CN112293251A - 一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，包括将消毒灭菌处理后的滇北球花报春叶片外植体接种于培养基A中培养，在光照度1800‑2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下进行愈伤组织诱导和丛芽发生培养；30d后将诱导出的丛生芽转接于新鲜的A培养基中培养，30d后不定芽增殖系数达20.00左右。待增殖丛生芽高5‑8cm时，单苗接入培养基B中培养25‑30d后获得苗壮根粗的生根苗，然后将该生根苗移栽。本发明成本低、周期短、试管苗质量和成活率高，为保护野生资源、优质种苗繁育提供了技术支撑，可在短时间内生产基因型背景一致的优良种苗。
Description
技术领域
本发明涉及中草药繁殖技术领域，具体为一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法。
背景技术
滇北球花报春(Primula denticulata)为报春花科(Primulaceae)报春花属(Primula)多年生草本，滇北球花报春花葶通常较粗壮，长达叶丛的6倍以上，花冠亦稍大，分布区与原亚种不连接。花期3-4月，果期4月。产于云南，四川西部等地。生于山坡草地和灌丛中，海拔1500-3000米。
滇北球花报春为野洋参的基原植物，又名米伞花(贵州民间药物)、报春花(云南中草药)，以其根入药，具有补虚，消疳，通乳的功效。主治虚劳咳嗽，病后体虚，小儿疳积，乳汁不下等症；在《生草药性备要》、《贵州草药》、《全国中草药汇编》中均指出其具有行气血、消肿毒、止痛功效，主治胃痛、腹痛、痛风、骨折、跌打损伤、痈疖肿痛、皮肤溃疡等症。
近年来，随着人们对它的需求，加上野外生境的破坏，滇北球花报春资源锐减，严重限制了对其研究开发工作的进行。滇北球花报春通常以其种子为繁殖单位。但种子萌发率低，实生苗生长缓慢且生物量较小、后代变异大，并受到萌发季节的限制，难以进行规模化、标准化(基因型背景一致)种植和高药效品种的大面积推广。因此，需要寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来的高效人工繁殖方法来扩大滇北球花报春种苗的繁殖量，进行其高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，以解决滇北球花报春通常以其种子为繁殖单位，存在萌发率低，实生苗生长缓慢且生物量较小、后代变异大，并受到萌发季节的限制，难以进行规模化、标准化种植，高药效品种难以大面积推广的问题。
根据本发明的目的，本发明提供如下技术方案：
一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，包括将消毒灭菌处理后的叶片外植体经愈伤组织诱导、丛生芽发生同步诱导、丛生芽增殖、不定根诱导和驯化移栽过程，具体包括如下步骤：
步骤1：外植体的获取
选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其当年生叶片；
步骤2：消毒处理
将步骤1获取的叶片进行消毒处理；
步骤3：愈伤组织诱导和丛生芽发生培养
将经过步骤2消毒灭菌好的叶片接入培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行愈伤组织诱导和丛生芽发生；
步骤4：丛生芽增殖培养
将步骤3中培养的丛生芽转入新鲜的培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行丛生芽增殖培养；
步骤5：
取步骤4丛芽中的健壮主苗接种于下列培养基B中，控制光照度、温度、光照时间的条件下获得苗壮根粗的生根苗；
步骤6：炼苗和移栽。
进一步地，步骤1中所述叶片进行消毒处理的方法为：
流水洗净后用质量比为10％洗衣粉溶液浸泡5min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；
用体积比75％乙醇溶液浸泡3-5s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒5min，期间不断摇晃瓶身以达到最佳灭菌效果，最后无菌水冲洗5次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水，最终得到消毒灭菌处理的外植体。
进一步地，步骤3中和步骤4中，所述A培养基包括以下原料：
MS培养液
进一步地，所述A培养基的pH值为5.6-5.8。
进一步地，所述B培养基，包括以下原料：
1/2MS培养液
蔗糖 15000mg/L
琼脂粉 4800mg/L。
进一步地，所述B培养基的pH值为5.6-5.8。
进一步地，步骤6中，炼苗和移栽的方法如下：
取步骤5的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d，打开瓶盖露苗2d，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡3-5min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，即得移栽苗。
