合，生产茶叶、饮料及保健品等系列产品。近年来，毛建草茶叶已走进各大餐馆，深受消费者喜爱。毛建草适应性强，花期长而且色泽艳丽，故还可作为宿根花卉美化环境。
但是，目前使用常规植物组织培养方法及常用植物激素配比对青兰属植物进行繁育时，效率非常低下，甚至不如种子繁殖效率高。除此之外，由于毛建草种子小，不易采集，自然环境下，种子萌发率不高，致使其种子繁殖存在困难；同时，因其次生代谢产物丰富，含有多种酶类及各种小分子物质，严重影响了常规植物组织培养的植物激素组合的作用效果，使得常规植物组织培养方法对毛建草的繁育也不能有效达到组织培养的效率。例如，常用的烟草组培用培养基就无法完成岷山毛建草等青兰属植物的再生，其诱导培养基无法诱导出足够的愈伤组织，诱导过程中组织材料的褐化也明显。
因此，针对毛建草等青兰属植物，我们亟需一种针对青兰属植物，能够高效率地繁育栽培苗的组培快繁方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种青兰属植物的组培快繁方法及其应用，以达到提高青兰属植物，尤其是毛建草的繁殖效率和缩短繁殖时间的效果。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种青兰属植物的组培快繁方法，包括无菌外植体的获得、诱导培养、分化培养、生根培养和炼苗移栽；
其中，所述诱导培养具体为：取所述无菌外植体0.5～2.0cm，接种于诱导培养基，培养7～15d，得到愈伤组织；
所述诱导培养基包括0.8～1.5MS培养基、6-BA 0.5～1.0mg/L、IAA 0.1～0.3mg/L、2,4-D 0.1～0.2mg/L、蔗糖25～30g/L、琼脂5～7g/L、Vc 0.2～0.4mg/L和亚硝基铁氰化钠2.0～6.0mg/L，所述诱导培养基的pH＝5.6～6.2。
通过上述技术方案，所述Vc和亚硝基铁氰化钠的组合补充可以针对青兰属植物中各组织的次生代谢产物、酶等内含物丰富的情况，有效地抑制组织褐化和控制次生代谢水平，从而缓冲这些内含物对诱导愈伤组织的影响；同时配合MS培养基、6-BA、IAA和2,4-D等培养基组分的添加和配比的限定，产生共同作用，达到了高效诱导愈伤组织的效果。除此之外，对pH进行限定能够更好地发挥培养基的缓冲作用，达到稳定各种生化反应的效果。
优选的，所述无菌外植体的获得具体为：取部分或整株青兰属植物，在无菌条件下，先使用酒精消毒5～10s，再使用HgCl2溶液消毒10～17min，最后使用无菌水冲洗5～6次，得到所述无菌外植体。
优选的，所述酒精的质量浓度为70％～75％，所述HgCl2溶液的质量浓度为0.01％～0.02％。
通过上述技术方案，由于所述青兰属植物为相对较为脆弱的草本，选用低浓度的酒精和HgCl2进行消毒，达到了在保证细胞活性的同时，对其进行充分消毒的效果。
优选的，所述分化培养具体为：所述分化培养具体为：取所述愈伤组织0.5～1.0cm，接种于分化培养基，培养15～25d，得到试管苗；所述分化培养基包括0.8～1.5MS培养基、6-BA 0.5～0.8mg/L、NAA 0.05～0.1mg/L、IAA 0.05～0.1mg/L、蔗糖25～30g/L和琼脂5～7g/L，所述分化培养基的pH＝5.6～6.2。
通过上述技术方案，对所述愈伤组织进行分化培养，能够快速诱导其分化出大量芽体，达到了高效诱导芽的形成及生长，从而为获得大量再生植物提供基础的效果。
优选的，所述生根培养具体为：取高度为3～4cm的所述试管苗，接种于生根培养基，培养8～15d，得到所述组培苗。
优选的，所述生根培养基包括0.5～1.0MS培养基、NAA 0.1～0.2mg/L、IBA 0～0.05mg/L、蔗糖15～25g/L、琼脂5～7g/L和马铃薯汁1.0～3.0mL/L，所述生根培养基的pH＝5.6～6.2。
优选的，所述生根培养基包括0.5～1.0MS培养基、NAA 0.1～0.2mg/L、IBA 0～0.05mg/L，蔗糖15～25g/L、琼脂5～7g/L、马铃薯汁1.0～3.0mL/L和活性炭0.5～3.5g/L，所述生根培养基的pH＝5.6～6.2。
通过上述技术方案，在所述生根培养基中添加了马铃薯汁和活性炭，由于活性炭具有吸附作用，在生根时，更有利于根细胞与培养基间的物质交换，达到了在诱导芽体生长的基础上进一步促进芽体生根的效果。
