CN113615577A - 一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法,以杜鹃兰种子为材料,首先,在超净工作台上,将经灭菌处理的杜鹃兰蒴果,用无菌纸吸干表面水分,将蒴果切分成两半,将种子均匀撒播到培养基上(1/3MS+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L,pH值为6.0),加入灭菌过的种子发育促进剂(DMSO3%+GA0.1~1.0 mg/L+TDZ0.05~0.5 mg/L+IAA0.05~0.5 mg/L,pH值为6.0),种子发育一段时间后,再加入灭菌过的原球茎诱导剂(DA‑60.1~1.0 mg/L+CPPU0.05~0.5 mg/L+IBA 0.01~0.1 mg/L,pH值为6.0),11~15天时,小圆点开始形成具有1~5个原球茎的原球茎丛,30 d统计,原球茎的诱导率为100%,原球茎丛的诱导率为71.5%~95.7%。本发明方法具有操作简单、重复性好、安全高效等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体是一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法。
背景技术
杜鹃兰(Cremastra appendiculata (D. Don) Makino)为兰科多年生珍稀药用植物,系中药山慈菇的基源植物之一,收载于历年版《中华人民共和国药典》。以其干燥假鳞茎入药,具有清热解毒,润肺止咳,活血化瘀等功效。随着药理研究不断深入,杜鹃兰含有多种活性成分,具有抗肿瘤、抑菌、降血脂、降血糖等作用,倍受到国内外广泛关注。
杜鹃兰主产于四川、云南、贵州、广西等地,在甘肃南部、陕西等黄河以南大部分地区均有分布。虽然杜鹃兰分布范围广,但药理药效不断被挖掘,市场需求量不断增加,而杜鹃兰的自然繁殖速度极慢,导致野生资源问题日益严峻。在自然条件下,杜鹃兰种子结实率不到 5%,且种子无胚乳,种胚仅为一团未分化成熟的细胞,膜质内种皮不透水特性,致使种子在自然条件下难以萌发;杜鹃兰的假鳞茎成为其唯一的繁殖器官,但是每年仅由其一年生假鳞茎萌发 1 个芽,长成 1 个新的假鳞茎,逐年形成假鳞茎串,多年生的假鳞茎上的侧芽因受到抑制而未进行分枝生长,繁殖系数极低。
随着现代生物技术发展,植物组织培养技术应用于杜鹃兰中,由于杜鹃兰假鳞茎萌发芽的数量少、灭菌难过关,因此以种子播种获得无菌材料是杜鹃兰组培快繁中常用的外植体。可杜鹃兰种子无菌播种普遍存在萌发率不高、萌发时间长、原球茎的数量不多等问题。原球茎是许多兰科植物繁育途径,通过原球茎分化成芽,最后形成植株。在杜鹃兰的种子无菌播种过程中也经历原球茎途径,一般情况下,1颗种子只形成1个原球茎,但初代获得的原球茎越多,芽也会越多,种苗的生产成本才会更低,更具市场竞争力。
发明内容
本发明在杜鹃兰种子无菌播种阶段加入种子发育促进剂加快胚发育,再加入原球茎诱导剂增加原球茎的数量,探索出一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法。
实现本发明目的的技术方案是:
一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法,包括以下步骤:
(1)蒴果预处理:将杜鹃兰成熟的、无病虫害、无裂缝的蒴果用洗衣粉水(洗衣粉和水比例为1:10)浸泡10min,取出,再用流动清水清洗20min,沥干水,备用;
(2)蒴果灭菌处理:在超净工作台上,将步骤(1)中的杜鹃兰蒴果用75%乙醇溶液灭菌30 s,无菌水清洗1次,用0.1%升汞(HgCl2)灭菌12 min,无菌水清洗5次,滤干水,备用;
(3)无菌播种和胚发育:在超净工作台上,将步骤(2)中的杜鹃兰蒴果用无菌纸吸干表面水分,将蒴果切分成两半,将种子均匀撒播到培养基上,加入灭菌过的种子发育促进剂,摇匀,种子都浸泡着促进剂,暗培养7 天,弱光培5-10天,种子膨大;
所述培养基为:1/3MS+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L,pH值为6.0;
所述种子发育促进剂为:DMSO3%+GA0.1~1.0 mg/L +TDZ0.05~0.5 mg/L+IAA0.05~0.5 mg/L,pH值为6.0;
