CN111919749B

CN111919749B - 一种金钗石斛种苗快繁用培养基及其快繁方法

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Publication number: CN111919749B
Application number: CN202010842487.3A
Authority: CN
Inventors: 向增旭; 张成才; 覃芳; 罗丽娜; 张子璇
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-08-20
Also published as: CN111919749A

Abstract

本发明提供了一种金钗石斛种苗快繁用培养基及其快繁方法，属于植物种苗培育技术领域。本发明提供的金钗石斛种苗快繁用培养基，包括以下质量体积浓度的组分：2.35～2.68g/L N6基本培养基、1.0～1.5mg/L 6‑BA、0.3～0.5mg/L 2,4‑D、30～60g/L土豆汁、130～160g/L香蕉汁、20～30g/L蔗糖和6～7g/L琼脂；所述培养基的pH值为5.6～5.8。本发明提供的金钗石斛种苗快繁用培养基培养金钗石斛种苗时无需转接，一次成苗，避免了频繁转接造成的污染，降低了污染率，而且大大节约了育苗成本。

Description

一种金钗石斛种苗快繁用培养基及其快繁方法

技术领域

本发明属于植物种苗培育技术领域，尤其涉及一种金钗石斛种苗快繁用培养基及其快繁方法。

背景技术

金钗石斛(Dendrobium nobiLeLindL)为兰科石斛属多年生附生草本植物，含有石斛碱、石斛多糖、多酚类、菲类和联苄类等多种药效成分，具有抑制肿瘤、抗衰老、提高人体免疫力、补五脏虚劳等功效，是我国传统的名贵中药。

目前，石斛育苗主要通过植物组织培养获取，虽然现有组织培养技术已经不断改进，并已形成了以种子为外植体的三步成苗的技术即种子萌发培养2～3个月后转接到增殖壮苗培养基中，培养3～4个月后再转接到生根培养基中培养2～3个月，但是三步成苗法依旧繁琐，需要多次换瓶转接，不仅浪费人力、财力、物力，而且增加了组培苗的污染率，从而导致组培苗数量减少，试管苗损失。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种金钗石斛种苗快繁用培养基及其快繁方法。本发明提供的金钗石斛种苗快繁用培养基培养金钗石斛种苗时无需转接，一次成苗，避免了频繁转接造成的污染，降低了污染率，而且大大节约了育苗成本。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种金钗石斛种苗快繁用培养基，包括以下质量体积浓度的组分：2.35～2.68g/L N6基本培养基、1.0～1.5mg/L 6-BA、0.3～0.5mg/L2,4-D、30～60g/L土豆汁、130～160g/L香蕉汁、20～30g/L蔗糖和6～7g/L琼脂；所述培养基的pH值为5.6～5.8。

本发明提供了一种金钗石斛种苗快繁的方法，包括如下步骤：

1)将金钗石斛种子用无菌水悬浮，得到种子悬浮液；

2)将种子悬浮液接种到培养基上，接种后进行暗培养，暗培养结束后采用光照培养，形成金钗石斛种苗；

步骤1)所述种子悬浮液的浓度为80～100个/mL。

优选的，步骤1)所述金钗石斛种子由果实饱满、无病虫害和无破裂的金钗石斛蒴果获得。

优选的，所述金钗石斛蒴果获得种子前，包括将金钗石斛蒴果进行消毒，所述消毒的方法包括如下步骤：将金钗石斛蒴果在流水下冲洗60～70min；冲洗后的金钗石斛蒴果用洗衣粉浸泡20～25min后用流水冲洗干净；将洗衣粉浸泡后的金钗石斛蒴果用乙醇消毒30～40s后用无菌水冲洗；再采用升汞消毒8～10min，得消毒后的金钗石斛蒴果。

优选的，步骤1)所述种子悬浮液的接种量为300～350μL/组培瓶。

优选的，步骤2)所述暗培养为无光照培养，所述暗培养的温度为23～25℃，所述暗培养的湿度为75％～85％，所述暗培养的时间为20～30d。

优选的，步骤2)所述光照培养的光照强度为2000～2500Lx，光照时间为14～16h/d，所述光照培养的温度为23～25℃，所述光照培养的湿度为75％～85％，所述光照培养的时间为200～270d。

