CN112753575A - 一种高产双叶杜鹃兰种苗培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，包括如下步骤：获取双叶杜鹃兰纯种果荚，对双叶杜鹃兰的外种皮进行软化处理，消毒杀菌，得无菌杜鹃兰种子，播种到特定的萌发培养基中进行萌发培养获得淡黄色原球茎，再转入增殖培养基中进行增殖培养获得绿色增殖原球茎，且绿色增殖原球茎的增殖表面出现白色绒毛，将绿色增殖原球茎转入发芽培养基中进行分化发芽培养获得根部假鳞茎膨大且分化有簇生芽和一对叶片的无根幼苗，再转移至生根培养基中进行生根培养，获得根部假鳞茎膨大且生长有3～5条根须的组培种苗。该培育方法能够获得大量高产的双叶杜鹃兰驯化苗。

Description

一种高产双叶杜鹃兰种苗培育方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种高产双叶杜鹃兰种苗培育方法。

背景技术

杜鹃兰，多年生兰科草本植物，假鳞茎呈不规则扁球形或圆锥形，顶端渐突起，基部有须根痕，长1.8～3厘米，膨大部直径1～2厘米。叶通常1枚，生于假鳞茎顶端，狭椭圆形、近椭圆形或倒披针状狭椭圆形。花葶从假鳞茎上部节上发出，近直立，总状花序，多少下垂，不完全开放，有香气，蒴果近椭圆形，每个蒴果含1200～2000枚细小种子。花期5～6月，果期9～12月。杜鹃兰作为兰科植物，种子多，但种胚发育不成熟，缺少胚乳，种皮双层，外种皮不易吸水，造成种子在自然条件下很难萌发。

杜鹃兰具有很高的药用价值和观赏价值，但是自然储量极少，同时市场高价诱惑促使杜鹃兰野生资源无序采挖，导致野生杜鹃兰资源濒危灭绝。

目前，杜鹃兰的人工种植主要依靠在特定的培养环境中对杜鹃兰一年生假鳞茎进行分株繁殖(杜鹃兰在自然状况下主要依靠假鳞茎繁殖，一个假鳞茎每年只生长一个新的假鳞茎，且新假鳞茎生长后分泌一种特殊物质抑制原来老假鳞茎的发芽)，该培育方法存在繁殖率低，无法在短时间内形成种植规模，并且耗费大量杜鹃兰野生资源，加大杜鹃兰名贵珍稀中药材的供应短缺。

专利文献“一种杜鹃兰育苗方法”(专利号：CN201710052795.4)公开了一种能够大大缩短育苗周期的杜鹃兰育苗方法，该方法虽然缩短了育苗周期，但杜鹃兰种子萌发率低，直接进入生根培育获得的完整植株更少，不利于规模化育苗生产。发明人团队经过实践该方法，杜鹃兰种子直接萌发并形成完整植株极少。

专利文献“一种加快杜鹃兰种子萌发的方法”(专利号：201711119058.8)以及“一种促进杜鹃兰种子萌发的方法”(专利号：CN201711119121.8)公开了采用中药提取物配置消毒液对种子进行消毒，并加入枸杞叶汁、辣木叶汁和黄秋葵汁等为种子萌发提供营养，以NAA和GGR6作为生长素，以促进种子萌发。发明人团队采用该方法的实践中发现，杜鹃兰种子消毒可以常规处理，杜鹃兰种子由双种皮构成，外种皮不易吸水，导致内种皮和种胚获取不了水分不能萌发，突破不了外种皮导致萌发极少或失败。

专利文献“一种诱导杜鹃兰原球茎牙簇增殖的方法”(专利号：CN201610578050.7)公开了一种芽簇诱导培养基为：以不含蔗糖的1/4MS、1/2MS或MS为基本培养基，分别添加TDZ 1.5～2.5mg·L-1+NAA0.1～0.3mg·L-1+蔗糖10～30g·L-1+琼脂5.5g·L-1。发明人团队采用该方法实践中发现，该方法诱导杜鹃兰原球茎出芽迅速、增殖率高，但存在植株叶片畸形、假鳞茎膨大异常、生根困难的弊端，无法得到大量健康杜鹃兰幼苗。

