CN107743868A - 一种利用自然光培养一步成苗高效繁殖金线莲的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用自然光培养一步成苗高效繁殖金线莲的方法，是以金线莲人工授粉获得的蒴果为外植体材料，无菌播种到一步成苗培养基上，利用自然光诱导种子萌发直接分化生长成完整植株。该方法中人工授粉成功率高达80%，从播种到组培苗出瓶移栽只需180d，期间不需人工转接；且培养出的组培苗粗壮、抗性好，不需专门的炼苗就可直接移栽，移栽成活率高达90%以上。该方法操作简便，能显著缩短培养周期和降低金线莲组培苗生产成本，便于大规模工厂化生产应用，且一步成苗培养基配方中仅使用天然有机添加物和低浓度的植物生长调节剂，有利于保持种源的优良性状，提高种苗使用的安全性，对珍稀濒危药用植物资源再生和可持续利用具有十分积极的影响。

Description

一种利用自然光培养一步成苗高效繁殖金线莲的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种利用自然光培养一步成苗高效繁殖优质金线莲的方法。

背景技术

金线莲[Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.]为兰科开唇兰属珍贵药用和观赏植物，在我国主要分布于云南、广西、福建、广东和江西等省区。作为我国传统的珍贵药材，金线莲素有“神药”、“金草”、“药王”、“乌人参”等美称，在我国经典医学书籍《国药大药典》和《本草求源》等均有记载，可全草入药，对急慢性肝炎、糖尿病、高血脂等多种重大疾病均有疗效。金线莲除用作中药材外，还大量用于鲜食、煲汤和制茶等保健养生方面。在日本和我国台湾地区还广泛开展了金线莲药用多糖的提取加工，产业化已达到一定的规模，具有非常好的市场前景。

金线莲野生居群通常生长在常绿阔叶林下，尤其是植被覆盖较好，荫蔽度为60%~80%、林内凉爽、土壤腐殖质丰富的小环境最适合其生长。随着金线莲药材和保健品使用量的加大，市场价格也水涨船高，加上金线莲资源生长较慢，再生率极低，长期采挖，种质资源已濒临灭绝，难以满足市场需求。

随着现代生物技术的发展和应用，金线莲组培快繁技术也得到很大发展，通常以茎段为外植体材料诱导不定芽获得无菌材料，转接后进行增殖培养，繁殖系数为2~5倍，继代增殖和生根培养每一阶段的周期均为120d以上，组培苗生根完成后，进行炼苗移栽。以目前金线莲快繁技术中的繁殖系数和各阶段的培养周期计算，其组培苗的生产周期较长，成本还是居高不下，严重制约了其组培苗的推广应用。因此，若能建立在一种培养基上由种子直接萌发分化出可移栽的金线莲组培苗的培养方法，即一步成苗法，将大大减少离体材料转接次数，简化操作程序，缩短培养时间。而关于金线莲的一步成苗的组织培养方法和技术体系，至今尚未见相关报道。

自然光非常有利于金线莲组培苗生长,辅以遮阳网调控避免太阳光直射，培养出的组培苗十分粗壮，具有抗性好、移栽成活率高等优势，且利用自然光条件进行培养能大大节约能源，节省生产成本。

因此，本发明通过人工授粉获得大量优质蒴果，在全日光温室条件下进行组培快繁生产，并利用特定的培养基配方，将无菌播种、分化、壮苗和生根培养一步完成，建立了金线莲自然光培养一步成苗组培高效繁殖技术体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用自然光培养一步成苗高效繁殖金线莲的方法，本方法不仅可以进行工厂化生产以满足市场需求，而且能显著降低金线莲组培苗生产成本。

本发明一种利用自然光培养一步成苗高效繁殖金线莲的方法，包括如下步骤：

（1）建造全自然光培养室：建造铝合金框架玻璃墙顶房屋式全自然光培养室，屋顶和四周安装有遮阳降温设施，全自然光培养室与组培接种实验室由专用通道相通，培养室内部摆放培养架；