有益效果

本发明提供了一种金钗石斛种苗快繁用培养基，包括以下质量体积浓度的组分：2.35～2.68g/L N6基本培养基、1.0～1.5mg/L 6-BA、0.3～0.5mg/L2,4-D、30～60g/L土豆汁、130～160g/L香蕉汁、20～30g/L蔗糖和6～7g/L琼脂；所述培养基的pH值为5.6～5.8。本发明培养基以N6培养基提供基本营养物质，6-BA促进石斛种子萌发，2,4-D促进原球茎分化和壮苗，土豆和香蕉作为天然有机物可提供更加丰富的营养，可同时满足金钗石斛萌发、原球茎分化、壮苗和生根的营养需求，不需转接即可实现金钗石斛一步成苗，简化了种苗培育步骤；同时降低了多次转接导致的感染率增加，从而减少试管苗损失，提高成苗率，大大节约了育苗成本。

进一步的，本发明提供了一种金钗石斛种苗快繁的方法，本发明将金钗石斛种子制成种子悬浮液，起到了稀释种子的作用，有效解决了由于种子数目过多造成的萌发率低，种苗生长不良的问题，为使金钗石斛一步成苗打下了基础。

进一步的，本发明以种子悬浮液形式进行接种，调控接种量再配合特定的培养基和培养条件，进一步确保一次成苗，提高萌发率和成活率。

附图说明

图1为实施例1金钗石斛点播30d种子萌发情况；

图2为实施例1金钗石斛点播90d种子萌发情况；

图3为实施例1金钗石斛点播120d种苗生长情况；

图4为实施例1金钗石斛点播180d种苗生长情况；

图5为实施例1金钗石斛点播240d试管苗生长情况。

具体实施方式

在本发明中，所述N6基本培养基的质量体积浓度为2.35～2.68g/L，进一步优选为2.47g/L；所述6-BA的质量体积浓度为1.0～1.5mg/L，进一步优选为1.0mg/L；所述2,4-D的质量体积浓度为0.3～0.5mg/L，进一步优选为0.3mg/L；所述土豆汁的质量体积浓度为30～60g/L，进一步优选为45g/L；所述香蕉汁的质量体积浓度为130～160g/L，进一步优选为145g/L；所述蔗糖的质量体积浓度为20～30g/L，进一步优选为25g/L；所述琼脂的质量体积浓度为6～7g/L，进一步优选为6.5g/L。在本发明中，所述培养基的pH为5.6～5.8，进一步优选为5.7。在本发明中，所述土豆汁、香蕉汁优选采用榨汁机制备得到，土豆汁和香蕉汁更有利于材料吸收营养物质。本发明所述培养基配制完成后，优选进行高压灭菌，所述高压灭菌的条件优选为121℃20min。

本发明培养基以N6培养基提供基本营养物质，6-BA促进石斛种子萌发，2,4-D促进原球茎分化和壮苗，土豆和香蕉作为天然有机物可提供更加丰富的营养，可同时满足金钗石斛萌发、原球茎分化、壮苗和生根的营养需求，不需转接即可实现金钗石斛一步成苗，简化了种苗培育步骤；同时降低了多次转接导致的感染率增加，从而减少试管苗损失，提高成苗率，大大节约了育苗成本。

