CN102919122B

CN102919122B - 一种半夏离体球茎的高效诱导方法

Info

Publication number: CN102919122B
Application number: CN201210401988.3A
Authority: CN
Inventors: 刘红美; 方小波; 梁大勇
Original assignee: Zunyi Long Chi Bio Tech Ltd
Current assignee: Zunyi Long Chi Bio Tech Ltd
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-10-19
Also published as: CN102919122A

Abstract

本发明提供了一种半夏离体球茎的高效诱导方法，主要包括以下步骤：（1）选用叶柄为外植体；（2）胚状体诱导培养；（3）离体球茎诱导培养；（4）离体球茎大田移栽或贮藏。本发明可诱导外植体直接分化出胚状体，还可诱导胚状体直接形成离体球茎；工艺简单合理，培养基配制方便，诱导率高，繁殖力强，离体球茎移栽成活率高，不需特殊驯化即可直接栽培或贮藏，实现了与半夏种苗生产与人工大规模栽培的对接，具有较大的生产应用价值。

Description

一种半夏离体球茎的高效诱导方法

技术领域

本发明涉及一种中药组织培养方法，尤其涉及一种半夏离体球茎的高效诱导方法。

背景技术

半夏以球茎入药，具有燥湿化痰、降逆止咳、消肿散结、抗早孕、抗肿瘤等多种功效，是我国特有的一种大宗传统中药材。随着药理研究的深入，半夏的市场需求量越来越大。半夏一直以野生资源为主，由于人们过度采挖和土地的精细耕作，使得野生半夏资源近乎枯竭。尽管半夏已经推广人工栽培，但由于长期采用小球茎作为种球，导致病毒感染不断积累在球茎中，造成半夏产量和药用成分极不稳定的现象。为了解决半夏资源保护和市场需求的矛盾，我国对半夏组培快繁技术的研究和应用已迅速展开。常见的半夏组织快繁体系是通过外植体诱导愈伤组织、愈伤组织分化出苗、继代增殖、生根、炼苗训化、组培苗移栽等环节，程序繁琐，而且移栽成活率不高。组织培养中的胚状体具有可发芽、不可生根的特点，所以不用生根就能获得完整植株，而且还有繁殖速度快等优点，已经广泛应用于生产实践。在适宜的组培条件下，半夏外植体诱导形成的离体球茎外形、大小均匀。另外，离体球茎还可直接作为繁殖材料应用于生产，节约了原种，大大缩短大田生长周期，避免了种球远程运输和贮存过程中存在的种种问题，具有较广阔的应用前景。通过检索发现，半夏报道的胚状体诱导率一般都只在50%-60%。

在CN102160523A专利中，用适宜浓度的灵发素可使半夏叶柄的胚状体诱导率提高80～100%，但没有离体球茎的形成。在CN100367846C专利中，用多效唑、活性炭、赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯、糖、琼脂粉等复合培养基实现了半夏离体球茎的形成，但其所用试剂较多，配置繁琐，且前期需要经过诱导、出苗、生根等生产程序，不适合于大规模生产。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采用了一种半夏叶柄胚状体及离体球茎的高效诱导方法，解决了现有技术中半夏组织快繁体系移栽成活率不高的问题；解决了半夏组培程序繁琐、不适于大规模生产的问题；保证半夏胚状体诱导率，又能促使离体球茎生成；最终解决半夏资源保护和市场需求矛盾的问题。

一种半夏离体球茎的高效诱导方法，主要包括以下步骤：

（1）外植体选择：选择半夏叶柄、嫩叶、茎尖、株芽、球茎中的任一种作为外植体；

（2）胚状体诱导培养：配制胚状体诱导培养基为：MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+市售白糖3～6%+琼脂粉0.45～0.6%，pH5.8～6.0；将步骤（1）所得外植体切断为长0.8～1.2cm的继代扩繁材料，接种在胚状体诱导培养基中，23℃～27℃、光照1200Lx、12h/d条件下培养30～40天；

（3）离体球茎诱导培养：配制离体球茎诱导培养基为：1/2MS+6-BA 0.1～0.3mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+市售白糖3～9%，pH 5.8～6.0；将步骤（2）所得的胚状体，以1:2的比例接种于离体球茎诱导培养基中，23℃～27℃，室内自然光照条件下培养40～45天，胚状体就长成一粒粒的离体球茎；

（4）大田移栽或贮藏：将离体球茎取出，将黏附的培养基冲洗干净，阴干表面的水分，直接进行大田移栽，或者贮藏起来。

所述步骤（3）中的培养容器为透明的玻璃瓶和/或塑料袋。

所述步骤（1）中的外植体优选为叶柄。

所述步骤（1）中的外植体在切断前经过常规灭菌处理。

所述步骤（2）中的胚状体诱导培养基为：MS+6-BA 0.2～0.4mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+市售白糖3～6%+琼脂粉0.5～0.55%，pH5.8～6.0。