优选的，所述诱导培养的温度为24～28℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为2000～4000Lx；优选为温度为26℃，光照时间为10h/d，光照强度为3000Lx；
和/或所述分化培养的温度为24～28℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为2000～4000Lx；优选为温度为26℃，光照时间为10h/d，光照强度为2500Lx；
和/或所述生根培养的温度为24～28℃，光照时间为8～12h/d，光照强度为2000～4000Lx；优选为温度为26℃，光照时间为10h/d，光照强度为3000Lx。
通过上述技术方案，对所述光照强度进行限定，使得所述青兰属植物在组培快繁的过程中，能够很好的控制光刺激、诱导强度和叶绿素形成后的光合作用强度，有利于所述青兰属植物的快速繁殖。
优选的，所述炼苗移栽具体为：将所述组培苗置于瓶中，移至自然光下，封口炼苗4～7d；随后将其取出洗净，并移栽至灭菌的蛭石中，浇透水，保湿培养8～12d。
通过上述技术方案，所述封口炼苗对再生植株的生长环境改变较小，能更好的维持植株周围的温度和湿度变化，达到了防止植株死亡的效果。
优选的，所述蛭石经高锰酸钾溶液灭菌。
通过上述技术方案，所述高锰酸钾溶液能有效地起到杀菌灭虫的作用，使在组培时处于无菌环境中的再生植物不易受到外界病菌的伤害，利于植株的存活，达到了提高其在外界环境中的适应能力和生长能力的效果。
一种青兰属植物的组培快繁方法的应用，是将所述组培快繁方法用于培育青兰属植物。
优选的，是将所述组培快繁方法用于培育毛建草。
本发明的有益效果是：
1.本发明的一种青兰属植物的组培快繁方法，通过所述Vc和亚硝基铁氰化钠的组合补充，针对青兰属植物中各组织的次生代谢产物、酶等内含物丰富的情况，有效地缓冲这些内含物对诱导愈伤组织的影响；同时配合MS培养基、6-BA、IAA和2,4-D等培养基组分的共同作用，达到了高效诱导愈伤组织的效果。
2.本发明的一种青兰属植物的组培快繁方法，以分化培养替代了继代培养，快速诱导所述愈伤组织分化出大量芽体，达到了高效诱导芽的形成及生长，从而为获得大量再生植物提供基础的效果。
3.本发明的一种青兰属植物的组培快繁方法，在所述生根培养基中添加了马铃薯汁和活性炭，达到了在诱导芽体生长的基础上进一步促进芽体生根的效果。
4.本发明的一种青兰属植物的组培快繁方法，通过对所述光照强度进行限定，使得所述青兰属植物在组培快繁的过程中，能够很好的控制光刺激、诱导强度和叶绿素形成后的光合作用强度，有利于所述青兰属植物的快速繁殖。
附图说明
图1为本发明效果试验7中炼苗培养后的植物生长效果图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种青兰属植物的组培快繁方法，包括以下步骤：
S1.无菌外植体的获得：取整株毛建草，在无菌条件下，使用质量浓度为70％的酒精快速消毒5s，再使用质量浓度为0.01％的HgCl2溶液消毒10min，最后使用无菌水冲洗5～6次，得到无菌外植体(污染率为25.1％)；
S2.诱导培养：取无菌外植体0.5cm，接种于诱导培养基，培养7d，得到愈伤组织(出愈率为86.85％)；其中，诱导培养的温度为26℃，光照时间为8h/d，光照时间为2000Lx；诱导培养基包括0.8MS培养基、6-BA 0.5mg/L、IAA 0.1mg/L、2,4-D 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L、Vc 0.2mg/L、亚硝基铁氰化钠2.0mg/L，pH＝5.6；
S3.分化培养：取愈伤组织1.0cm，接种于分化培养基，培养25d，得到试管苗(出芽率为86.29％)；其中，分化培养的温度为26℃，光照时间为8h/d，光照时间为2000Lx；分化培养基包括1.5MS培养基、6-BA 0.8mg/L、NAA 0.1mg/L、IAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，pH＝6.2；
S4.生根培养：取高度为3.5cm的试管苗，接种于生根培养基，培养10d，得到组培苗(生根率为85.44％)；其中，生根培养的温度为26℃，光照时间为8h/d，光照时间为2000Lx；生根培养基包括0.8MS培养基、NAA 0.15mg/L、IBA 0.025mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5g/L、马铃薯汁2.0mL/L、活性炭1g/L，pH＝5.8。
