CN103314852B

CN103314852B - 利用根高效繁殖石斛兰的方法及其培养基

Info

Publication number: CN103314852B
Application number: CN201310270237.7A
Authority: CN
Inventors: 张建军; 周音; 陈敏敏; 谢纪红
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2015-04-01
Anticipated expiration: 2033-06-28
Also published as: CN103314852A

Abstract

本发明公开了一种利用根高效繁殖石斛兰的方法及其培养基。本发明的方法包括以下步骤：选取石斛兰的根段，接种，诱导得到胚性愈伤组织，胚性愈伤组织可进一步通过继代大量增殖；将胚性愈伤组织转移到原球茎诱导培养基中，诱导、增殖得到原球茎及芽苗；将原球茎及芽苗转接到成苗培养基上，培养得到石斛兰生根植株。本发明以MS为基本培养基，用于胚性愈伤组织诱导或继代的培养基需添加6-BA和PIC，用于原球茎诱导的培养基需添加CPPU和NAA。本发明所提供的利用石斛兰根培养再生植株的方法，繁殖系数高，成苗率高，成本低，可一步完成原球茎的成苗、壮苗与生根过程，植株健壮、根系发达。

Description

利用根高效繁殖石斛兰的方法及其培养基

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用根高效繁殖石斛兰的方法及其培养基。

背景技术

石斛兰(D.orchids)为兰科石斛属(Dendrobium)多年生草本植物，其主要用途是观赏和药用[吴瑞，李泽生，高燕，耿秀英.石斛兰的研究概况及发展前景[J].中国热带农业，2012(4)：22-23.]。石斛兰是国际著名的、最具观赏价值的四大名兰之一[徐雨，王四清.异军突起之石斛兰的研究进展[J].华北农学报，2005，20(辑)：152-157.]，具有种类繁多，花色艳丽，姿态优美，花多而密，花期长等诸多优良特性，既可作盆花栽培，也可作切花应用，适宜我国大部分地区集约化商品生产，应用前景广阔。石斛兰也是我国传统的名贵中药材，如著名的铁皮石斛和霍山石斛在我国均有悠久的应用历史，开发应用价值极高[邹成勇，刘燕.我国石斛属植物研究进展[J].安徽农业科学，2010，38(12)：6164-6166.]。

由于石斛兰经济价值极高，野生资源过度采挖极严重，1998年8月颁布的《中国植物红皮书》将几乎我国所有的石斛兰属植物都列入了保护名录。石斛兰对生态环境要求严格，种子发芽率极低，生长缓慢，自然更新困难，远不能满足需求。应用组织培养进行石斛兰的快速繁殖，对于解决石斛兰资源紧缺和实现产业化开发具有重要意义。

石斛兰组织培养的起始材料来源较广，种子、茎段、茎尖、腋芽、根尖、叶等都可作为外植体[张建勇，刘涛，袁佐清.石斛属植物组织培养及遗传转化研究进展[J].安徽农业科学2007，35(3)：656-657，670]，但成熟技术主要集中于种子、茎段、茎尖、腋芽等几种常见外植体的培养。用根作外植体，具有取材量大、容易获得、对植株伤害小的独特优势，但培养难度较大，目前仅见少量报道和个别发明专利提及，未公开本发明的内容。

1994年赵天榜等曾报道，曲茎石斛和铁皮石斛的根在N6+NAA0.5mg/L、N6+NAA1mg/L、N6+NAA1mg/L+6-BA1mg/L、N6+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L等培养基上可诱导出愈伤组织，继而分化原球茎或芽簇或胚状体，再将这些原球茎或芽簇或胚状体转移到N6或MS培养基上可培养得到组培苗(赵天榜，陈志秀，陈占宽，易明林，郅玉宝.石斛组织培养与栽培技术的研究[J].河南农业大学学报1994，28(2)：128-132)。但该文献未提供以石斛根作外植体的愈伤组织诱导率、分化率、成苗率和繁殖系数等数据，近30年来也未见他人采用该报道的方法取得过类似结果，目前已很少引述。