所述步骤（3）中的离体球茎诱导培养基为：1/2MS+6-BA 0.2～0.3mg/L+NAA0.15～0.2mg/L+市售白糖5～8%，pH 5.8～6.0。

所述步骤（2）和步骤（3）中的温度条件为24℃～26℃。

所述步骤（2）和步骤（3）中的培养基经过常规湿热灭菌处理20～30min。

与现有技术相比，本发明达到的有益效果为：可诱导外植体直接分化出胚状体，还可诱导胚状体直接形成离体球茎；工艺简单合理，培养基配制方便，诱导率高，繁殖力强，球茎移栽成活率高，不需特殊驯化即可直接栽培或贮藏，实现了与半夏种苗生产与人工大规模栽培的对接，具有较大的生产应用价值。本发明以两种常用的植物生长调节剂进行不同浓度配比，经过固液培养，实现了胚状体的高效诱导和离体球茎的直接形成，不需要经过愈伤组织诱导及生根、驯化等常规繁琐的处理，就可将离体球茎进行直接移栽；所使用的外植体材料取材方便，优选叶柄，解决了传统人工栽培中由于长期采用小球茎作为种球，使病毒感染不断积累在球茎中，造成半夏产量和药用成分极不稳定的问题；以半夏叶柄为材料经诱导可直接分化出大量胚状体，诱导率高达98%，且繁殖倍数高达20倍以上；诱导的胚状体还可诱导直接形成离体球茎，移栽成活率高，且种植方便，大大提高了生产效率。以本发明所述方法获得的离体球茎具有较强的抗逆性和贮藏性，不需特殊驯化即可直接用于大田栽培，不受生产季节的限制，可全年生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中叶柄在透明玻璃瓶内的培养基上不同培养阶段的诱导增殖情况，其中：

①为叶柄作为外植体在培养基中的状态；

②为诱导叶柄形成的胚状体的状态；

③为诱导胚状体形成的离体球茎的状态；

④为可直接移栽或贮藏的离体球茎的状态。

具体实施方式

为了加深对本发明理解，下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。在本发明基础上作出的修改或改进，若对本领域技术人员是显而易见的，则属于本发明要求保护的范围。

实施例1

取半夏叶柄切成1cm作为外植体，接种在胚状体诱导培养基（MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.2mg/L+市售白糖3%+琼脂粉0.45%；pH5.8）中，27℃、光照1200Lx、12h/d条件下培养30天后，所有外植体都诱导出胚状体，且每个外植体胚状体的数目都在20以上；将诱导获得的胚状体接种在玻璃瓶里的离体球茎诱导培养基（1/2MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+市售白糖3%，pH 5.8）中，27℃、室内自然光照条件下培养45天后，胚状体直接形成了离体球茎，将离体球茎黏附的培养基冲洗干净后，阴干表面水分，直接播种在大田中，在28℃温度下，7天左右就开始发芽，发芽率高达95%。

实施例2

取半夏叶柄切成0.8cm作为外植体，接种在胚状体诱导培养基（MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.15mg/L+市售白糖6%+琼脂粉0.45%；pH5.9）中，26℃、光照1200Lx、12h/d条件下培养33天后，所有外植体都诱导出胚状体，且每个外植体胚状体的数目都在30以上；将诱导获得的胚状体接种在塑料袋里的离体球茎诱导培养基（1/2MS+6-BA 0.15mg/L+NAA 0.1mg/L+市售白糖3%，pH 5.9）中，26℃、室内自然光照条件下培养43天后，胚状体直接形成了离体球茎，将离体球茎黏附的培养基冲洗干净后，阴干表面水分，直接播种在大田中，在30℃温度下，7天左右左右就开始发芽，发芽率高达96%。

实施例3

取半夏叶柄切成1.2cm作为外植体，接种在胚状体诱导培养基（MS+6-BA0.1mg/L+IBA0.5mg/L+市售白糖9%+琼脂粉0.45%；pH6.0）中，25℃、光照1200Lx、12h/d条件下培养35天后，所有外植体都诱导出胚状体，且每个外植体胚状体的数目都在20以上；将诱导获得的胚状体接种在塑料袋里的离体球茎诱导培养基（1/2MS+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+市售白糖3%，pH 6.0）中，25℃、室内自然光照条件下培养40天后，胚状体直接形成了离体球茎，将离体球茎黏附的培养基冲洗干净后，阴干表面水分，直接播种在大田中，在28℃温度下，7天左右左右就开始发芽，发芽率高达95%。