S5.炼苗移栽：将组培苗置于瓶中，移至自然光下，封口炼苗4～7d；取出组培苗将根部的琼脂洗净，并移栽至经过0.1％的高锰酸钾溶液消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于20-28℃的温室中生长，约8-12d后将苗栽于营养钵中，于遮光50％的阴棚下放置8～15d，即可进行常规管理。
实施例2
一种青兰属植物的组培快繁方法，包括以下步骤：
S1.无菌外植体的获得：取部分毛建草，在无菌条件下，使用质量浓度为70％的酒精快速消毒10s，再使用质量浓度为0.02％的HgCl2溶液消毒17min，最后使用无菌水冲洗5～6次，得到无菌外植体(污染率为10.1％)；
S2.诱导培养：取无菌外植体2.0cm，接种于诱导培养基，培养15d，得到愈伤组织(出愈率为94.48％)；其中，诱导培养的温度为26℃，光照时间为12h/d，光照时间为4000Lx；诱导培养基包括1.5MS培养基、6-BA 1.0mg/L、IAA 0.3mg/L、2,4-D 0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L、Vc 0.4mg/L、亚硝基铁氰化钠6.0mg/L，pH＝6.2；
S3.分化培养：取愈伤组织0.5cm，接种于分化培养基，培养15d，得到试管苗(出芽率为87.54％)；其中，分化培养的温度为26℃，光照时间为12h，光照时间为4000Lx；分化培养基包括0.8MS培养基、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.05mg/L、IAA 0.05mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，pH＝5.6；
S4.生根培养：取高度为4cm的试管苗，接种于生根培养基，培养15d，得到组培苗(生根率为85.06％)；其中，生根培养的温度为26℃，光照时间为12h/d，光照时间为4000Lx；生根培养基包括1.0MS培养基、NAA 0.2mg/L、IBA 0.05mg/L、蔗糖25g/L、琼脂5g/L、马铃薯汁3.0mL/L、活性炭1g/L，pH＝6.2。
S5.炼苗移栽：将组培苗置于瓶中，移至自然光下，封口炼苗4～7d；取出组培苗将根部的琼脂洗净，并移栽至经过0.1％的高锰酸钾溶液消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于20-28℃的温室中生长，约8-12d后将苗栽于营养钵中，于遮光50％的阴棚下放置8～15d，即可进行常规管理。
实施例3
一种青兰属植物的组培快繁方法，包括以下步骤：
S1.无菌外植体的获得：取部分毛建草，在无菌条件下，使用质量浓度为75％的酒精快速消毒5s，再使用质量浓度为0.01％的HgCl2溶液消毒10min，最后使用无菌水冲洗5～6次，得到无菌外植体(污染率为23.4％)；
S2.诱导培养：取无菌外植体1cm，接种于诱导培养基，培养10d，得到愈伤组织(出愈率为88.15％)；其中，诱导培养的温度为26℃，光照时间为10h/d，光照时间为3000Lx；诱导培养基包括MS培养基、6-BA 0.8mg/L、IAA 0.2mg/L、2,4-D 0.15mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L、Vc 0.3mg/L、亚硝基铁氰化钠4.0mg/L，pH＝5.8；
S3.分化培养：取愈伤组织1cm，接种于分化培养基，培养20d，得到试管苗(出芽率为89.13％)；其中，分化培养的温度为26℃，光照时间为10h/d，光照时间为2500Lx；分化培养基包括MS培养基、6-BA 0.7mg/L、NAA 0.08mg/L、IAA 0.08mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，pH＝5.8；
S4.生根培养：取高度为4cm的试管苗，接种于生根培养基，培养8d，得到组培苗(生根率为85.05％)；其中，生根培养的温度为26℃，光照时间为10h/d，光照时间为3000Lx；生根培养基包括0.5MS培养基、NAA 0.1mg/L、蔗糖15g/L、琼脂5g/L、马铃薯汁1.0mL/L、活性炭1g/L，pH＝5.6。