上述文献提供的杜鹃兰种子萌发、增殖、生根方法，主要适用于杜鹃兰的种苗繁殖实验，对规模化杜鹃兰种苗繁殖需要进一步研究，包括杜鹃兰种子萌发率、原球茎增殖率、诱导发芽率都有待优化提高。特别是对杜鹃兰高产品种筛选，可大大提高种植产量和经济效益，以解决珍稀名贵中药材的供需矛盾。

发明内容

基于此，有必要提供一种高产双叶杜鹃兰种苗培育方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，包括如下步骤：获取双叶杜鹃兰纯种果荚；对所述双叶杜鹃兰纯种果荚内的种子外种皮进行软化处理，消毒杀菌，得无菌杜鹃兰种子；将所述无菌杜鹃兰种子播种到萌发培养基中进行萌发培养，获得淡黄色原球茎；其中，所述萌发培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的MS培养基：

将所述淡黄色原球茎转入增殖培养基中进行增殖培养，获得绿色增殖原球茎，且所述绿色增殖原球茎的增殖表面出现白色绒毛；将所述绿色增殖原球茎团块分割成繁殖原球茎小块，转入分化发芽培养基中进行分化发芽培养，获得根部膨大且分化有簇生芽和一对叶片的无根幼苗；将所述无根幼苗转移至生根培养基中进行生根培养，获得根部假鳞茎膨大且生长有3～5条根须的组培种苗。

进一步地，所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法还包括对所述根部假鳞茎膨大且生长有3～5条根须的组培种苗进行大棚驯化炼苗的步骤。

在其中一些实施例中，所述萌发培养的参数条件为：培养室温度23℃～25℃，湿度60％～80％，光照强度2500LX～3000LX，光照时间8h～10h，培养时间60天～80天。

在其中一些实施例中，所述增殖培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的MS培养基：

在其中一些实施例中，所述增殖培养的参数条件为：培养室日间温度23℃～25℃，夜间温度20℃～23℃，湿度60％～80％，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10h～12h，培养时间40天～50天。

在其中一些实施例中，所述分化发芽培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的1/2MS培养基：

在其中一些实施例中，所述分化发芽培养的参数条件为：培养室日间温度23℃～25℃，夜间温度20℃～23℃，湿度60％～80％，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10h～12h，培养时间40天～50天。

在其中一些实施例中，所述生根培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的1/2MS培养基：

在其中一些实施例中，所述生根培养的参数条件为：培养室日间温度23℃～25℃，夜间温度20℃～23℃，湿度60％～80％，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10h～12h，培养时间40天～50天。

在其中一些实施例中，所述繁殖球茎小块的尺寸大小为(0.3～0.7)cm×(0.3～0.7)cm。

本发明的有益效果是：

本发明的双叶杜鹃兰种苗培育方法通过对双叶杜鹃兰纯种果荚的外种皮进行软化处理，置于特定组成的萌发培养基中进行萌发培养，获得淡黄色原球茎。再依次经增殖培养、分化发芽培养基以及生根培养，可以获得根部膨大且生长有3～5条根须的组培双叶杜鹃兰种苗。该双叶杜鹃兰种苗培育方法可批量获得高产的双叶杜鹃兰种苗，供种植户大面积及推广，可大大提高提高产量和种植效益，逐步解决该品种名贵珍稀中药材的供需矛盾。

附图说明

图1为两年生单叶杜鹃兰与双叶杜鹃兰植株对比图。

图2为实施例1双叶杜鹃兰种苗培育方法中的生长发育图；其中:

(a)为经软化消毒处理好的双叶杜鹃兰种子的照片；

(b)为双叶杜鹃兰种子萌发过程中的照片；

(c)为双叶杜鹃兰原球茎分化发芽中过程中的照片；

(d)双叶杜鹃兰生根培养过程中的照片。

图3为对比例2中杜鹃兰原球茎分化发芽过程中的照片。

图4为对比例3中杜鹃兰原球茎分发芽过程中的照片。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

首先，值得说明的是，发明人团队长期针对野生杜鹃兰和人工培植杜鹃兰的研究中发现：采集野生杜鹃兰过程中发现极少量杜鹃兰叶2枚对生，假鳞茎长达到2.5～4厘米，膨大部直径2～3厘米。

在同等等栽培条件下，2年生双叶杜鹃兰平均单株产量比单叶杜鹃兰高30％～40％，并具有显著的抗逆性。经专业机构检测，双叶杜鹃兰比单叶杜鹃兰中所含生物碱和部分有机化合物的含量也有不同程度的提高。

另外，每年3～4月份，杜鹃兰新叶萌发季节，武当山区域内采集野生健壮的双叶杜鹃兰植株移栽在海拔800～1200米防虫纱网防护的遮阴棚内，周边300米范围内无杜鹃兰种植或野生分布，配置适宜杜鹃兰生长的专用营养土(林下腐殖土：沙壤土：珍珠岩：有机肥＝5:3:1:1)，做好日常管理。5～6月双叶杜鹃兰开花季节，采用人工授粉方式对杜鹃兰异株授粉，并适当疏果，每株保留8～10个健壮果荚。11月中旬，杜鹃兰果荚逐步成熟，选择健壮饱满的果荚作为双叶杜鹃兰种子繁殖材料。

本发明中马铃薯煮熟滤液的获取方法：将马铃薯去皮切片，置于3倍重量的纯净水中煮沸8-15分钟，用80目纱网过滤获取滤液。

下面结合具体实施例进行举例说明。

实施例1

本实施例提供一种双叶杜鹃兰种苗培育方法，包括如下步骤：

S1，获取外种皮软化处理且经消毒杀菌的无菌杜鹃兰种子。

本步骤具体包括如下处理过程：

(1)将驯化基地采集的双叶杜鹃兰果荚(双叶杜鹃兰种子繁殖材料)用自来水冲洗表面污迹，用洗衣服水浸泡20min，轻轻用软布擦洗，流水冲洗10min，晾干备用。

(2)将晾干的双叶杜鹃兰果荚用手术刀纵切取出细小双叶杜鹃兰种子，适量装入用无纺布制作的专用种子消毒袋内，采用封口机封口待用。

(3)将1mol/mLNaOH溶液缓缓加入500mL蒸馏水中配置外种皮软化溶液，将pH值调整到PH 9～10。加入2～3滴吐温80增加溶液渗透性，将盛装溶液的烧杯放入水浴锅内，温度设置40℃，把封装好的双叶杜鹃兰种子放入溶液中，让种子完全浸透。处理30min后，捞出种子装入消毒袋，用蒸馏水反复冲洗5-6次，放入事先消毒好的500mL烧杯内备用。

(4)将处理后的双叶杜鹃兰种子消毒袋置于超净工作台内，加入75％消毒酒精浸泡30～45s，用蒸馏水冲洗2～3次，放入0.1％氯化汞溶液，滴入2-3滴吐温80，不断搅动，让消毒液渗入消毒袋充分浸泡杜鹃兰种子，杀菌时间控制在10～15min，用无菌水冲洗4～6次；取出消毒袋放入经消毒过的无菌滤纸上，超净工作台开强风吹2～4h，至消毒袋内种子呈松散状即可进行后续接种操作。

采用含吐温的特定浓度的氢氧化钠溶液软化处理外种皮可提高外种皮吸水透水能力，进而加快内种皮种胚吸水膨胀速度，提高种胚膨胀突破外种皮形成原球茎的成功率，增加种子萌发率，缩短萌发时间。

S2，将无菌杜鹃兰种子播种到萌发培养基中进行萌发培养，获得淡黄色原球茎。

具体地，将经过消毒处理的无菌杜鹃兰种子置于超净工作台内，用手术刀划开消毒袋，用镊子轻轻将种子播种均匀到种子萌发培养基表面，置于培养室培养，培养室温度设置24±1℃，湿度60％～80％，光照强度2500LX～3000LX，光照时间8～10h。经过60～80天培养，种子萌发出淡黄色原球茎，有的开始变绿。