2006，2007年詹忠根等曾对铁皮石斛的根尖培养及培养中的形态建成问题进行研究[詹忠根，徐程，张铭，罗紫娟.铁皮石斛离体根尖经体细胞胚再生植株研究[J].浙江大学学报(农业与生命科学版)2007，31(5)：579-580；詹忠根.铁皮石斛根尖诱导丛生芽研究[J].中草药2006，37(6)：928-931]，得到过再生植株，但得率不高，不能产业化。

2008年秦廷豪曾以铁皮石斛根兜作外植体，接种在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L培养基进行光培养，诱导出了丛生芽和原球茎[秦廷豪.铁皮石斛的组织培养与快速繁殖[J].热带农业科学2008，28(1)：25-28]，但未阐明这些丛生芽和原球茎的起源，不能排除其起源于非根部的组织，而且也仅有20％的根兜诱导出原球茎，增殖系数4.28，效率不高。

2012年在CN102428874《一种用石斛诱导原球茎的方法》专利中，曾提到用石斛的根尖在1/2MS+NAA0.5～2mg/L+6-BA0.3～1mg/L+琼脂糖3～4g/L的培养基上经过暗培养和光培养可诱导原球茎并成苗，但未提供具体数据和实例。该发明的权利要求书和说明书均表明该专利主要适用于茎尖的组织培养。

此外，迄今为止石斛兰组织培养一直受到易褐化、易玻璃化及种苗瘦弱三大问题的困扰，目前通常采用繁琐的培养技术和在培养基中添加香蕉泥、椰子汁、胰蛋白胨等复杂有机物来控制其危害[吴志刚，刘贤旺，张寿文.石斛属植物组织培养研究进展[J].中药研究与信息2005，7(11)：23-25；陈亚鸿，洪磊，陈雄庭.减少秋石斛在组织培养中的褐化研究[J].现代农业科学2009，16(3)：44-48；乔永旭，张永平.石斛兰的组织培养[J].安徽农业科学2010，38(4)：1731-1732，1734；贺佳，彭峰，江玉梅，夏冰，汪仁.石斛兰组织培养和快速繁殖体系的建立与优化[J].江苏农业科学，2010，(6)：70-72]，致使培养成本高企、周期延长，也亟需通过培养方法与培养基的创新从根本上加以改进。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种利用根高效繁殖石斛兰的方法及其培养基，同时为解决石斛兰组织培养中常见的易褐化、易玻璃化及种苗瘦弱问题提供技术方案。具体为以根为外植体，诱导胚性愈伤组织，并通过继代增殖，再分化、增殖原球茎，快速繁殖石斛兰；同时提出了各培养阶段所需的特定培养基与培养技术。本发明所提供的石斛兰根培养再生植株的方法，繁殖系数高，成苗率高，成本低，可一步完成原球茎的成苗、壮苗与生根过程，植株健壮、根系发达。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种利用根高效繁殖石斛兰的方法，包括如下步骤：

步骤一，选取石斛兰的根段，接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，培养，诱导得胚性愈伤组织；

步骤二，将所述胚性愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基中，培养，使胚性愈伤组织增殖；

步骤三，将步骤一所述的胚性愈伤组织或步骤二所述的增殖后的胚性愈伤组织转移到原球茎诱导培养基中，培养，得到原球茎，所述原球茎能够在该原球茎诱导培养基上增殖并发育成芽苗；

步骤四，将所述原球茎或者芽苗转接到成苗培养基上，培养，得生根的石斛兰再生植株。

优选的，步骤一中，所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.6mg/L+PIC3mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。所述培养为暗培养，培养的温度为25±2℃。

优选的，步骤二中，所述愈伤组织继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+PIC2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。所述培养为暗培养，培养的温度为25±2℃。

优选的，步骤三中，所述原球茎诱导培养基为MS+CPPU0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。所述培养为光培养，培养的温度为25±2℃。

优选的，步骤四中，所述成苗培养基为MS+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。所述培养为光培养，培养的温度为25±2℃。

本发明还涉及一种用于上述方法的胚性愈伤组织诱导培养基，该培养基能够诱导得到胚性愈伤组织，所述诱导培养基为MS基本培养基，同时添加有6-BA和PIC。

本发明还涉及一种用于上述方法的愈伤组织继代培养基，该培养基能够使胚性愈伤组织增殖，所述继代培养基为MS基本培养基，同时添加有6-BA和PIC。

本发明还涉及一种用于上述方法的原球茎诱导培养基，该培养基能够诱导得到原球茎，所述原球茎诱导培养基为MS基本培养基，同时添加有CPPU和NAA。

本发明所使用培养基中的MS组分见文献《Murashige T，Skoog F.A revised mediumfor rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J].Physiol.Plant.1962，15，473-497》，这属于本领域的公知常识。