实施例4

取半夏叶柄切成1.2cm作为外植体，接种在胚状体诱导培养基（MS+6-BA0.4mg/L+IBA0.2mg/L+市售白糖9%+琼脂粉0.45%；pH5.8）中，24℃、光照1200Lx、12h/d条件下培养37天后，所有外植体都诱导出胚状体，且每个外植体胚状体的数目都在20以上；将诱导获得的胚状体接种在塑料袋里的离体球茎诱导培养基（1/2MS+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+市售白糖3%，pH 5.8）中，24℃、室内自然光照条件下培养44天后，胚状体直接形成了离体球茎，将离体球茎黏附的培养基冲洗干净后，阴干表面水分，直接播种在大田中，在30℃温度下，7天左右左右就开始发芽，发芽率高达95%。

实施例5

取半夏叶柄切成1.2cm作为外植体，接种在经过常规湿热灭菌处理15min的胚状体诱导培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+IBA0.1mg/L+市售白糖9%+琼脂粉0.45%；pH6.0）中，23℃、光照1200Lx、12h/d条件下培养40天后，所有外植体都诱导出胚状体，且每个外植体胚状体的数目都在20以上；将诱导获得的胚状体接种在塑料袋里的经过常规湿热灭菌处理30min的离体球茎诱导培养基(1/2MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.1mg/L+市售白糖3%，pH6.0）中，23℃、室内自然光照条件下培养42天后，胚状体直接形成了离体球茎，将离体球茎黏附的培养基冲洗干净后，阴干表面水分，直接播种在大田中，在28℃温度下，7天左右左右就开始发芽，发芽率高达95%。

图1为本发明实施例1中叶柄在透明玻璃瓶内的培养基上不同培养阶段的诱导增殖情况图，其中：①为叶柄作为外植体在培养基中的状态；②为叶柄诱导形成胚状体的状态；③为胚状体形成离体球茎的状态；④为可直接移栽或贮藏离体球茎的状态。如图1所示，选用叶柄作为外植体，剪断为长0.8～1.2的条状物，置于胚状体诱导培养基中，此时的状态图如①；经过胚状体诱导成功后的状态如②，诱导出的胚状体的数量和诱导前相比要多得多，这说明胚状体的诱导率较高，繁殖倍数较大；将所得胚状体经离体球茎诱导培养后，生成大量的离体球茎，此时状态如③，这说明离体球茎的诱导率高，成活率高；可用于直接移栽或贮藏的离体球茎状态如④，为本发明所述的高效诱导方法诱导半夏叶柄最终得到的离体球茎，其具有较强的抗逆性和贮藏性，不需特殊驯化即可直接用于大田栽培，或者贮藏。

Claims

1.一种半夏离体球茎的高效诱导方法，其特征在于：主要包括以下步骤：

（1）外植体选择：选择半夏叶柄、嫩叶中的任一种作为外植体；

（2）胚状体诱导培养：配制胚状体诱导培养基为：MS+6-BA0.1～0.5mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+市售白糖3～6%+琼脂粉0.45～0.6%，pH5.8～6.0；将步骤（1）所得外植体切断为长0.8～1.2cm的继代扩繁材料，接种在胚状体诱导培养基中，23℃～27℃、光照1200Lx、12h/d条件下培养30～40天；

（3）离体球茎诱导培养：配制离体球茎诱导培养基为：1/2MS+6-BA0.1～0.3mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+市售白糖3～9%，pH5.8～6.0；将步骤（2）所得的胚状体接种于离体球茎诱导培养基中，23℃～27℃，室内自然光照条件下培养40～45天，胚状体就长成一粒粒的离体球茎；

2.根据权利要求1所述的一种半夏离体球茎的高效诱导方法，其特征在于：所述步骤（1）中的外植体优选为叶柄。

3.根据权利要求1所述的一种半夏离体球茎的高效诱导方法，其特征在于：所述步骤（1）中的外植体在切断前经过常规灭菌处理。

4.根据权利要求1所述的一种半夏离体球茎的高效诱导方法，其特征在于：所述步骤（2）中的胚状体诱导培养基为：MS+6-BA0.2～0.4mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+市售白糖3～6%+琼脂粉0.5～0.55%，pH5.8～6.0。

5.根据权利要求1所述的一种半夏离体球茎的高效诱导方法，其特征在于：所述步骤（3）中的离体球茎诱导培养基为：1/2MS+6-BA0.2～0.3mg/L+NAA0.15～0.2mg/L+市售白糖5～8%，pH5.8～6.0。

6.根据权利要求1所述的一种半夏离体球茎的高效诱导方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中的温度条件为24℃～26℃。

7.根据权利要求1所述的一种半夏离体球茎的高效诱导方法，其特征在于：所述步骤（2）和步骤（3）中的培养基经过常规湿热灭菌处理15～30min。