其中，种子萌发培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的MS培养基：

本步骤中的种子萌发培养基中NAA、ZT、6-BA按一定比例配比，可快速促进种子萌发，马铃薯煮熟滤液(马铃薯汁)可给萌发后形成的球茎提供丰富营养和维生素。

S3，将淡黄色原球茎转入增殖培养基中进行增殖培养，获得绿色增殖原球茎，且绿色增殖原球茎的增殖表面出现白色绒毛。

具体地，将步骤S1种子萌发取得的淡黄色原球茎需要立即转入原球茎增殖培养基继续培养，否则淡黄色原球茎会慢慢发黑导致死亡。增殖培养过程中，每瓶(350mL)均匀接种15～20粒，培养室温度设置日间23～25℃，夜间20～23℃，湿度60％～80％，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10～12h。经过45天培养，黄白色原球茎开始快速伸长变大，由淡黄色变成绿色，继而增殖表面出现白色绒毛，极少形成茎尖或叶片，增殖可达10-15倍。

其中，原球茎增殖培养基配方为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的MS培养基：

S4，将绿色增殖球茎团块分割成繁殖原球茎小块，转入分化发芽培养基中进行分化发芽培养，获得根部膨大且分化有簇生芽和一对叶片的增殖体。

具体地，将步骤S2增殖获得的绿色原球茎转入快速分化发芽培养基培养，要求将经过增殖后的原球茎团块分割成0.5cmx0.5cm左右小块(称“繁殖球茎小块”)，每瓶(350mL)接种7～9块，按原接触培养基的部位朝下均匀接种于快速分化发芽培养基培养表面，培养室温度设置日间23～25℃，夜间20～23℃，湿度60-80，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10～12h。经过60天培养，绿色增殖原球茎会分化出大量簇生芽，并形成一对叶片，根部膨大，有的生长1～2条根。

其中，原球茎分化发芽培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的1/2MS培养基：

S5，将增殖体转移至生根培养基中进行生根培养，获得根部假鳞茎膨大且生长有3～5条根须的双叶杜鹃兰种苗。

具体地，将经过步骤S4分化发芽培养的双叶杜鹃兰植株转接到生根培养基进行生根培养，要求清理干净苗株连带的原球茎愈伤组织。每瓶(650mL)均匀栽种20～25株，培养室温度设置23～25℃，湿度60％～80％，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10～12h。经过45天培养，双叶杜鹃兰根部假鳞茎逐步膨大，并生长3-5条根须，可转出培养室进行驯化培养。

其中，生根培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的1/2MS培养基：

S6，将双叶杜鹃兰种苗进行大棚驯化炼苗。

由于双叶杜鹃兰在每年7～9月是茎叶倒伏季节，3～5月和9～11月是双叶杜鹃兰最佳炼苗季节，将经过生根培养的移除培养室放置在遮阴75％大棚7天后揭开瓶盖，逐步适应外界环境。开盖后继续放置3天，让叶片适应大棚气候。用镊子轻轻取出双叶杜鹃兰组培苗，置入清水清洗干净植株上粘连的培养基，在阴凉处晾干水分分级移栽在事先处理好的炼苗基质(林下腐殖土：沙壤土：珍珠岩：有机肥＝5:3:1:1)上，浇足定根水。加强日常管理，大棚温度控制在20～25℃，空气湿度控制在60％～80％，栽培基质湿度控制在60％。经过80～120天培养，双叶杜鹃兰假鳞茎达到长1～1.5厘米，膨大部直径0.5～1厘米，即可移入自然环境下栽培。

对比例1

本对比例提供一种双叶杜鹃兰种苗培育方法，其步骤与实施例1基本相同，区别在于种子萌发培养基的配方不同。

在本对比例中，种子萌发培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的MS培养基：NAA 0.8mg/L～1.0mg/L、蔗糖3％以及琼脂6g/L。