本发明在培养基中所使用的PIC化学名称为4-氨基-3，5，6-三氯吡啶-2-酸，分子式为C₆H₃Cl₃N₂O₂，中文通用名为毒莠定或氨氯吡啶酸，英文名称为Picloram。

本发明在培养基中所使用的CPPU化学名称为N-(2-氯-4-吡啶基)-N’-苯基脲，分子式为C₁₂H₁₀ClN₃O，中文通用名为氯吡苯脲或氯吡脲，英文名称为Forchlorfenuron。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、根作为外植体具有独特优势，且容易获得；以根为外植体与种子、胚相比，能保持母株性状；与其它营养组织相比，取材量更大，更易获得，对植株伤害小。

2、快繁效率高，原球茎直接生根，形成完整植株，植株健壮，根系发达。

3、首次将毒莠定(PIC)应用于石斛兰根胚性愈伤组织诱导和继代培养，愈伤组织诱导、增殖效率高，并能在特定的分化培养基上高效分化形成原球茎。

4、首次将氯吡苯脲(CPPU)应用于石斛兰根胚性愈伤组织分化培养，原球茎形成、增殖效果好，原球茎转接到成苗培养基后成苗率在95％以上。

5、成苗过程简单，操作方便，节省成本与能源；整个过程仅用MS一种基本培养基方便操作，不需加香蕉泥、椰汁等复杂有机物，培养成本低廉；胚性愈伤组织诱导和增殖，只需在MS基本培养基中加6-BA和PIC，并用暗培养，能节约能源；原球茎分化与增殖，只需在MS基本培养基中加NAA和CPPU；原球茎成苗，只需将原球茎转移到不加任何生长调节剂的MS+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L培养基上光照培养，就可得到直接生根的完整再生植株；整个诱导成苗过程比较简单；

6、整个培养过程未出现石斛兰组织培养中常见的褐化、玻璃化和再生种苗瘦弱的现象，提高了组培效率和种苗质量；

7、植株健壮，移栽成活率高；来源于根诱导的再生植株，生长旺盛，生根能力极强，不用生根剂就可产生许多粗壮的根。

8、由根再生植株可获得更多的根外植体，进而大量、持续地诱导更多的原球茎，实现循环增殖，有利于工厂化生产。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为石斛根段诱导出胚性愈伤组织的示意图；

图2为胚性愈伤组织变绿开始分化原球茎的示意图；

图3为原球茎增殖与生长的示意图；

图4为原球茎发育芽苗的示意图；

图5为原球茎及芽苗形成再生植株的示意图；

图6为生根石斛苗的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂以及有必要列出其组成成份者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

实施例1

以铁皮石斛试管苗的根为材料，切成段后接种，暗培养，温度25℃左右(25±2℃)，诱导胚性愈伤组织，胚性愈伤组织诱导培养基为MS(Murashige and Skoog，1962)+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.6mg/L+PIC(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶-2-酸)3mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。15天后根段膨大，开始产生胚性愈伤组织，如图1所示，60天后可在根段上长满胚性愈伤组织，愈伤组织诱导率约70％。

将获得的胚性愈伤组织转移到诱导原球茎的培养基中，进行原球茎的分化与增殖，原球茎诱导培养基为MS+CPPU(N-(2-氯-4-吡啶基)-N’-苯基脲)0.1mg/L+NAA(萘乙酸)0.01mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。培养条件为每天光照16小时，温度25℃左右。7天后胚性愈伤组织变绿，逐渐形成大量原球茎和小芽苗，如图2、3、4所示。培养45天后，每段根产生的胚性愈伤组织可诱导得到原球茎和小芽苗80～130个。

把原球茎和芽苗转接于MS+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L的成苗培养基上，每天光照16小时，温度25℃左右，原球茎和芽苗将逐渐发育成正常植株，同时生根，如图5、6所示，原球茎成苗率在95％以上。待生根植株长至5～7片叶后，打开瓶盖炼苗一周，洗去琼脂后种植于温室，生长健壮，成活率100％。

