CN104322371A - 一种铁皮石斛组织培养培养基及其铁皮石斛组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种铁皮石斛组织培养培养基，包括第一阶段--种子萌发形成绿色的原球茎阶段所用的培养基a，第二阶段--原球茎成长为小植株阶段所用的培养基b，第三阶段--原球茎成长为小植株阶段所用的培养基三个阶段的不同培养基，并用此培养基培养铁皮石斛组织的方法。本发明的培养基能高效提高铁皮石斛种子组培萌发率及促进原球茎分化，培养基中不含激素，培养成本低，培养处的石斛组织品质高。

Description

一种铁皮石斛组织培养培养基及其铁皮石斛组织培养方法

技术领域

本发明涉及中草药培养领域，具体涉及铁皮石斛组织培养培养基及其组织培养方法

背景技术

铁皮石斛

铁皮石斛(学名：Dendrobium officinale Kimura et Migo)属微子目，兰科多年生附生草本植物。茎直立，圆柱形，长9-35厘米，粗2-4毫米，萼片和花瓣黄绿色，近相似，长圆状披针形，长约1.8cm，宽4～5mm，花期3～6月，分布于我国秦岭、淮河以南诸省区，生长在高山峻岭悬崖峭壁和岩石缝隙或深山古树上，铁皮石斛的功能与主治：“益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明。”《中华人民共和国药典》2010年版第一部收载作为石斛药用。铁皮石斛为我国传统珍贵药材，《道藏》、《神农本草经》、《本草纲目》、《现代中药大辞典》等均有记载，享有“中国九大仙草之首”的美誉，属于国家优先发展技术领域的重点新产品，是推动中药产业结构优化升级和提高中药产业竞争力的有力品种，因其资源紧缺、用量大，所以铁皮石斛是珍稀濒危、高附加值野生药材规模化野生变家种品种。

植物组织培养技术

植物组织培养是以植物生理学为基础发展起来的一项新兴的应用型现代生物技术。植物组织培养的概念分为广义概念和狭义概念两种，广义上的植物组织培养是指在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官(根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(分生组织、花药组织、胚乳等)、细胞(体细胞和生殖细胞)或原生质体等接种到人工配制的培养基上进行培养，使之再生新细胞或生长发育成完整再生植株的过程。狭义上的植物组织培养是指对植物各种组织进行培养，并使其生长发育成完整再生植株的过程。由于植物组织培养中的培养材料脱离了植物母体，所以又称为植物离体培养。

组织培养技术是农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一，它不仅是农业持续发展的基础，而且是生物技术中应用最广、最具现实意义的领域，被誉为农业发展史上的第4次绿色革命。其对解决经济和社会发展所面临的人口增长、农业资源匮乏、环境污染等重大问题,具有战略意义。我国植物快速繁殖和无病毒种苗生产的研究始于20世纪70年代。组织培养技术在药用植物培养、突变体选育及种质资源保存等方面也有了新的进展。有研究表明，全世界有75％的人口以植物作为治疗、预防疾病的药物来源。

培养基

在植物组织培养过程中，新陈代谢是培养物生命存在和形态建成的基础。培养基是培养物生长发育的基质，一方面它为培养物的生长发育提各种营养需求，另一方面还控制调节着培养物生长的速度和细胞分化的方向。

经过多年的研究，目前人们已经比较清楚地了解了培养植物所需要的培养基主要由水、无机营养物质、有机营养物质、植物生长调节剂、凝固剂等几类物质构成。

培养基是决定植物组培成败的关键因素之一。培养基的种类和成分直接影响着培养物的生长和分化，不同的植物材料对培养基的要求不一样，且不同的培养阶段需要加入的添加物也不同。因此，根据培养物的种类、部位以及不同培养目的筛选适宜的培养基，是植物离体培养工作的重要环节。

现有技术主要是采用石斛的根、茎、叶作为外植体，本发明通过对种子进行组培，保证了种源的地道性。

现有的石斛组织培养基，基培养方法成本高，效率底，耗时间等类似问题，大多含有激素，所培养出来的石斛品质不是特别好。

发明内容

一种铁皮石斛组织培养培养基及其组织培养方法，本发明的培养基能高效提高铁皮石斛种子组培萌发率及促进原球茎分化，培养基中不含激素，培养成本低，培养处的石斛组织品质高。