1)将金钗石斛种子用无菌水悬浮，得到种子悬浮液；

步骤1)所述种子悬浮液的浓度为80～100个/mL。

本发明所述金钗石斛种子优选由果实饱满、无病虫害和无破裂的金钗石斛蒴果获得。所述金钗石斛蒴果优选在中午进行采摘，晴天中午温度高，采摘的金钗石斛蒴果露水少，携带的病菌少，利于组培苗建立无菌系，降低污染率。在本发明中，所述金钗石斛蒴果获得种子前，优选包括将金钗石斛蒴果进行消毒，所述消毒优选包括以下步骤：将金钗石斛蒴果在流水下冲洗60～70min，进一步优选为65min；将冲洗后的金钗石斛蒴果用洗衣粉浸泡20～25min，进一步优选为23min，然后用流水冲洗干净；将洗衣粉浸泡后的金钗石斛蒴果用乙醇消毒30～40s，进一步优选为30s，所述乙醇的体积百分浓度为75％，乙醇消毒后优选用无菌水冲洗，进一步优选为冲洗3次；乙醇消毒后，本发明优选用升汞消毒8～10min，进一步优选为9min，所述升汞的质量百分含量优选为0.1％，用升汞消毒后优选用无菌水冲洗5～6次，得消毒后的金钗石斛蒴果。

所述消毒后，本发明将消毒后的金钗石斛蒴果的种子取出。本发明优选使用刀片将金钗石斛蒴果剥开，取出种子；刀片剥开金钗石斛蒴果时以看到粉末状的种子即可。本发明优选在无菌器皿中取出种子，避免杂质污染。

取出种子后，本发明将金钗石斛种子用无菌水悬浮，得到种子悬浮液。在本发明中，所述种子悬浮液的浓度为80～100个/mL，进一步优选为90个/mL。本发明优选在显微镜下观察种子数量，重复测量三次，取平均值作为种子悬浮液的浓度。本发明将金钗石斛种子制成种子悬浮液，起到了稀释种子的作用，有效解决了由于种子数目过多造成的萌发率低，种苗生长不良的问题。

得到种子悬浮液后，本发明将所述种子悬浮液接种到培养基上。本发明优选将培养基装在组培瓶中进行培养。得到种子悬浮液后，本发明将种子悬浮液点播到组培瓶里的培养基上，所述种子悬浮液的接种量优选为300～350μL/组培瓶，进一步优选为330μL/组培瓶。本发明调整种子悬浮液的体积，使种子数目合适，使组培瓶萌发的组培苗数目合理，防止组培苗数目过多，避免了组培苗由于营养缺失而进行的转接，实现了一步成苗。

将种子悬浮液接种到培养基后，本发明在接种后进行暗培养。在本发明中，所述暗培养优选为无光照培养；本发明优选用报纸或锡箔纸包装组培瓶避免光照；在本发明中，所述暗培养的温度优选为23～25℃，进一步优选为24℃；所述暗培养的湿度优选为75％～85％，进一步优选为80％；所述暗培养的时间为20～30d，进一步优选为25d。本发明所述暗培养使种子充分萌发。暗培养结束后，本发明采用光照培养，形成金钗石斛种苗。在本发明中，所述光照培养的光照强度优选为2000～2500Lx，进一步优选为2300Lx；所述光照培养的温度优选为23～25℃，进一步优选为24℃；所述光照培养的湿度为75％～85％，进一步优选为80℃；所述光照培养的时间为200～270d，进一步优选为240d。本发明所述光照培养优选在组培室进行，在组培室光照培养后，得到7～9cm的带有根茎叶的健壮的小苗。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的金钗石斛种苗快繁的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的先定。

实施例1

金钗石斛种苗快繁

(1)果荚选择：2019年3月15日，选取果实饱满，无病虫害，无破裂的蒴果，取材时间在晴天中午最佳。

(2)金钗石斛蒴果消毒：取金钗石斛成熟蒴果，在流水下冲洗65min，用洗衣粉液浸泡23min，继续用流水冲洗干净，在超净工作台上用75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗三次，再用0.1％的升汞消毒8min后，用无菌水冲洗5～6次，滤纸吸干外表水分。

(3)准备培养基：一步成苗培养基的配制，向600mL的自来水中加入2.47g的N6基本培养基、加入1.0mg/L 6-BA，0.3mg/L2,4-D，加入打碎的土豆汁45g，香蕉汁145g、蔗糖25g，用水将体积添加到1000mL，调节pH为5.7，最后加入6.5g琼脂，120℃高温灭菌20min。