（2）收集金线莲种源并进行人工授粉：通过野外采集获得金线莲种质资源，引种到种质圃内进行种植保存，待花朵开放后，在上午8~10点，选取开放1~3d的花朵，取其蕊柱上呈浅黄色、具有黏性的花粉块置于亲本花的柱头蕊腔内，授粉方式为居群内自花、异花或异株授粉，24h内停止浇水并挂牌标记；

（3）灭菌消毒：采摘人工授粉后生长60~90d的金线莲蒴果，到自来水下用软毛刷洗去表面灰尘和脏物，然后移至超净工作台内进行无菌操作，先放入75%酒精中浸泡30s后，转入0.1% HgCl₂ 溶液中消毒10 min，期间不断摇动，无菌水漂洗5遍，用无菌滤纸吸干材料表面水分；

（4）一步成苗培养：将经外表灭菌消毒处理后的蒴果纵向剖开，将里面细小的种子取出，均匀稀疏地播种到一步成苗培养基上，置于温度25~28℃的黑暗条件下培养1d，然后转移到全自然光培养室中的培养架上，保持温度23~27℃条件下培养30d，种子萌发形成原球茎，再分化生长为小苗，之后长出根系，培养180 d后形成完整植株；

（5）出瓶移栽：经过成苗培养的健壮大苗，待根系生长发达后，在移栽季节，进行出瓶移栽。移栽时，先将试管苗从瓶中取出，小心地将根部附着的培养基洗净，待植株表面水分稍干便可种植。以泥炭土作为移栽基质，移栽后保持温度为22~28℃，湿度为75%~80%，成活率达到95％以上，长势良好。

上述方法的步骤（1）中，所建自然光培养室内部摆放培养架，培养架间距为80~100cm，使用前经过清洁消毒处理，以减少污染机会。

步骤（2）中所述种质圃为设施大棚，具有遮阳避雨设施，棚顶开有天窗，利于通风透气。人工授粉后，在24h内不能浇水，24h后方可进行正常的水肥管理。

步骤（3）中所述金线莲蒴果为无病虫侵害、未开裂的健壮饱满的蒴果，外表颜色为红色或褐色，内部种子为白色团块状或金黄色丝状。

步骤（4）中所述一步成苗培养基配方为1/2MS+NAA 0.3-0.5 mg/L +6-BA 0.3-0.5mg/L +AC 1.0 g/L+香蕉汁100g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH为5.8，所使用的植物生长调节剂6-BA (6-benzylaminopurine)和NAA (Naphthalene acetic acid)均为分析纯，为上海国药集团化学试剂有限公司生产。

步骤（4）中所述成苗培养基最佳配方为1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.3mg/L+AC1.0 g/L+香蕉汁100g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH为5.8。

步骤（5）中所述移栽季节为每年的2~3月份或者9~10月份，以阴凉的天气为佳。移栽前不需要经过专门的炼苗处理,可直接出瓶移栽。

本发明的优点在于：本方法以自然日光为光源，结合人工授粉、无菌播种和优选获得的培养基配方，建立了金线莲自然光培养一步成苗组培快速高产繁殖技术体系。该方法具有生长周期短、生产成本低、品质好、可规模化生产种苗的特点；采用该方法人工授粉金线莲成功率高达80%，能获得大量优质蒴果；从播种到组培苗出瓶移栽只需180d，期间不需人工转接；利用自然日光为光源和使用天然有机添加物和较低浓度的植物生长调节剂，培养出的金线莲组培苗粗壮、抗性好，不需专门的炼苗就可直接移栽，且移栽成活率高达90%以上。另外，利用自然光照种苗健壮，避免了变异和衰退等问题的发生，有利于保持种苗的优良性状，提高了种苗使用的安全性。

另外，本发明方法操作简便，稳定高效，能显著缩短培养周期和降低金线莲组培苗生产成本，便于大规模工厂化生产应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例步骤。

实施例1

（1）建造全自然光培养室：

建造铝合金框架玻璃墙顶房屋式全自然光培养室，屋顶和四周安装有遮阳降温设施，全自然光培养室与组培接种实验室由专用通道相通，培养室内部摆放培养架，可利用组培苗生产大楼楼顶的空间建造全自然光培养室；