本发明采用的技术方案如下：

一种铁皮石斛组织培养培养基，其特征在于，包括第一阶段--种子萌发形成绿色的原球茎阶段所用的培养基a，第二阶段--原球茎成长为小植株阶段所用的培养基b，第三阶段--原球茎成长为小植株阶段所用的培养基三个阶段的不同培养基，三个培养基的配方如下：

培养基a的配方为：

组成成分	数量(mg/l)	组成成分	数量(mg/l)
				硝酸铵	825	钼酸钠	0.25
硝酸钾	950	硫酸铜	0.025

氯化钙	220	氯化钴	0.025
				硫酸镁	185	硫酸铁	27.8
磷酸二氢钾	85	琼脂	4500
				碘化钾	0.83	蔗糖	30000
硼酸	5.2	活性炭	500
				硫酸镁	22.3
硫酸锌	3.6

培养基b的配方为：

组成成分	数量(mg/l)	组成成分	数量(mg/l)
				硝酸铵	825	钼酸钠	0.25
硝酸钾	950	硫酸铜	0.025
				氯化钙	220	氯化钴	0.025
硫酸镁	185	硫酸铁	27.8
				磷酸二氢钾	85	琼脂	4500
碘化钾	0.83	蔗糖	30000
				硼酸	5.2	活性炭	500
硫酸镁	22.3	胰蛋白	1000
				硫酸锌	3.6	香蕉泥	75000

培养基c的配方为：

组成成分	数量(mg/l)	组成成分	数量(mg/l)
				硝酸铵	1650	钼酸钠	0.25
硝酸钾	1900	硫酸铜	0.025
				氯化钙	440	氯化钴	0.025
硫酸镁	370	硫酸铁	27.8
				磷酸二氢钾	170	琼脂	4500
碘化钾	0.83	蔗糖	30000
				硼酸	5.2	活性炭	1000

硫酸镁	22.3	胰蛋白	1000
				硫酸锌	3.6	香蕉泥	75000

一种铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)第一阶段：将引进的石斛蒴果进行消毒处理，采用1‰HgCl浸泡9-11min，处理好的蒴果在无菌条件下，将其内部的种子接种到培养基a上，培养一个月，萌发形成绿色的原球茎，培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间10-12h/d；

(2)第二阶段：将第一阶段种子萌发生成的原球茎，接种到培养基b上，诱导培养2-3个月，原球茎成长为小植株，培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间10-12h/d。

(3)第三阶段：将已经由原球茎分化成的小植株接种到生根培养基c上，培养3-4个月，培育出高5cm的大苗，随进行炼苗移栽，炼苗时保证在75％-80％的含水量，保证空气湿润，温度不宜过高，在25℃左右；培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间10-12h/d。

所述的铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于：所述的石斛蒴果为霍山石斛蒴果。

本发明的有益效果

采用本发明的培养基培养石斛时，种子发芽率高、组织分化快、生根率高，第一阶段铁皮石斛的种子萌发率可达到95％以上。，第二阶段铁皮石斛的分化率可达95％，第三阶段植株的生根率达95％以上。所用的培养基不含激素，培养出来的石斛品质高。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例：

铁皮石斛组织培养方法步骤：

第一阶段：将引进的霍山石斛蒴果进行消毒处理，采用1‰HgCl浸泡10min。将处理好的蒴果在无菌条件下，将其内部的种子接种到培养基上，培养一个月，萌发形成绿色的原球茎，培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间12h/d；第二阶段：将第一阶段种子萌发生成的原球茎，接种到1/2MS基本培养基+1/2g/L活性炭+30g/L蔗糖+1g/L胰蛋白+75g/L香蕉泥这个培养基上，诱导培养2-3个月，原球茎成长为小植株，培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间12h/d。

第三阶段：将已经由原球茎分化成的小植株接种到生根培养基上培养3-4个月，培育出高5cm的大苗，随进行炼苗移栽，炼苗时保证在75％-80％的含水量，保证空气湿润，温度不宜过高，在25℃左右；培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间12h/d。

其中第一阶段使用的1/2MS基本培养基+1/2g/L活性炭+30g/L蔗糖培养基组成成分(定容时采用普通自来水)：

组成成分	数量(mg/l)	组成成分	数量(mg/l)
				硝酸铵	825	钼酸钠	0.25
硝酸钾	950	硫酸铜	0.025
				氯化钙	220	氯化钴	0.025
硫酸镁	185	硫酸铁	27.8
				磷酸二氢钾	85	琼脂	4500
碘化钾	0.83	蔗糖	30000
				硼酸	5.2	活性炭	500
硫酸镁	22.3
				硫酸锌	3.6