(4)无菌点播：将经过消毒处理的金钗石斛蒴果放入无菌盘上用刀片将其剥开，将种子洒到无菌水中，拿无菌枪头吸取300μL滴到载播片上，拿到显微镜下观察种子数量，重复三次，取平均值，得到种子悬浮液的浓度为90个/mL。然后把种子悬浮液的瓶子摇晃一下，迅速用无菌枪头将种子悬浮液接种到一步成苗培养基上，种子悬浮液的接种量为330μL/组培瓶，接种1000瓶。

(5)种子萌发：用报纸或锡箔纸包装组培瓶，无光照，温度24℃，湿度80％条件下进行暗培养。暗培养30天后，将金钗石斛幼苗放置到组培室进行光照培养，光照培养的条件为：温度24℃，湿度80％，光照15h/d，光照强度2300Lx。7个月以后长成7～9cm的带有根茎叶的健壮小苗。图1～5为实施例1金钗石斛种苗生长情况，其中图1为金钗石斛点播30d种子萌发情况；图2为金钗石斛点播90d种子萌发情况；图3为金钗石斛点播120d种苗生长情况；图4为金钗石斛点播180d种苗生长情况；图5为金钗石斛点播240d试管苗生长情况。

实施例2

培养过程与实施例相同，不同之处在于：一步成苗培养基中的土豆汁的浓度为30g/L，香蕉汁的浓度为130g/L。

实施例3

培养过程与实施例相同，不同之处在于：一步成苗培养基中的土豆汁的浓度为60g/L，香蕉汁的浓度为160g/L。

对比例1

培养过程与实施例相同，不同之处在于：种子直接撒播到培养基上。

对比例2

培养过程与实施例相同，不同之处在于：种子悬浮液浓度为25～35/ml，接种量为1ml。

对比例3

金钗石斛三步成苗

金钗石斛蒴果的选择和消毒同实施例1，取种方法也同实施例1。

A、将金钗石斛的种子播入N6基本培养基+NAA(α-萘乙酸)0.3mg/L+土豆汁20％(V/V)+琼脂5g/L的培养基里，共接种1000瓶，然后进行种子萌发培养，培养温度24℃，每日光照12h，光强2300Lx，15～20d种胚开始萌动，25～30d种胚膨大，逐渐萌发形成绿色的原球茎；

B、将原球茎转入N6基本培养基+6-BA(6-苄基腺嘌呤)0.2mg/L+土豆汁20％(V/V)+琼脂5g/L培养基里进行原球茎增殖、分化培养，25天后可观察到瓶内原球茎重叠堆积在培养基中，此时再一次进行转接，后让其分化小苗，苗高1cm左右同时伴随有部分新的原球茎产生；

C、将小苗转入N6基本培养基+NAA(α-萘乙酸)0.2mg/L+香蕉汁10％(V/V)+土豆汁10％(V/V)+琼脂6g/L的培养基里，进行壮苗培养，2个月可观察到小苗发育成2.5～4cm的中苗，将3cm以下的中苗再转接到同样的培养基里，继续培养，3cm以上的大苗进入生根培养基中培养，播种后8个月可培养出5cm高以上的大苗，大苗可出瓶炼苗、移栽。

性能评估

1不同播种浓度和接种方式对成苗率的影响

考察实施例1、对比例1和对比例2不同种子接种浓度和接种方式对成苗率的影响。检测结果见表1。

表1不同播种浓度和接种方式对成苗率的影响

由表1的结果可知，瓶中的种子粒数大于35粒，种子的萌发率降低；种子悬浮液浓度低，接种量大会导致瓶内培养基表面的水过多从而影响原球茎分化。另外，悬浮液密度和接种量也对成苗率有影响，最终优选出来悬浮液浓度为80～100粒/ml，接种量300～350μl，种子萌发率、原球茎分化率、成苗率最高。