进一步地，步骤3-步骤5中，培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8-10h/d，温度控制在20±1℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，利用组织培养技术，可进行周年工厂化连续生产，生产效率高，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点。利用滇北球花报春叶片为外植体，材料易得，且愈伤组织诱导和丛生芽发生同步进行，大大缩短了培养周期，十分便于下一步的生产安排。
2、本发明一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，增殖速度快，增殖系数大，以带不定丛生芽的愈伤组织为中间繁殖体，25-30d为一个培养周期，繁殖系数达20.0以上。可使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，解决了传统种子繁殖后代分离大、性状不稳定而导致的种苗品质不一的难题。
3、本发明一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，对滇北球花报春人工繁殖体系进行了优化，在同一培养基中，可同时进行愈伤组织诱导、不定丛生芽发生和增殖培养，简化了培养程序；在无菌体系建立后，整个快速繁殖过程只需2种培养基就解决了叶片外植体—脱分化出现愈伤组织—不定丛生芽发生—不定丛生芽增殖—不定根诱导的过程，十分利于安排生产计划。
4、本发明一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，不定根诱导过程未出现愈伤组织，根与基茎间直接有维管束相连，故移栽成活率高。为保护滇北球花报春野生资源和发展人工种植奠定技术基础，同时将优良性状固定下来，可提供基因型背景一致的优质种苗以满足大面积推广种植的需求。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对发明的限制。在附图中：
图1为滇北球花报春叶片诱导愈伤组织及丛生芽培养过程图；
图2为滇北球花报春愈伤组织增殖及丛生芽增殖过程图；
图3为滇北球花报春生根培养过程图；
图4为滇北球花报春炼苗与移栽过程图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1、图2、图3和图4所示，一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其当年生叶片并去除叶柄。
2、将步骤1的叶片流水洗净后用质量比为10％洗衣粉溶液浸泡5min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；用体积比75％乙醇溶液浸泡3s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒5min，最后无菌水冲洗5次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。
3、愈伤组织诱导和丛生芽发生培养：将经过步骤2消毒灭菌好的叶片接入下列培养基A中：
MS培养液
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下进行愈伤组织诱导和丛生芽发生培养。培养5d后叶片卷曲且伤口处开始膨大发黄，10d后叶片外植体伤口处分化出质地紧密的愈伤组织、且部分已诱导出绿色锥形的小芽点，其愈伤组织诱导率达90.00％；20d后愈伤组织不断增殖，绿色芽点迅速生长；30d可见致密的绿色丛生芽，且不断增殖出更多芽点，愈伤组织诱导丛芽发生率可达100.00％。
4、丛生芽增殖培养：将步骤3中培养的丛生芽按4个芽点、基部带1cm×1cm大小愈伤组织转入新鲜的培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行丛生芽增殖培养；
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养7d后愈伤组织增殖迅速，表面分化出绿色芽点；15d后愈伤组织分化出绿色芽丛；20d后芽丛迅速生长，生长为绿色丛生芽；28d后丛生芽长大为紧密且绿色的丛苗,其增殖系数为20.67；
5、取步骤4丛芽中高3-4cm的健壮主苗接种于下列培养基B中：
1/2MS培养液
蔗糖 15000mg/L
琼脂粉 4800mg/L
pH 5.6
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养30d获得苗壮根粗的生根苗，其生根率可达100％。
6、炼苗和移栽：取步骤5长至6cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒3min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率可达100％。