(4)原球茎培养:在超净工作台上,向步骤(3)的培养种子中加入灭菌过的原球茎诱导剂,4~8天,膨大的种子开始变成白色的小圆点,11天后小圆点开始陆续形成具有1~5个原球茎的原球茎丛,30 d统计,原球茎的诱导率为100%,原球茎丛的诱导率为71.5%~95.7%;
所述原球茎诱导剂为:DA-60.1~1.0 mg/L+CPPU0.05~0.5 mg/L+IBA0.01~0.1mg/L,pH值为6.0。
原球茎诱导剂中,DA-6为胺鲜酯,具有促进植物细胞的分裂和伸长,调节体内养分的平衡作用;CPPU为氯吡苯脲,促进细胞分裂,促进细胞扩大伸长;IBA为吲哚丁酸,具有促进细胞分化和分裂作用;这些植物生长调节剂的浓度组合诱导出杜鹃兰的原球茎丛。
种子发育促进剂中,DMSO为二甲基亚砜,为渗透剂,突破种皮障碍,将植物生长调节剂快速作用于胚细胞;GA为赤霉素,具有打破种子休眠、加速细胞分裂作用;TDZ为噻苯隆,具有促进细胞分裂生长、提高种子发芽率的作用;IAA为吲哚-3-乙酸 ,具有促进细胞分裂、促进发芽等作用;这些植物生长调节剂共同作用促进杜鹃兰种子胚细胞的分裂生长,加快胚成熟。
所述胚发育培养、原球茎诱导阶段的培养条件是:培养温度为25±1℃,光照时间为12 h/d,光照强度为1000 Lx。
培养基中,MS为基本培养基,植物生长调节剂试剂均为分析纯,水为蒸馏水。
本发明方法,以杜鹃兰种子为材料,在无菌播种的培养基上加入种子发育促进剂(DMSO、GA、TDZ和IAA),种子发育一段时间后,再加入原球茎诱导剂(DA-6、CPPU、IBA),30 d时统计,原球茎的诱导率为100%,原球茎的数量最高可达3.7个/颗种子。本发明方法具有操作简单、重复性好、安全高效等优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明,但不是对本发明的限定。
实施例1
一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法,包括以下步骤:
(1)蒴果预处理:将杜鹃兰成熟的、无病虫害、无裂缝的蒴果用洗衣粉水(洗衣粉和水比例为1:10)浸泡10 min,取出,再用流动清水清洗20 min,沥干水,备用;
(2)蒴果灭菌处理:在超净工作台上,将步骤(1)中的杜鹃兰蒴果用75%乙醇溶液灭菌30 s,无菌水清洗1次,用0.1%升汞(HgCl2)灭菌12 min,无菌水清洗5次,滤干水,备用;
(3)无菌播种和胚发育:在超净工作台上,将步骤(2)中的杜鹃兰蒴果用无菌纸吸干表面水分,将蒴果切分成两半,将种子均匀撒播到培养基上,加入灭菌过的种子发育促进剂,摇匀,种子都浸泡着促进剂,暗培养7 天,弱光培养7 天,种子稍有膨大;
所述培养基为:1/3MS+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L,pH值为6.0;
所述种子发育促进剂为:DMSO3%+GA0.1mg/L +TDZ0.05 mg/L+IAA0.05 mg/L,pH值为6.0;
(4)原球茎培养:在超净工作台上,向步骤(3)的培养种子中加入灭菌过的原球茎诱导剂,8天,膨大的种子开始变成白色的小圆点,15 天后小圆点开始陆续形成原球茎丛,30 d时统计原球茎数量为1.8个/颗种子,原球茎的诱导率为100%,原球茎丛的诱导率为71.5%;
所述原球茎诱导剂为:DA-60.1 mg/L+CPPU0.05 mg/L+IBA 0.01 mg/L,pH值为6.0。
步骤(3)所述胚发育和步骤(4)所述原球茎诱导阶段的培养条件是:培养温度为25±1℃,光照时间为12 h/d,光照强度为1000 Lx。
实施例2
一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法,包括以下步骤:
(1)蒴果预处理:将杜鹃兰成熟的、无病虫害、无裂缝的蒴果用洗衣粉水(洗衣粉和水比例为1:10)浸泡10 min,取出,再用流动清水清洗20 min,沥干水,备用;
(2)蒴果灭菌处理:在超净工作台上,将步骤(1)中的杜鹃兰蒴果用75%乙醇溶液灭菌30 s,无菌水清洗1次,用0.1%升汞(HgCl2)灭菌12 min,无菌水清洗5次,滤干水,备用;
(3)无菌播种和胚发育:在超净工作台上,将步骤(2)中的杜鹃兰蒴果用无菌纸吸干表面水分,将蒴果切分成两半,将种子均匀撒播到培养基上,加入灭菌过的种子发育促进剂,摇匀,种子都浸泡着促进剂,暗培养7 天,弱光培养7 天,种子膨大成黑色小圆点;
所述培养基为:1/3MS+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L,pH值为6.0;
