CN103907535B - 一种通过组织培养获得大量秀竹再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过组织培养获得大量秀竹再生植株的方法，包括采用秀竹当年生枝芽饱满的半木质化枝条为外植体，经消毒处理后在经改良的诱导培养基上形成诱导芽，然后，将丛生芽接种到改良的增殖培养基上，诱导大量丛芽产生，再在生根培养基上分化出根，形成完整植株，最后移栽到花盆，完成秀竹组织培养过程。本发明方法填补了秀竹组织培养快速繁殖的空白，为秀竹的园林栽种、大面积绿化奠定了迅速且充足供应的基础，为秀竹的工厂化大规模生产提供了可行的方案。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种通过组织培养获得大量秀竹再生植株的方法。
背景技术
秀竹（Bambusa glaucophylla）属簕竹属，又名马来簕竹，是以修长叶形以及优良的株形作为观赏性状的重要观赏竹之一。常用于制作盆景及庭院栽培作观赏用，其竹高300-500cm，直径2.5cm，为著名的观赏竹种，具有广阔的市场前景。然而，竹类植物开花间隔期长，很少开花结实，由于竹类植物花粉萌发率普遍较低，因此种子获取十分困难。目前竹子繁殖主要以移竹、竹蔸、埋鞭、埋秆、埋节等传统方法为主，这些方法具有消耗母竹多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等缺点，秀竹也是如此。
竹子组织培养方面的研究，最早见于1968年，Alexander和Rao关于竹子合子胚离体培养的简报。国外比较系统开展竹子组织培养工作始于20世纪80年代。1982年，Mehata等（MethaUI，RaoVR，Mohan Ram HY，1982）在第5届国际植物组织细胞培养会议上首次报道通过胚性愈伤组织获得印度箣竹（Bambusaarundinacea）再生植株。我国的竹子组织培养工作开展得较晚，20世纪90年代才开始，阙国宁等以黄竹和印度箣竹2种丛生竹的嫩节作为外植体诱导愈伤组织，最终形成完整植株。陈懿涵等（陈懿涵等，2008）对花秆绿竹（Bambusa oldhamii f. variegata）进行了试管快繁研究。2009年，袁金玲（袁金玲，2009）以孝顺竹小穗和种胚为外植体，诱导出胚性愈伤组织并成功实现植株再生；但由于竹类植物特殊的生物学特性，目前通过快繁途径来实现竹类植株的再生方面的报道并不多。
发明内容
发明目的：针对现有竹类植物繁殖技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种通过组织培养获得大量秀竹再生植株的方法，克服秀竹组织培养过程中再生难的问题，为秀竹再生植株的培养提供一种方便、快捷和有效的方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种通过组织培养获得大量秀竹再生植株的方法，包括秀竹外植体的准备、丛芽诱导、丛芽增殖和植株再生步骤，具体步骤如下：
（1）以秀竹当年生枝芽饱满的半木质化枝条作为外植体材料，将从室外采集的外植体进行消毒处理后备用；
（2）将无菌的秀竹外植体接种到诱导培养基上进行丛芽诱导，一周后丛生芽形成；其中，诱导培养基为MS+2mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA+0.001mg/LTDZ；
（3）将丛生芽转接到增殖培养基上培养15天以上，至大量丛芽形成；其中，增殖培养基为MS+3mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA+0.01mg/LTDZ；
（4）将大量丛芽转接到生根培养基中，进行生根培养，其中，生根培养基为MS+3.5mg/L NAA+0.3-0.5mg/L 6-BA；
（5）待根生长至5-10cm时，进行再生苗的炼苗与移栽；移栽花盆后的组培苗置于植物生长室中生长。
步骤1）中，消毒方法为：先用流水冲洗2-3h，然后用70%乙醇处理45s，再用0.1% HgCl2浸泡8min。
上述培养基组分中，MS为MS培养基成分（Murashige&Skoog medium，1962，Physiol. Plant 15：473-497 ），NAA为萘乙酸 （1-Naphthaleneacetic acid），TDZ为噻二唑苯基脲，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点包括：通过不同生长调节剂的组合，设计出适合秀竹再生的培养基，完成秀竹植株再生的时间最快仅为10周左右。有效解决了秀竹繁殖困难，克服了传统的母株移栽效率低、运输成本高等缺点，且不受季节的限制，为秀竹的快速繁殖和定向生物技术育种奠定了坚实的基础，对于实现秀竹工厂化生产具有很重要的意义，为秀竹大面积的推广和利用，充分发挥其观赏性提供了快速且充足供应的有效途径，是一种方便、快捷和有效的秀竹再生植株培养方法。