实施例2
如图1、图2、图3和图4所示，一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其当年生叶片并去除叶柄。
2、将步骤1的叶片流水洗净后用质量比为10％洗衣粉溶液浸泡5min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；用体积比75％乙醇溶液浸泡3s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒5min，最后无菌水冲洗5次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。
3、愈伤组织诱导和丛生芽发生培养：将经过步骤2消毒灭菌好的叶片接入下列培养基A中：
MS培养液
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下进行愈伤组织诱导和丛生芽发生培养。培养5d后叶片卷曲且伤口处开始膨大发黄，10d后叶片外植体伤口处分化出质地紧密的愈伤组织、且部分已诱导出绿色锥形的小芽点，其愈伤组织诱导率达91.50％；20d后愈伤组织不断增殖，绿色芽点迅速生长；30d可见致密的绿色丛生芽，且不断增殖出更多芽点，愈伤组织诱导丛芽发生率可达100.00％。
4、丛生芽增殖培养：将步骤3中培养的丛生芽按5个芽点、基部带1cm×1cm大小愈伤组织转入新鲜的培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行丛生芽增殖培养；
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养7d后愈伤组织增殖迅速，表面分化出绿色芽点；15d后愈伤组织分化出绿色芽丛；20d后芽丛迅速生长，生长为绿色丛生芽；28d后丛生芽长大为紧密且绿色的丛苗,其增殖系数为19.97；5、取4步骤丛芽中高3-4cm的健壮主苗接种于下列培养基B中：
1/2MS培养液
蔗糖 15000mg/L
琼脂粉 4800mg/L
pH 5.8
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养30d获得苗壮根粗的生根苗，其生根率可达100％。
6、炼苗和移栽：取步骤5长至7cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒4min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率可达100％。
实施例3
如图1、图2、图3和图4所示，一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其当年生叶片并去除叶柄。
2、将步骤1的叶片流水洗净后用质量比为10％洗衣粉溶液浸泡5min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；用体积比75％乙醇溶液浸泡3s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒5min，最后无菌水冲洗5次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水。在整个消毒过程中充分摇动器皿。
3、愈伤组织诱导和丛生芽发生培养：将经过步骤2消毒灭菌好的叶片接入下列培养基A中：
MS培养液
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下进行愈伤组织诱导和丛生芽发生培养。培养5d后叶片卷曲且伤口处开始膨大发黄，10d后叶片外植体伤口处分化出质地紧密的愈伤组织、且部分已诱导出绿色锥形的小芽点，其愈伤组织诱导率达90.50％；20d后愈伤组织不断增殖，绿色芽点迅速生长；30d可见致密的绿色丛生芽，且不断增殖出更多芽点，愈伤组织诱导丛芽发生率可达100.00％。4、丛生芽增殖培养：将步骤3中培养的丛生芽按6个芽点、基部带1cm×1cm大小愈伤组织转入新鲜的培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行丛生芽增殖培养；
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养7d后愈伤组织增殖迅速，表面分化出绿色芽点；15d后愈伤组织分化出绿色芽丛；20d后芽丛迅速生长，生长为绿色丛生芽；28d后丛生芽长大为紧密且绿色的丛苗,其增殖系数为21.35；
5、取4步骤丛芽中高7cm的健壮主苗接种于下列培养基B中：
1/2MS培养液
蔗糖 15000mg/L
琼脂粉 4800mg/L
pH 5.6
培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间0h/d，温度控制在20±1℃的条件下，培养30d获得苗壮根粗的生根苗，其生根率可达100％。