第二阶段使用的1/2MS基本培养基+1/2g/L活性炭+30g/L蔗糖+1g/L胰蛋白+75g/L香蕉泥培养基组成成分(定容时采用普通自来水)：

组成成分	数量(mg/l)	组成成分	数量(mg/l)
				硝酸铵	825	钼酸钠	0.25
硝酸钾	950	硫酸铜	0.025
				氯化钙	220	氯化钴	0.025
硫酸镁	185	硫酸铁	27.8
				磷酸二氢钾	85	琼脂	4500

碘化钾	0.83	蔗糖	30000
				硼酸	5.2	活性炭	500
硫酸镁	22.3	胰蛋白	1000
				硫酸锌	3.6	香蕉泥	75000

第三阶段使用的MS基本培养基+1g/L活性炭+30g/L蔗糖+1g/L胰蛋白+75g/L香蕉泥培养基组成成分(定容时采用普通自来水)：

组成成分	数量(mg/l)	组成成分	数量(mg/l)
				硝酸铵	1650	钼酸钠	0.25
硝酸钾	1900	硫酸铜	0.025
				氯化钙	440	氯化钴	0.025
硫酸镁	370	硫酸铁	27.8
				磷酸二氢钾	170	琼脂	4500
碘化钾	0.83	蔗糖	30000
				硼酸	5.2	活性炭	1000
硫酸镁	22.3	胰蛋白	1000
				硫酸锌	3.6	香蕉泥	75000

Claims (3)

1.一种铁皮石斛组织培养培养基，其特征在于，包括第一阶段--种子萌发形成绿色的原球茎阶段所用的培养基a，第二阶段--原球茎成长为小植株阶段所用的培养基b，第三阶段--原球茎成长为小植株阶段所用的培养基三个阶段的不同培养基，三个培养基的配方如下：

培养基a的配方为：

组成成分 数量(mg/l) 组成成分 数量(mg/l) 硝酸铵 825 钼酸钠 0.25 硝酸钾 950 硫酸铜 0.025 氯化钙 220 氯化钴 0.025 硫酸镁 185 硫酸铁 27.8 磷酸二氢钾 85 琼脂 4500 碘化钾 0.83 蔗糖 30000 硼酸 5.2 活性炭 500 硫酸镁 22.3 硫酸锌 3.6

培养基b的配方为：

组成成分 数量(mg/l) 组成成分 数量(mg/l) 硝酸铵 825 钼酸钠 0.25 硝酸钾 950 硫酸铜 0.025 氯化钙 220 氯化钴 0.025 硫酸镁 185 硫酸铁 27.8 磷酸二氢钾 85 琼脂 4500 碘化钾 0.83 蔗糖 30000 硼酸 5.2 活性炭 500 硫酸镁 22.3 胰蛋白 1000 硫酸锌 3.6 香蕉泥 75000

培养基c的配方为：

组成成分 数量(mg/l) 组成成分 数量(mg/l) 硝酸铵 1650 钼酸钠 0.25 硝酸钾 1900 硫酸铜 0.025 氯化钙 440 氯化钴 0.025 硫酸镁 370 硫酸铁 27.8 磷酸二氢钾 170 琼脂 4500 碘化钾 0.83 蔗糖 30000 硼酸 5.2 活性炭 1000 硫酸镁 22.3 胰蛋白 1000 硫酸锌 3.6 香蕉泥 75000

2.一种采用权利要求1的培养基培养铁皮石斛组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)第一阶段：将引进的石斛蒴果进行消毒处理，采用1‰HgCl浸泡9-11min，处理好的蒴果在无菌条件下，将其内部的种子接种到培养基a上，培养一个月，萌发形成绿色的原球茎，培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间10-12h/d；

(2)第二阶段：将第一阶段种子萌发生成的原球茎，接种到培养基b上，诱导培养2-3个月，原球茎成长为小植株，培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间10-12h/d。

(3)第三阶段：将已经由原球茎分化成的小植株接种到生根培养基c上，培养3-4个月，培育出高5cm的大苗，随进行炼苗移栽，炼苗时保证在75％-80％的含水量，保证空气湿润，温度不宜过高，在25℃左右；培养温度23-27℃，光照度1500-2000lx，光照时间10-12h/d。

3.根据权利要求2所述的铁皮石斛组织培养的方法，其特征在于：所述的石斛蒴果为霍山石斛蒴果。