CN101491214A - 半夏人工种茎的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及半夏人工种茎生产方法。该方法包括半夏外植体的选择与消毒，胚状体的诱导与增殖，诱导人工种茎的形成、生长与成熟等步骤。本发明提出了半夏从野生植株到人工种茎生产的相应程序，不同阶段所需要专用培养基等关键技术，能规模化培育生产出成熟的半夏人工种茎，其萌发率可达90％。本发明克服了自然条件下半夏有性繁殖系数低、繁殖周期长、品质易退化、组培苗移栽程序麻烦、离体块茎不成熟难萌发等缺点，为工厂化快速生产半夏人工种茎提供了实用技术，可缓解市场种源的紧缺现状。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域。具体涉及一种半夏人工成熟种茎的离体快速繁殖方法。
背景技术
半夏(Pinellia ternate.(Thunb.)Breit.)，属天南星科植物，草本，株高15-30cm。幼苗常为单叶，卵状心形，2-3年后生3小叶的复叶，叶片全缘；叶柄长10-25cm，基部有珠芽。花单性同株，花序柄长于叶柄，佛焰苞绿色，下部细管状；雌花生于花絮基部，雄花生于上端，肉穗花序下部雌花序与佛焰苞合生达隔膜，单侧着花，雄花序位于隔膜之上，顶部具延长、线形的附属体，超出佛焰苞很长；浆果长圆状卵形，绿色。花期5-7月，果期8-9月。半夏野生资源主要分布在东北、华北及长江流域，主产四川、湖北、贵州、河南、安徽、山东、浙江等省，适生于中等偏酸性沙质壤土和海拔2500m以下的阴生环境，不耐干旱、喜弱光怕强光、喜温，块茎珠芽膨大期地温以18～20℃最为适宜。由此看来，野生半夏分布面积和生长的适宜环境较有限，生长期短，生物量小，但市场需求量大，半夏属于紧缺而极其珍贵的药用植物。
半夏以块茎入药，性味辛、温，有毒。能燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结。治湿痰冷饮，呕吐，反胃，咳喘痰多，胸膈胀满，头晕不眠，外消痛肿。由于半夏有性繁殖系数低，主要靠块茎进行无性繁殖，因些土传病害如病毒病和根腐病等极易发生，导致产量低下、品质退化，由于其自然繁殖系数低、产量又不高，规模化种植受到种源供给不足的影响，加之对野生资源的乱采滥挖，已使半夏野生资源濒临枯竭。
目前，在实验室条件下，已经有通过组培快速繁殖半夏苗，并移栽大田成活的成熟技术(张振媛，荆半夏不同品系的组织培养技术研究，2008硕士论文；郝会军等，半夏组培苗炼苗技术研究，安徽农业科学2008，36(5)：1918-1919和2018)，但此法需要进行生根、炼苗、移栽等多步程序，获得半夏块茎的周期长，生长慢。本发明，为解决这一不足，通过组培技术，改变外植体的诱导发育、生长途径，通过添加相应的生长调节物质，引导生长发育途径由器官发生途径转向胚状体发生途径，直接通过离体培养获得大量成熟的半夏人工种茎，用于播种进一步生长膨大，来收获并提高半夏产量。
发明内容
本发明的目的是提供半夏人工种茎生产技术，大量繁殖半夏离体成熟的种茎，作为播种繁殖材料。克服半夏组培苗在生产应用上的需要生根练苗移栽、不耐储藏和运输等缺点，缓解市场种源紧缺。
本发明是这样实现的：一种半夏的人工种茎生产方法，其步骤如下：
(1)无菌苗培养：将野生半夏植株的幼嫩叶片或叶柄灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm长，接种到无菌苗培养基上，该无菌苗培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+活性炭(AC)0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，培养基的灭菌采用常规方法，即121-126℃下湿热蒸汽灭菌30min，备用，下同。接种后的培养是在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，得到脱毒无菌苗；
(2)胚状体诱导：将步骤(1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm，接到胚状体诱导培养基上，所述的胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.1mg/L吲哚乙酸((IAA)+0.1-0.2mg/L脱落酸(ABA)+30g/L聚乙二醇(PEG)，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，或MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，获得半夏胚状体(见图1-2)；
(3)种茎诱导：将未产生新芽之前的半夏胚状体，转移至诱导培养基上，使其胚状体增殖并发育形成幼小种茎，所述的种茎诱导培养基的组分及配比为：MS基本培养基+0.1mg/L萘乙酸+3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，得到半夏幼小种茎(见图3)；
(4)种茎成熟培养：将步骤(3)得到的半夏幼小种茎转移至种茎成熟培养基上，使其培养至成熟，所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.2-1.0mg/L脱落酸或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，使成熟种茎直径达到3mm以上。在本发明中判定半夏成熟种茎的标准是：半夏种茎上端中间有芽点，直径大小为3mm以上，种茎的外观颜色为深绿色或略带褐色(见图5-6)。