（2）收集金线莲种源并进行人工授粉：

通过野外采集和走访药农，采集、购买或交换获得金线莲种质资源，引种到种质圃内进行种植保存，登记种质来源并观测其特性，包括种质原生地域、植株大小和形状、叶片的色泽、引种适应性、人工授粉结实率等指标；

在上午8~10点，选取开放1~3 d的花朵，用牙签取其蕊柱上呈浅黄色、具有黏性的花粉块置于亲本花的柱头蕊腔内，授粉方式为居群内自花、异花或异株授粉，授粉后挂牌标记，24h内停止浇水，随着果实的成熟，颜色由红色逐渐向褐色转变，授粉结实率达到80%；

（3）灭菌消毒：采摘人工授粉后生长60d的金线莲蒴果，到自来水下用软毛刷洗去表面灰尘和脏物，然后移至超净工作台内进行无菌操作，先放入75%酒精中浸泡30s后，转入0.1%HgCl₂ 溶液中消毒10 min，期间不断摇动，无菌水漂洗5遍，用无菌滤纸吸干材料表面水分；

（4） 一步成苗培养：将经外表灭菌处理后的蒴果纵向剖开，将里面细小的种子取出，均匀稀疏地播种到一步成苗培养基1/2MS+NAA0.3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉汁100g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L上，pH为5.8，置于温度25~28℃的黑暗条件下培养1d，然后转移到全自然光培养室中的培养架上，利用遮阳网避免太阳直射，在温度23~27℃的条件下，培养20d，种子萌发膨大形成白色原球茎，萌发率为33.0%。继续培养，原球茎逐渐分化成小苗并不断长高，培养到180d时，平均株高为5.8cm，植株生长健壮，叶片厚实，生根率为85%；

（5）出瓶移栽

将生长健壮的试管苗从瓶中取出，小心地将根部附着的培养基洗净，待植株表面水分稍干便可种植，以腐殖土和塘泥按1:1混合作为移栽基质，移栽后保持温度为22~28℃，湿度为75%~80%，成活率达到90%，长势良好。

实施例2

重复实施例1步骤（1）、（2），不同的是：

（3）灭菌消毒：以人工授粉后生长75d的金线莲蒴果为外植体材料，经灭菌消毒处理；

（4）一步成苗培养：

将经灭菌消毒处理的蒴果，取出内部的种子，播种到一步成苗培养基1/2MS+NAA 0.3mg/L+6-BA 0.3 mg/L+AC1.0 g/L+香蕉汁100g/L+蔗糖20g/L +琼脂6.0g/L上，pH为5.8，置于温度25~28℃的黑暗条件下培养1d，然后转移到全自然光照培养室内培养，利用遮阳网避免太阳直射，在温度23~27℃的条件下，培养25d，种子萌发形成白色原球茎，萌发率为66.7%。继续培养，原球茎逐渐分化成小苗并不断长高，培养到180d时，平均株高为6.0cm，植株生长健壮，叶片厚实，生根率为90%；

（5）出瓶移栽

将生长健壮的试管苗小心地从瓶中取出，将根部附着的培养基洗净，待植株表面水分稍干便可种植，以泥炭土作为移栽基质，移栽后保持温度为22~28℃，湿度为75%~80%，成活率达到95%，长势良好。

实施例3

重复实施例1步骤（1）、（2），不同的是：

（3）灭菌消毒：以人工授粉后生长90d的金线莲蒴果为外植体材料，经灭菌消毒处理；

（4）一步成苗培养：

将经灭菌消毒处理的蒴果，取出内部的种子，播种到一步成苗培养基1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA 0.3 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉汁100g/L+蔗糖 20g/L +琼脂6.0g/L上，pH为5.8，置于温度25~28℃的黑暗条件下培养1d，然后转移到全自然光照培养室内培养，利用遮阳网避免太阳直射，在温度23~27℃的条件下，培养30d，种子萌发形成白色原球茎，萌发率为74.4%。继续培养，原球茎逐渐分化成小苗并不断长高，培养到180d时，平均株高为6.1cm，植株生长健壮，叶片厚实，根系发达，生根率为100%；