6、炼苗和移栽：取步骤5长至8cm高的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d后，打开瓶盖，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒5min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，生长30d后，即得移栽苗，成活率可达100％。
上述实施例中，图1中：A叶片接入A培养基中5d时的变化图；B为接种10d后从叶片伤口处分化出致密的愈伤组织图；C为接种20d后叶片愈伤组织分化出绿色的小芽点图；D为30d后生长成绿色丛生芽图。
图2中：A为培养7d后愈伤组织增殖迅速，表面分化出绿色芽点图；B为培养15d后的愈伤组织及不定丛生芽图；C为培养20d后的不定丛生芽图；D为培养28d时的增殖瓶苗图。
图3中：A为培养10d，不定根出现图；B为培养15d后不定根迅速生长图试管苗图，未见有愈伤组织产生图；C为培养25d后的生根图；D为培养30d后的生根试管苗，整个培养过程未见愈伤组织图。
图4中：A为瓶苗炼苗5d图；B为瓶苗掲膜后炼苗2d图；C为移栽后套膜10d图；D为取膜3d后图；E为取膜15d后图。
上述实施例中，采用的技术原理说明如下：
1、本发明采用叶片作为外植体，在不破坏资源的情况下，容易得到大量外植体材料。
2、本发明繁殖系数高，真正达到了快速繁殖的目的。
3、本发明在在同一培养基中，可同时进行愈伤组织诱导、丛生芽发生和增殖，简化了培养程序；整个快速繁殖过程只需2种培养基就解决了从外植体脱分化形成愈伤组织、愈伤组织再分化为丛生芽、丛生芽增殖到不定根诱导过程，大大缩短了育苗周期。
4、本发明在不定根诱导过程中，无愈伤组织产生，不定根与试管苗维管束直接相连，达到了试管苗移栽的高成活率目标。
5、本发明提供的滇北球花报春人工高效繁殖方法成本低、时间短、质量和成活率高；该方法可扩大滇北球花报春种苗的繁殖量，进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，其特征在于，包括将消毒灭菌处理后的叶片外植体经愈伤组织诱导、丛生芽发生同步诱导、丛生芽增殖、不定根诱导和驯化移栽过程，具体包括如下步骤：
步骤1：外植体的获取
选择生长势好、无病虫害、无畸形的健壮植株，取其当年生叶片；
步骤2：消毒处理
将步骤1获取的叶片进行消毒处理；
步骤3：愈伤组织诱导和丛生芽发生培养
将经过步骤2消毒灭菌好的叶片接入培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行愈伤组织诱导和丛生芽发生；
步骤4：丛生芽增殖培养
将步骤3中培养的丛生芽转入新鲜的培养基A中，控制光照度、温度、光照时间的条件下进行丛生芽增殖培养；
步骤5：
取步骤4丛芽中的健壮主苗接种于下列培养基B中，控制光照度、温度、光照时间的条件下获得苗壮根粗的生根苗；
步骤6：炼苗和移栽。
2.根据权利要求1所述的一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，其特征在于，步骤1中所述叶片进行消毒处理的方法为：
流水洗净后用质量比为10％洗衣粉溶液浸泡5min，流水冲洗30min后置于超净工作台中；
用体积比75％乙醇溶液浸泡3-5s，然后用质量比为0.1％的升汞水溶液消毒5min，期间不断摇晃瓶身以达到最佳灭菌效果，最后无菌水冲洗5次，每次不低于3min，置于滤纸上吸干残留无菌水，最终得到消毒灭菌处理的外植体。
3.根据权利要求1所述的一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，其特征在于，步骤3中和步骤4中，所述A培养基包括以下原料：
4.根据权利要求1所述的一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，其特征在于，所述A培养基的pH值为5.6-5.8。
5.根据权利要求1所述的一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，其特征在于，所述B培养基，包括以下原料：
1/2MS培养液
蔗糖 15000mg/L
琼脂粉 4800mg/L。
6.根据权利要求1所述的一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，其特征在于，所述B培养基的pH值为5.6-5.8。
7.根据权利要求1所述的一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，其特征在于，步骤6中，炼苗和移栽的方法如下：
取步骤5的生根苗，连培养瓶一起置于室温下炼苗3d，打开瓶盖露苗2d，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡3-5min后，移栽至消毒后的腐殖质中保温保湿培养，即得移栽苗。
8.根据权利要求1所述的一种滇北球花报春人工高效繁殖的方法，其特征在于，步骤3-步骤5中，培养条件：在光照度1800-2300lx，光照时间8-10h/d，温度控制在20±1℃。
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