附图说明
图1是秀竹的外植体材料图；
图2 是接种一周后秀竹枝芽诱导出的少量丛芽图；
图3 是秀竹增殖15天后的丛芽图；
图4是秀竹增殖30天后的丛芽图；
图5是秀竹产生大量丛芽图；
图6是秀竹再生苗的生根图；
图7是移栽成功的秀竹再生植株图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种通过组织培养获得大量秀竹再生植株的方法，包括以下步骤：
（1）外植体的选择：如图1所示，选取秀竹当年生枝芽饱满的半木质化枝条作为外植体材料；将从室外采集的外植体先用流水冲洗2-3h，然后用70%乙醇处理45s，再用0.1% HgCl2浸泡8min，通过以上消毒方法处理后的秀竹外植体接种后，无菌率最高，芽诱导成活率高（表1）。
表 1不同消毒剂处理不同时间对外植体培养的影响
| 处理 | 70%乙醇（s） | 0.1%HgCl2（min） | 污染率（%） | 无菌率（%） | 成活率（%） |
| 1 | 30 | 3 | 28.7 | 71.3 | 62.3 |
| 2 | 30 | 5 | 17.2 | 82.8 | 68.2 |
| 3 | 30 | 8 | 6.5 | 93.5 | 81.5 |
| 4 | 45 | 3 | 25.1 | 74.9 | 63.1 |
| 5 | 45 | 5 | 13.8 | 86.2 | 70.5 |
| 6 | 45 | 8 | 2.5 | 97.5 | 86.7 |
（2）秀竹丛生芽的诱导：将灭菌的秀竹外植体接种到丛芽诱导培养基上诱导，一周后芽生长至1-2厘米，如图2所示，获得丛生芽；其中，丛芽诱导培养基为MS+2mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA+0.001mg/L；
（3）秀竹丛生芽的增殖：将丛生芽转接到增殖培养基上MS+3mg/L 6-BA +0.5mg/ L NAA+0.01mg/L TDZ培养，至大量丛芽形成；图3为增殖15天后的丛芽，图4为增殖30天后的芽丛，图5为60天后，大量丛芽产生；其中，增殖培养基上MS+3mg/L 6-BA +0.5mg/ L NAA+0.01mg/LTDZ，1个无菌外植体经过近60天的培养，丛生芽增殖倍数最高可达3.6；
（4）秀竹的植株再生：将培养的大量丛芽转接到生根培养基中，进行生根培养，如图6所示，两周后，就有不定根产生，三周后不定根大量产生；其中，生根培养基为MS+3.5mg/L NAA+0.3-0.5mg/L 6-BA；
（5）秀竹的炼苗与移栽：待根生长至5-10cm时，可进行再生苗的炼苗与移栽。移栽花盆后的组培苗置于植物生长室中培养，湿度60-80%，温度25±1℃，光周期为光照14h/黑暗10h，7-10天后，可以常规方法室外栽培，移栽成功的秀竹再生植株如图7所示。
以上所有使用的培养基，在灭菌前将pH调到5.8，灭菌条件为121℃，20min。以上所有培养操作的培养条件均为：温度25±1℃，光周期为14h/黑暗10h，培养物表面的光照强度约为3000lx。
Claims (1)
1.一种通过组织培养获得大量秀竹再生植株的方法，其特征在于，包括秀竹外植体的准备、丛芽诱导、丛芽增殖和植株再生步骤，具体步骤如下：
(1)以秀竹当年生枝芽饱满的半木质化枝条作为外植体材料，将从室外采集的外植体进行消毒处理后备用；
(2)将无菌的秀竹外植体接种到诱导培养基上进行丛芽诱导，一周后丛生芽形成；其中，诱导培养基为MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.001mg/L TDZ；
(3)将丛生芽转接到增殖培养基上培养15天以上，至大量丛芽形成；其中，增殖培养基为MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.01mg/L TDZ；
(4)将大量丛芽转接到生根培养基中，进行生根培养，其中，生根培养基为MS+3.5mg/LNAA+0.3-0.5mg/L 6-BA；
(5)待根生长至5-10cm时，进行再生苗的炼苗与移栽；移栽花盆后的组培苗置于植物生长室中生长；
步骤1)中，消毒方法为：先用流水冲洗2-3h，然后用70％乙醇处理45s，再用0.1％HgCl2浸泡8min。
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