S5.炼苗移栽：将组培苗置于瓶中，移至自然光下，封口炼苗4～7d；取出组培苗将根部的琼脂洗净，并移栽至经过0.1％的高锰酸钾溶液消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于20-28℃的温室中生长，约8-12d后将苗栽于营养钵中，于遮光50％的阴棚下放置8～15d，即可进行常规管理。
实施例4
一种青兰属植物的组培快繁方法，包括以下步骤：
S1.无菌外植体的获得：取整株香青兰，在无菌条件下，使用质量浓度为70％的酒精快速消毒10s，再使用质量浓度为0.02％的HgCl2溶液消毒17min，最后使用无菌水冲洗5～6次，得到无菌外植体(污染率为12.3％)；
S2.诱导培养：取无菌外植体1cm，接种于诱导培养基，培养15d，得到愈伤组织(出愈率为90.03％)；其中，诱导培养的温度为26℃，光照时间为12h/d，光照时间为4000Lx；诱导培养基包括1.5MS培养基、6-BA 1.0mg/L、IAA 0.3mg/L、2,4-D 0.2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L、Vc 0.2mg/L、亚硝基铁氰化钠2.0mg/L，pH＝5.8；
S3.分化培养：取愈伤组织1cm，接种于分化培养基，培养15d，得到试管苗(出芽率为84.36％)；其中，分化培养的温度为28℃，光照时间为12h/d，光照时间为4000Lx；分化培养基包括0.8MS培养基、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.05mg/L、IAA 0.05mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，pH＝5.8；
S4.生根培养：取高度为4cm的试管苗，接种于生根培养基，培养15d，得到组培苗(生根率为86.52％)；其中，生根培养的温度为24℃，光照时间为12h/d，光照时间为4000Lx；生根培养基包括1.0MS培养基、NAA 0.2mg/L、IBA 0.05mg/L、蔗糖25g/L、琼脂5g/L、马铃薯汁2.0mL/L、活性炭1g/L，pH＝5.8。
S5.炼苗移栽：将组培苗置于瓶中，移至自然光下，封口炼苗4～7d；取出组培苗将根部的琼脂洗净，并移栽至经过0.1％的高锰酸钾溶液消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于20-28℃的温室中生长，约8-12d后将苗栽于营养钵中，于遮光50％的阴棚下放置8～15d，即可进行常规管理。
实施例5
一种青兰属植物的组培快繁方法，包括以下步骤：
S1.无菌外植体的获得：取部分白花枝子花，在无菌条件下，使用质量浓度为75％的酒精快速消毒5s，再使用质量浓度为0.01％的HgCl2溶液消毒10min，最后使用无菌水冲洗5～6次，得到无菌外植体(污染率为20.7％)；
S2.诱导培养：取无菌外植体1cm，接种于诱导培养基，培养10d，得到愈伤组织(出愈率为89.55％)；其中，诱导培养的温度为26℃，光照时间为12h/d，光照时间为3000Lx；诱导培养基包括MS培养基、6-BA 0.8mg/L、IAA 0.2mg/L、2,4-D 0.15mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L、Vc 0.2mg/L、亚硝基铁氰化钠2.0mg/L，pH＝5.8；
S3.分化培养：取愈伤组织1cm，接种于分化培养基，培养15d，得到试管苗(出芽率为88.58％)；其中，分化培养的温度为28℃，光照时间为12h/d，光照时间为4000Lx；分化培养基包括MS培养基、6-BA 0.7mg/L、NAA 0.08mg/L、IAA 0.08mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，pH＝5.8；
S4.生根培养：取高度为4cm的试管苗，接种于生根培养基，培养8d，得到组培苗(生根率为84.15％)；其中，生根培养的温度为26℃，光照时间为12h/d，光照时间为3000Lx；生根培养基包括0.5MS培养基、NAA 0.1mg/L、蔗糖15g/L、琼脂5g/L、马铃薯汁1.0mL/L、活性炭1g/L，pH＝5.8。