作为优选方案之一，其中步骤(4)中所述的种茎成熟培养基组分及配比可以设计为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.3-0.9mg/L脱落酸，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0。也可以设计为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+28-40g/L聚乙二醇，蔗糖50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0。
本发明将成熟分离的半夏人工种茎直接播种于基质上(一般为通用的蛭石，商购)，置于半阴生长环境条件，温度13～30℃，萌发成苗率可达90％。
本发明的效果：
1.半夏生育期短，鲜嫩外植体获取受时间限制，本发明以获得健壮的脱毒无菌苗为外植体，备用，接种，可随时取材而不受生长季节变化的限制；
2.半夏组培快繁殖获得的组培苗移栽前需要进行生根、炼苗等多步程序，获得半夏块茎的周期长，生长慢，本发明的这种半夏人工种茎培养至成熟仅需60-80天，生命力与抗逆性强，含水量降至65-75％时即可耐贮藏，不需要经过特殊驯化就可以直接用于播种，适合工厂规模化常年生产。
3.本发明所获得的半夏人工种茎单粒直径更大(见图7)，发育更成熟，萌发率高。
4.本发明克服了自然条件下半夏有性繁殖系数低、繁殖周期长、品质易退化、组培苗移栽程序麻烦、离体块茎不成熟易感病、难萌发等缺点，为工厂化快速生产半夏人工种茎提供了实用技术，可缓解市场种源的紧缺现状。
附图说明
图1：是本发明诱导的半夏胚状体I；
图2：是本发明诱导的半夏胚状体II；
图3：是半夏胚状体增殖并发育形成小种茎；
图4：是半夏小种茎逐渐成熟；
图5：是成熟的半夏人工种茎I；
图6：是成熟的半夏人工种茎II；
图7：是成熟的半夏人工种茎单粒直径次数分布；
具体实施方式
实施例1
一种半夏的人工种茎生产方法，其步骤如下：
(1)无菌苗培养：将湖南桂东县野生半夏植株的幼嫩叶片或叶柄灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm长，接种到无菌苗培养基上，该无菌苗培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤+活性炭1.0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，培养基的灭菌采用常规方法，即121-126℃下湿热蒸汽灭菌30min，备用，下同。接种后的培养是在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，得到脱毒无菌苗；
(2)胚状体诱导：将步骤(1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm，接种到胚状体诱导培养基上，所述的胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.05-0.1mg/L吲哚乙酸+0.1-0.2mg/L脱落酸+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，获得半夏胚状体，其胚状体外观曾绿色球形状(见图1)；
(3)种茎诱导：将未产生新芽之前的半夏胚状体，转移至诱导培养基上，使其胚状体增殖并发育形成幼小种茎，所述的种茎诱导培养基的组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，得到半夏幼小种茎(见图3)；
(4)种茎成熟培养：将步骤(3)得到的半夏幼小种茎转移至种茎成熟培养基上，使其培养至成熟，所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.2mg/L脱落酸，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，使成熟种茎直径达到3mm以上。成熟种茎的判定标准：半夏种茎的顶端中心有茎痕，直径大小为3mm以上，种茎的外观颜色为深绿色或略带褐色。
实施例2
根据实施例1所述的基本步骤，其中：
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+30g/L聚乙二醇，其他相同。
实施例3
根据实施例1所述的基本步骤，其中：
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+50g/L聚乙二醇，其他成分及条件同实施例1。
实施例4
根据实施例1所述的基本步骤，其中：
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+28g/L聚乙二醇，其他成分及条件同实施例1。
实施例5
根据实施例1所述的基本步骤，其中：
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.3mg/L脱落酸，其他成分及条件同实施例1。
实施例6
根据实施例1所述的基本步骤，其中：
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤++0.9mg/L脱落酸，其他成分及条件同实施例1。
实施例7
根据实施例1所述的基本步骤，其中：
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤++01.0mg/L脱落酸，其他成分及条件同实施例1。