所述种子发育促进剂为:DMSO3%+GA1.0 mg/L +TDZ0.5 mg/L+IAA0.5 mg/L,pH值为6.0;
(4)原球茎培养:在超净工作台上,向步骤(3)的培养种子中加入灭菌过的原球茎诱导剂,4天,膨大的种子开始变成白色的小圆点,11 天后小圆点陆续形成原球茎丛,30 d统计每颗种子平均形成3.1个原球茎,原球茎的诱导率为100%,原球茎丛的诱导率为83.6%;
所述原球茎诱导剂为:DA-61.0 mg/L+CPPU0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L,pH值为6.0。
步骤(3)所述胚发育和步骤(4)所述原球茎诱导阶段的培养条件是:培养温度为25±1℃,光照时间为12 h/d,光照强度为1000 Lx。
实施例3
一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法,包括以下步骤:
(1)蒴果预处理:将杜鹃兰成熟的、无病虫害、无裂缝的蒴果用洗衣粉水(洗衣粉和水比例为1:10)浸泡10 min,取出,再用流动清水清洗20 min,沥干水,备用;
(2)蒴果灭菌处理:在超净工作台上,将步骤(1)中的杜鹃兰蒴果用75%乙醇溶液灭菌30 s,无菌水清洗1次,用0.1%升汞(HgCl2)灭菌12 min,无菌水清洗5次,滤干水,备用;
(3)无菌播种和胚发育:在超净工作台上,将步骤(2)中的杜鹃兰蒴果用无菌纸吸干表面水分,将蒴果切分成两半,将种子均匀撒播到培养基上,加入灭菌过的种子发育促进剂,摇匀,种子都浸泡着促进剂,暗培养7 天,弱光培养7 天,种子膨大成黑色小圆点;
所述培养基为:1/3MS+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L,pH值为6.0;
所述种子发育促进剂为:DMSO3%+GA0.5 mg/L +TDZ0.2mg/L+IAA0.1 mg/L,pH值为6.0;
(4)原球茎培养:在超净工作台上,向步骤(3)的培养种子中加入灭菌过的原球茎诱导剂,5 天,膨大的种子开始变成白色的小圆点,12 天后小圆点陆续形成原球茎丛,30 d统计每颗种子平均形成3.7个原球茎,原球茎的诱导率为100%,原球茎丛的诱导率为95.7%;
所述原球茎诱导剂为:DA-60.5 mg/L+CPPU0.1 mg/L+IBA 0.05 mg/L,pH值为6.0。
步骤(3)所述胚发育和步骤(4)所述原球茎诱导阶段的培养条件是:培养温度为25±1℃,光照时间为12 h/d,光照强度为1000 Lx。
Claims (3)
1.一种增加杜鹃兰原球茎数量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)无菌播种和胚发育:在超净工作台上,将经灭菌处理过的杜鹃兰蒴果,用无菌纸吸干表面水分,将蒴果切分成两半,将种子均匀撒播到培养基上,加入灭菌过的种子发育促进剂,摇匀,种子都浸泡着促进剂,暗培养7天,弱光培5-10天,种子膨大;
所述的培养基为:1/3MS+蔗糖35 g/L+琼脂5 g/L,pH值为6.0;
所述的种子发育促进剂为:DMSO3%+GA0.1~1.0 mg/L +TDZ0.05~0.5 mg/L+IAA0.05~0.5 mg/L,pH值为6.0;
(2)原球茎培养:在超净工作台上,向步骤(1)的培养种子中加入灭菌过的原球茎诱导剂,4~8天,膨大的种子开始变成白色的小圆点,11~15天小圆点开始形成具有1~5个原球茎的原球茎丛,30 d时统计,原球茎的诱导率为100%,原球茎丛的诱导率为71.5%~95.7%;
所述原球茎诱导剂为:DA-60.1~1.0 mg/L+CPPU0.05~0.5 mg/L+IBA 0.01~0.1 mg/L,pH值为6.0;
步骤(1)所述胚发育和步骤(2)所述原球茎诱导阶段的培养条件是:培养温度为25±1℃,光照时间为12 h/d,光照强度为1000 Lx。
2.根据权利要求1所述的增加杜鹃兰原球茎数量的方法,其特征在于:
步骤(1)所述的种子发育促进剂为:DMSO 3%+GA0.5 mg/L +TDZ0.2mg/L+IAA0.1 mg/L,pH值为6.0。
3.根据权利要求1所述的增加杜鹃兰原球茎数量的方法,其特征在于:
步骤(2)所述原球茎诱导剂为:DA-6 0.5 mg/L+CPPU 0.1 mg/L+IBA 0.05 mg/L,pH值为6.0。
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