S5.炼苗移栽：将组培苗置于瓶中，移至自然光下，封口炼苗4～7d；取出组培苗将根部的琼脂洗净，并移栽至经过0.1％的高锰酸钾溶液消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于20-28℃的温室中生长，约8-12d后将苗栽于营养钵中，于遮光50％的阴棚下放置8～15d，即可进行常规管理。
实施例6
一种青兰属植物的组培快繁方法，包括以下步骤：
S1.无菌外植体的获得：取部分岷山毛建草，在无菌条件下，使用质量浓度为70％的酒精快速消毒10s，再使用质量浓度为0.01％的HgCl2溶液消毒17min，最后使用无菌水冲洗5～6次，得到无菌外植体(污染率为15.2％)；
S2.诱导培养：取无菌外植体1cm，接种于诱导培养基，培养10d，得到愈伤组织(出愈率为89.48％)；其中，诱导培养的温度为26℃，光照时间为12h/d，光照时间为3000Lx；诱导培养基包括MS培养基、6-BA 0.8mg/L、IAA 0.2mg/L、2,4-D 0.15mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L、Vc 0.2mg/L、亚硝基铁氰化钠2.0mg/L，pH＝5.8；
S3.分化培养：取愈伤组织1cm，接种于分化培养基，培养20d，得到试管苗(出芽率为88.42％)；其中，分化培养的温度为28℃，光照时间为12h/d，光照时间为4000Lx；分化培养基包括MS培养基、6-BA 0.7mg/L、NAA 0.08mg/L、IAA 0.08mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5g/L，pH＝5.8；
S4.生根培养：取高度为4cm的试管苗，接种于生根培养基，培养12d，得到组培苗(生根率为82.50％)；其中，生根培养的温度为24℃，光照时间为12h/d，光照时间为3000Lx；生根培养基包括0.5MS培养基、NAA 0.1mg/L、蔗糖20g/L、琼脂5g/L、马铃薯汁1.0mL/L、活性炭1g/L，pH＝5.8。
S5.炼苗移栽：将组培苗置于瓶中，移至自然光下，封口炼苗4～7d；取出组培苗将根部的琼脂洗净，并移栽至经过0.1％的高锰酸钾溶液消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于20-28℃的温室中生长，约8-12d后将苗栽于营养钵中，于遮光50％的阴棚下放置8～15d，即可进行常规管理。
试验效果
为了验证本发明的组培快繁方法对青兰属植物污染率的降低以及诱导率、出愈率、出芽率和生根率的提高，进行了如下试验：
对比试验1
将各样品材料分别用70％、75％酒精、0.01％HgCl2、0.02％HgCl2及其组合在不同的时间下消毒处理，并用无菌水冲洗后取叶、茎、根各10～15份，共30～45份置于相同培养基培养，观察统计污染率和诱导率(细胞活力)，设置3次重复。试验结果如表1所示：
表1消毒处理对材料的影响
Figure BDA0002243274800000081
Figure BDA0002243274800000091
由上表可知，当先用质量浓度为70％～75％的酒精快速消毒5～10s，再用质量浓度为0.01％～0.02％的HgCl2溶液灭毒10-17min时，各样品材料的污染率和诱导率达到了最佳的平衡，在污染率低的同时，保证了诱导率高达80％以上。
对比试验2
(1)将统一条件消毒处理后的各样品材料取叶、茎、根各10～15份，共30～45份置于相同诱导培养基培养，观察统计出愈率，设置3次重复；最后，使用SPSS软件对计算结果进行差异显著性分析。其中，愈伤组织诱导率＝(愈伤组织块数/接种外植体数)×100％。
(2)诱导培养：将经灭毒的外植体材料，取约0.5～2.0cm长或见方的外植体(一般为叶、茎、根部位)，接种于诱导培养基，培养温度24～28℃，光照8～12h/d，光照强度2000～4000Lx，培养7～15天即可获得稳定愈伤组织且诱导率达80％及以上。
试验结果如表2所示：
表2诱导培养基组合对青兰属材料愈伤组织诱导情况
Figure BDA0002243274800000092
Figure BDA0002243274800000101
Figure BDA0002243274800000111
Figure BDA0002243274800000121