对比例2

本对比例提供一种双叶杜鹃兰种苗培育方法，其步骤与实施例1基本相同，区别在于分化发芽培养基的配方不同。

在本对比例中，分化发芽培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的1/2MS培养基：6-BA 0.5mg/L～0.8mg/L、蔗糖3％以及琼脂6g/L。

对比例3

本对比例提供一种双叶杜鹃兰种苗培育方法，其步骤与实施例1基本相同，区别在于分化发芽培养基的配方不同。

在本对比例中，分化发芽培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的1/2MS培养基：TDZ 2mg/L、NAA0.2mg/L、蔗糖30g/L以及琼脂5.5g/L。

分别统计实施例1以及对比例1至3培育过程中双叶杜鹃兰种苗的成活及发育情况，统计结果见下表1：

表1双叶杜鹃兰种苗培育生长情况及成活率统计表

由表1可以看出，与对比例1至3相比，采用实施例1的双叶杜鹃兰种苗培育方法能够获得高种子萌发率、诱导发芽率以及生根率的双叶杜鹃兰植株。

双叶杜鹃兰植株的形成有异于其它兰科植物，很少由种子直接萌发形成植株，大多数种子萌发是先形成原球茎，在一定条件下原球茎才形成植株，6-BA、TDZ、NAA通过协同作用加速原球茎分化发芽，能够克服单独使用6-BA原球茎分化发芽率低、周期长等问题，也能够克服单独使用TDZ分化出芽迅速、植株畸形、生根困难的弊端，同时添加适量活性炭可吸附原球茎分化过程中产生的导致植株褐化抑制发芽的化合物。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取双叶杜鹃兰纯种果荚；

对所述双叶杜鹃兰纯种果荚的种子外种皮进行软化处理，消毒杀菌，得无菌杜鹃兰种子；

将所述无菌杜鹃兰种子播种到萌发培养基中进行萌发培养，获得淡黄色原球茎；其中，所述萌发培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的MS培养基：

将所述淡黄色原球茎转入增殖培养基中进行增殖培养，获得绿色增殖原球茎，且所述绿色增殖原球茎的增殖表面出现白色绒毛；

将所述绿色增殖原球茎团块分割成繁殖原球茎小块，转入分化发芽培养基中进行分化发芽培养，获得根部假鳞茎膨大且分化有簇生芽和一对叶片的无根幼苗；

将所述增殖无根幼苗转移至生根培养基中进行生根培养，获得根部假鳞茎膨大且生长有3～5条根须的组培种苗。

2.根据权利要求1所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，还包括对所述根部假鳞茎膨大且生长有3～5条根须的组培种苗进行大棚驯化炼苗的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，所述萌发培养的参数条件为：培养室温度23℃～25℃，湿度60％～80％，光照强度2500LX～3000LX，光照时间8h～10h，培养时间60天～80天。

4.根据权利要求3所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，所述增殖培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的MS培养基：

5.根据权利要求4所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，所述增殖培养的参数条件为：培养室日间温度23℃～25℃，夜间温度20℃～23℃，湿度60％～80％，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10h～12h，培养时间40天～50天。

6.根据权利要求1或2所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，所述分化发芽培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的1/2MS培养基：

7.根据权利要求6所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，所述分化发芽培养的参数条件为：培养室日间温度23℃～25℃，夜间温度20℃～23℃，湿度60％～80％，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10h～12h，培养时间40天～50天。

8.根据权利要求1或2所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，所述生根培养基为含有如下添加成分且pH值为5.6～6的1/2MS培养基：

9.根据权利要求8所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，所述生根培养的参数条件为：培养室日间温度23℃～25℃，夜间温度20℃～23℃，湿度60％～80％，光照强度3000LX～3500LX，光照时间10h～12h，培养时间40天～50天。

10.根据权利要求1或2所述的高产双叶杜鹃兰种苗培育方法，其特征在于，所述繁殖原球茎小块的尺寸大小为(0.3～0.7)cm×(0.3～0.7)cm。

Images