实施例2

以实施例1得到的试管苗的根为材料，切成段后接种，暗培养，温度25℃左右，诱导胚性愈伤组织，胚性愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.6mg/L+PIC3mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L，愈伤组织诱导率达80％以上。将诱导得到的胚性愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基中暗培养，温度25℃左右，25天继代1次，胚性愈伤组织每经过1次继代大约可增殖1倍。愈伤组织继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+PIC2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。

将继代2次得到的胚性愈伤组织转移到诱导原球茎的培养基中，进行原球茎的分化与增殖，原球茎诱导培养基为MS+CPPU0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L，培养条件为每天光照16小时，温度25℃左右，每段根产生的胚性愈伤组织可诱导得到原球茎和小芽苗400～500个。

把原球茎和芽苗转接于MS+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L的成苗培养基上，每天光照16小时，温度25℃左右，原球茎成苗率约98％，获得的植株健壮，根系发达。

实施例3

以霍山石斛试管苗的根为材料，切成段后接种，暗培养，温度25℃左右，诱导胚性愈伤组织，胚性愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.6mg/L+PIC3mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L，愈伤组织诱导率达70％以上。将诱导得到的胚性愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基中暗培养，继代25天，温度25℃左右，胚性愈伤组织可增殖1倍以上。愈伤组织继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+PIC2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。

将继代增殖得到的胚性愈伤组织转移到诱导原球茎的培养基中，进行原球茎的分化与增殖，原球茎诱导培养基为MS+CPPU0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L，培养条件为每天光照16小时，温度25℃左右，每段根产生的胚性愈伤组织可得到原球茎和小芽苗150～220个。

把原球茎和芽苗转接于MS+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L的成苗培养基上，每天光照16小时，温度25℃左右，原球茎成苗率约96％，获得的植株健壮，根系发达。

实施例4

以秋石斛试管苗的根为材料，切成段后接种，暗培养，温度25℃左右，诱导胚性愈伤组织，胚性愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.6mg/L+PIC3mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L，愈伤组织诱导率约65％。

将诱导得到的胚性愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基中暗培养，继代30天，温度25℃左右，胚性愈伤组织可增殖约1.5倍；愈伤组织继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+PIC2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。

将继代增殖得到的胚性愈伤组织转移到诱导原球茎的培养基中，进行原球茎的分化与增殖，原球茎诱导培养基为MS+CPPU0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L，培养条件为每天光照16小时，温度25℃左右，每段根产生的胚性愈伤组织可诱导原球茎和小芽苗约300个。

把原球茎和芽苗转接于MS+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L的成苗培养基上，每天光照16小时，温度25℃左右，原球茎成苗率在96％以上，获得的植株健壮，根系发达。

综上所述，本发明所提供的石斛兰根培养再生植株的方法，繁殖系数高，成苗率高，成本低，可一步完成原球茎的成苗、壮苗与生根过程，植株健壮、根系发达，具有意想不到的技术效果。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种利用根高效繁殖石斛兰的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，选取石斛兰的根段，接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，培养，诱导得胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA0.6mg/L+PIC 3mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L；

步骤二，将所述胚性愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基中，培养，使胚性愈伤组织增殖；所述愈伤组织继代培养基为MS+6-BA0.5mg/L+PIC 2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L；

步骤三，将步骤一所述的胚性愈伤组织或步骤二所述的增殖后的胚性愈伤组织转移到类原球茎诱导培养基中，培养，得到类原球茎，所述类原球茎能够在该类原球茎诱导培养基上增殖并发育成芽苗；所述类原球茎诱导培养基为MS+CPPU0.1mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L；

步骤四，将所述类原球茎或者芽苗转接到成苗培养基上，培养，得生根的石斛兰再生植株；所述成苗培养基为MS+蔗糖30000mg/L+琼脂粉5000mg/L。

2.如权利要求1所述的利用根高效繁殖石斛兰的方法，其特征在于，步骤一和步骤二中，所述培养为暗培养，培养的温度为25±2℃。

3.如权利要求1所述的利用根高效繁殖石斛兰的方法，其特征在于，步骤三和步骤四中，所述培养为光培养，培养的温度为25±2℃。