由上表所示，当采用0.5MS培养基或2.0MS培养基时，出愈率较低；诱导培养基中不含IAA、2,4-D中的一种或两种时，出愈率显著降低；当采用0.8～1.5MS培养基，添加6-BA0.5～1.0mg/L，IAA 0.1～0.3mg/L，2,4-D 0.1～0.2mg/L时，出愈率达到最佳。
对比试验3
(1)取诱导培养基中生长良好的材料30～45份，置于分化培养基培养，观察统计出芽率，设置3次重复；最后，使用SPSS软件对计算结果进行差异显著性分析。其中，不定芽分化率＝(分化不定芽的愈伤组织块数/接种外植体数)×100％。
(2)分化培养：从诱导培养基上剪切下约0.5～1.0cm大小愈伤组织，转入分化培养基，培养温度24～28℃，光照8～12h/d，光照强度2000～4000Lx，约8～10天每个接种块可分化出大于0.5cm的有效不定芽达4个左右，培养时间为15～25天。
试验结果如表3所示：
表3分化培养基组合对青兰属材料愈伤组织出芽情况
Figure BDA0002243274800000131
Figure BDA0002243274800000141
Figure BDA0002243274800000151
Figure BDA0002243274800000161
由上表所示，当采用0.5MS培养基或2.0MS培养基时，出芽率较低；分化培养基中不含IAA、NAA中的一种或两种时，出芽率显著降低；当采用0.8～1.5MS培养基，添加6-BA 0.5～0.8mg/L，NAA 0.05～0.1mg/L，IAA 0.05～0.1mg/L时，出芽率达到最佳。
对比试验4
(1)分别取不同种材料中生长良好的芽体30～45份，置于生根培养基培养观察，统计生根率，设置3次重复；最后，使用SPSS软件对计算结果进行差异显著性分析。其中，生根率＝(生根的不定芽数/接种的不定芽数)×100％。
(2)生根培养：从分化培养基上剪下长高至3～4cm的试管苗，转入生根培养基，培养温度24～28℃，光照8～12h/d，光照强度2000～4000Lx，培养时间为8～15天。
试验结果如表4所示：
表4生根培养基组合对青兰属材料生根的情况
Figure BDA0002243274800000171
Figure BDA0002243274800000181
Figure BDA0002243274800000191
Figure BDA0002243274800000201
由上表所示，当采用0.25MS培养基或1.5MS培养基时，生根率较低；生根培养基中不含NAA、IBA中的一种或两种时，生根率有一定降低；当采用0.5～1.0MS培养基，添加NAA0.1～0.20mg/L，IBA 0～0.10mg/L时，生根率达到最佳。
对比试验5
试验分为实验组和对照组，其中实验组采用本发明实施例1中的方法；对照组采用的诱导培养基包括MS培养基、6-BA、IAA、2,4-D、蔗糖、琼脂，pH＝5.8，其他步骤、条件和用量配比等与本发明实施例1均相同(本对比试验是与不添加Vc和亚硝基铁氰化钠进行对比，用于证明本发明的方法培养青兰属植物的诱导效果更好)。试验结果如下表所示：
组别 出愈率％ 出芽率％ 生根率％
对照组 70.82％ 84.38％ 85.65％
实验组 86.85％ 86.29％ 85.44％
由上表可知，相比于对照组，实验组的出愈率显著提高。因此，本发明的诱导培养方法对青兰属植物的诱导效果更好。
对比试验6
试验分为实验组A、实验组B、对照组A和对照组B，其中实验组A采用本发明实施例1中的方法；实验组B中诱导培养、分化培养和生根培养的光照强度均为4000Lx，其他步骤、条件和用量配比等与本发明实施例1均相同；对照组A中诱导培养、分化培养和生根培养的光照强度均为1000Lx，其他步骤、条件和用量配比等与本发明实施例1均相同；对照组B中诱导培养、分化培养和生根培养的光照强度均为5000Lx，其他步骤、条件和用量配比等与本发明实施例1均相同(本对比试验是与不同的光照强度进行对比，用于证明本发明的光照强度培养青兰属植物的诱导效果更好)。试验结果如下表所示：
组别 出愈率％ 出芽率％ 生根率％
对照组A 75.11％ 74.58％ 73.66％
对照组B 73.26％ 70.95％ 71.35％
实验组A 86.85％ 86.29％ 85.44％
实验组B 82.25％ 81.06％ 80.67％