（5）出瓶移栽

将生长健壮的试管苗从瓶中取出，小心地将根部附着的培养基洗净，待植株表面水分稍干便可种植，以泥炭土作为移栽基质，移栽后保持温度为22~28℃，湿度为75%~80%，成活率达到95%以上，长势良好。

下面表1 显示实例1至3中不同的蒴果成熟度及培养基配方对萌发和一步成苗生长的影响。

表1 不同蒴果成熟度和培养基对萌发和生长得影响

从表1可以看出,人工授粉后生长60ｄ和75d的金线莲种子为白色团块状，虽未完全成熟，但播种后也能萌发，且萌发所需时间短，为20~25d左右，其中授粉后生长60d的种子仅少部分萌发，萌发率为33.0%，授粉后生长75ｄ的种子萌发率提高为66.7%；授粉后生长90ｄ的金黄色丝状种子，萌发所需时间略长，为30d左右，但萌发率高达74.4％，且长出的原球茎健壮，分化成苗快。因此，综合种子萌发率和萌发后生长情况来看，金线莲无菌播种外植体材料应采用授粉后生长90 d左右的蒴果为最佳。

实施例1-3，一步成苗培养基所采用的基本培养基和有机添加物相同，植物生长调节剂使用浓度略有差异，均能实现金线莲的萌发、分化和生根一步培养，其中1/2MS+NAA0.5 mg/L +6-BA 0.3 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉汁 100 g/L+蔗糖 20 g/L+琼脂 6.0 g/L培养基上种子的萌发率略高，分化、壮苗和生根培养效果更好，平均株高为6.1cm，生根率达到100%，因此，确定金线莲一步成苗最佳培养基配方为1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.3 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉汁100 g/L+蔗糖 20 g/L +琼脂 6.0g/L。

Claims (6)

1.一种利用自然光培养一步成苗高效繁殖金线莲的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）建造全自然光培养室：建造铝合金框架玻璃墙顶房屋式全自然光培养室，屋顶和四周安装有遮阳降温设施，全自然光培养室与组培接种实验室由专用通道相通，培养室内部摆放培养架；

（2）收集金线莲种源并进行人工授粉：通过野外采集获得金线莲种质资源，引种到种质圃内进行种植保存，待花朵开放后，在上午8~10点，选取开放1~3d的花朵，取其蕊柱上呈浅黄色、具有黏性的花粉块置于亲本花的柱头蕊腔内，授粉方式为居群内自花、异花或异株授粉，24h内停止浇水并挂牌标记；

（3）灭菌消毒：采摘人工授粉后生长60~90d的金线莲蒴果，到自来水下用软毛刷洗去表面灰尘和脏物，然后移至超净工作台内进行无菌操作，先放入75%酒精中浸泡30s后，转入0.1% HgCl₂ 溶液中消毒10 min，期间不断摇动，无菌水漂洗5遍，用无菌滤纸吸干材料表面水分；

（4）一步成苗培养：将经外表灭菌消毒处理后的蒴果纵向剖开，将里面细小的种子取出，均匀稀疏地播种到一步成苗培养基上，置于温度25~28℃的黑暗条件下培养1d，然后转移到全自然光培养室中的培养架上，保持温度23~27℃条件下培养30d，种子萌发形成原球茎，再分化生长为小苗，之后长出根系，培养180 d后形成完整植株；

（5）出瓶移栽：经过成苗培养的健壮大苗，待根系生长发达后，在移栽季节，进行出瓶移栽。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（1）中所建自然光培养室内部摆放培养架，培养架间距为80~100cm。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（3）中所述金线莲蒴果为无病虫侵害、未开裂的健壮饱满的蒴果。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（4）中成苗培养基配方为1/2MS+NAA0.3-0.5 mg/L +6-BA 0.3-0.5 mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉汁100g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH为5.8。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（4）中成苗培养基配方为1/2MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.3mg/L+AC 1.0 g/L+香蕉汁100g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.0g/L，pH为5.8。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤（5）中所述移栽季节为每年的2~3月份或者9~10月份，以阴凉的天气为佳。