实施例8
根据实施例1所述的基本步骤，其中：
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+40g/L聚乙二醇，其他成分及条件同实施例1。
实施例9
根据实施例1所述的基本步骤，其中：
步骤(1)所述的无菌苗培养中，其外植体材料选取中国湖北省荆州地区野生半夏植株，所述的无菌苗培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤，其他成分及培养条件同实施例1。
步骤(2)所述的胚状体诱导中，所述的胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，诱导获得胚状体(见图2)，其他成分及条件同实施例1。
步骤(3)所述的种茎诱导中，所述的种茎诱导培养基的组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.5-1.0mg/L脱落酸，其他成分及培养条件同实施例1。
步骤(4)的成熟种茎培养中，所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+1.0mg/L6-苄基氨基嘌呤+50g/L聚乙二醇，蔗糖50g/L，培养获得成熟人工种茎(见图5)，其他成分及培养条件同实施例1。
实施例10
根据实施例3所述的基本步骤，其中：
步骤(2)所述的胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.1mg/L吲哚乙酸+0.2mg/L脱落酸+15g/L聚乙二醇，其他成分及培养条件同实施例1。
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.8mg/L脱落酸，蔗糖30g/L，培养获得成熟半夏人工种茎(见图6)，其他成分及培养条件同实施例1。
本发明的实施效果见表1和2所示：
表1半夏胚状体诱导培养基配比筛选的正交试验(L934)
表2半夏胚状体诱导培养基配比筛选的正交试验结果分析(L934)
Claims (3)
1、一种半夏的人工种茎生产方法，其特征在于以下步骤：
(1)无菌苗培养：将野生半夏植株的幼嫩叶片或叶柄灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm长，接种到无菌苗培养基上，该无菌苗培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄氨基嘌呤+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，得到脱毒无菌苗；
(2)胚状体诱导：将步骤(1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2，或将叶柄切成0.8-1cm长的茎段，接种到所述的胚状体诱导培养基上，所述的胚状体诱导培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05-0.1mg/L吲哚乙酸+0.1-0.2mg/L脱落酸+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，或MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，获得半夏胚状体；
(3)种茎诱导：将未产生新芽之前的半夏胚状体，转移至诱导培养基上，使其胚状体增殖并发育形成幼小种茎，所述的种茎诱导培养基的组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+15g/L聚乙二醇，调pH至5.8-6.0，或者MS基本培养基+0.1mg/L萘乙酸+3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，得到半夏幼小种茎；
(4)种茎成熟培养：将步骤(3)得到的半夏幼小种茎转移至种茎成熟培养基上，使其培养至成熟，所述的种茎成熟培养基组分及其配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.2-1.0mg/L脱落酸，蔗糖30g/L，调pH至5.8-6.0，或MS基本培养基+1.0mg/L6-苄基氨基嘌呤+30-50g/L聚乙二醇，蔗糖50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，使成熟种茎直径达到3mm以上。
2、根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(4)中所述的种茎成熟培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.3-0.9mg/L脱落酸，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0。
3、根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(4)中所述的种茎成熟培养基组分及配比为：MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+28-40g/L聚乙二醇，蔗糖50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0。
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