由上表可知，相比于对照组A和对照组B，本发明的方法显著提高了青兰属植物的出愈率、出芽率和生根率。因此，本发明对光照条件的选择对青兰属植物的培养效果更好。
效果试验7
将不同材料的组培苗瓶移至室外，自然光下封口炼苗4～7天，取出组培苗将根部的琼脂洗净，移栽到经过0.1％的高锰酸钾消毒的蛭石中，浇透水，用塑料膜保湿，置于20～28℃的温室中生长，约8～12天后将苗栽于营养钵中，于遮光50％的阴棚下放置8～15天。
如图1所示，组培苗在炼苗和移栽过程中均呈现良好的生长趋势。
综上所述，本发明的一种青兰属植物的组培快繁方法，在降低污染率的同时，提高了出愈率、出芽率、生根率和诱导率，达到了提高青兰属植物，尤其是毛建草的繁殖效率和缩短繁殖时间的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种青兰属植物的组培快繁方法，其特征在于：包括无菌外植体的获得、诱导培养、分化培养、生根培养和炼苗移栽；
其中，所述诱导培养具体为：取所述无菌外植体0.5~2.0cm，接种于诱导培养基，培养7~15d，得到愈伤组织；所述诱导培养基为0.8~1.5 MS培养基、6-BA 0.5~1.0mg/L、IAA 0.1~0.3mg/L、2,4-D 0.1~0.2mg/L、蔗糖25~30g/L、琼脂5~7g/L、Vc 0.2~0.4mg/L和亚硝基铁氰化钠2.0~6.0mg/L，所述诱导培养基的pH=5.6~6.2；
所述分化培养具体为：取所述愈伤组织0.5~1.0cm，接种于分化培养基，培养15~25d，得到试管苗；所述分化培养基为0.8~1.5 MS培养基、6-BA 0.5~0.8mg/L、NAA 0.05~0.1mg/L、IAA 0.05~0.1mg/L、蔗糖25~30g/L和琼脂5~7g/L；
所述生根培养具体为：取高度为3~4cm的所述试管苗，接种于生根培养基，培养8~15d，得到所述组培苗；所述生根培养基为0.5~1.0 MS培养基、NAA 0.1~0.2 mg/L、IBA 0~0.05mg/L、蔗糖15~25g/L、琼脂5~7g/L和马铃薯汁1.0~3.0mL/L；
所述青兰属植物选自毛建草、岷山毛建草、香青兰、甘青青兰、白花枝子花、全叶青兰、羽叶枝子花、大理青兰、松叶青兰、截萼毛建草、绒叶毛建草、美叶青兰、小花毛建草、皱叶毛建草、大花毛建草、覆苞毛建草和美花毛建草中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种青兰属植物的组培快繁方法，其特征在于：所述无菌外植体的获得具体为：取部分或整株青兰属植物，在无菌条件下，先使用酒精消毒5~10s，再使用HgCl2溶液消毒10~17min，最后使用无菌水冲洗5~6次，得到所述无菌外植体。
3.根据权利要求1所述的一种青兰属植物的组培快繁方法，其特征在于：所述分化培养基的pH=5.6~6.2。
4.根据权利要求1所述的一种青兰属植物的组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基的pH=5.6~6.2。
5.根据权利要求1所述的一种青兰属植物的组培快繁方法，其特征在于：所述生根培养基还添加有活性炭0.5~3.5g/L。
6.根据权利要求1所述的一种青兰属植物的组培快繁方法，其特征在于：所述诱导培养的温度为24~28℃，光照时间为8~12h/d，光照强度为2000~4000Lx；
和/或所述分化培养的温度为24~28℃，光照时间为8~12h/d，光照强度为2000~4000Lx；
和/或所述生根培养的温度为24~28℃，光照时间为8~12h/d，光照强度为2000~4000Lx。
7.根据权利要求1所述的一种青兰属植物的组培快繁方法，其特征在于：所述炼苗移栽具体为：将所述组培苗置于瓶中，移至自然光下，封口炼苗4~7d；随后将其取出洗净，并移栽至灭菌的蛭石中，浇透水，保湿培养8~12d。
8.根据权利要求1~7任一项所述的组培快繁方法的应用，其特征在于：是将所述组培快繁方法用于培育青兰属植物，所述青兰属植物选自毛建草、岷山毛建草、香青兰、甘青青兰、白花枝子花、全叶青兰、羽叶枝子花、大理青兰、松叶青兰、截萼毛建草、绒叶毛建草、美叶青兰、小花毛建草、皱叶毛建草、大花毛建草、覆苞毛建草和美花毛建草中的一种。
9.根据权利要求8所述的组培快繁方法的应用，其特征在于：是将所述组培快繁方法用于培育毛建草。
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