2本发明与三步成苗法对比

将实施例1～3得到的金钗石斛小苗和对比例3小苗的农艺性状进行对比，结果见表2。

将实施例1～3得到的金钗石斛小苗和对比例1的小苗进行移栽。移栽过程如下：在一天中最接近25℃的时候，将组培苗移至中药石斛栽培资源圃中，不开瓶盖，放置一周，使其适应外界自然环境的温度。之后再将瓶盖拧开，将组培苗在大棚放置4～5d，使其适应自然环境中的湿度。随后用镊子将组培苗从瓶中取出，清洗组培苗根上附着的培养基，直至全部培养基被洗掉没有残留为止。为防止杂菌感染，洗净后的组培苗用多菌灵1000倍稀释液液浸泡金钗石斛幼苗10min杀菌，然后取出放置于阴凉处的网格架上晾晒，晾晒标志为金钗石斛组培苗的根部微微发白，也就是洗出第2天即可直接用于移栽定植。移栽前将松树皮与锯木屑用沸水煮2h进行杀菌消毒处理后，再将基质浸泡至800～1000倍的多菌灵水溶液里，待多菌灵水溶液完全渗透进基质后捞出、放至有格子的盘子中，将多余的水分除去，标准为湿润不滴水滴为宜，备用。

移栽容器采用40cm×60cm×8cm的平盘，选择长势均一的金钗石斛组培苗，以5株为一丛，每个试验组重复3次。

移栽后管理：组培苗移栽后每天应喷雾1～2次，适时地透水使基质保持湿润，移栽1周以后，每天浇水1次，同时每周喷施1次0.1％花宝2号叶面肥。另外第一周金钗石斛移栽苗进行适度遮荫处理，温度控制在10～25℃以内，以保证其正常生长。移栽后的成活率见表2。

表2实施例1试管苗与对比例3三步成苗试管苗的农艺性状和移栽成活率

由表1可以看出本发明实施例1～3得到的试管苗的株高、茎粗、根数、长势都优于市售三步法的试管苗，本发明的方法得到的试管苗具有显著优势。

由上述结果可知，本发明提供的金钗石斛种苗快繁用培养基及方法培养金钗石斛种苗时无需转接，一次成苗，避免了频繁转接造成的污染，降低了污染率，而且大大节约了育苗成本。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种金钗石斛种苗快繁的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将金钗石斛种子用无菌水悬浮，得到种子悬浮液；

2）将种子悬浮液接种到金钗石斛种苗快繁用培养基上，接种后进行暗培养，暗培养结束后采用光照培养，形成金钗石斛种苗；

步骤1）所述种子悬浮液的浓度为80~100个/mL；

所述金钗石斛种苗快繁用培养基，由以下质量体积浓度的组分组成：2.35~2.68g/L N6基本培养基、1.0~1.5mg/L 6-BA、0.3~0.5mg/L 2,4-D、30~60g/L土豆汁、130~160g/L香蕉汁、20~30g/L蔗糖和6~7g/L琼脂；所述培养基的pH值为5.6~5.8；

步骤2）所述种子悬浮液的接种量为300~350μL/组培瓶；

步骤2）所述暗培养为无光照培养，所述暗培养的温度为23~25℃，所述暗培养的湿度为75%~85%，所述暗培养的时间为20~30d；

步骤2）所述光照培养的光照强度为2000~2500Lx，光照时间为14~16h/d，所述光照培养的温度为23~25℃，所述光照培养的湿度为75%~85%，所述光照培养的时间为200~270d。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述金钗石斛种子由果实饱满、无病虫害和无破裂的金钗石斛蒴果获得。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金钗石斛蒴果获得种子前，包括将金钗石斛蒴果进行消毒；所述消毒的方法包括如下步骤：将金钗石斛蒴果在流水下冲洗60~70min；冲洗后的金钗石斛蒴果用洗衣粉浸泡20~25min后用流水冲洗干净；将洗衣粉浸泡后的金钗石斛蒴果用乙醇消毒30~40s后用无菌水冲洗；再采用升汞消毒8~10min，得消毒后的金钗石斛蒴果。