CN102835318A - 铁皮石斛在非无菌条件下无糖微体快繁技术 - Google Patents

铁皮石斛在非无菌条件下无糖微体快繁技术 Download PDF

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Abstract

本发明为生物科技领域新的快繁技术，涉及铁皮石斛在非无菌条件下的快速繁殖的方法，其主要步序是通过铁皮石斛种子的无菌萌发、原球茎及幼苗的形成后，即可开始在非无菌下继代快繁，用松树皮粗粉加入1/2MS培养基为基质，不含糖及琼脂，种植铁皮石斛幼苗后放入密闭容器，并通二氧化碳，接近自然条件自养生长，相对在较短时间内促进幼苗的生根、增长和壮苗，其特点为缩短培苗的时间，在继代培养时不用高压灭菌，在常态下即可进行苗的繁殖生长，且不易污染，培植出的苗叶大茎粗为优质苗。与常规铁皮石斛的组培相比，有节省能源消耗和减少人工成本的优点，具有快、省、好三大优点的好方法。

Description

铁皮石斛在非无菌条件下无糖微体快繁技术
技术领域
本发明为生物科技领域的快繁技术，涉及名贵药材铁皮石斛在非无菌条件下快速繁殖的方法。
技术背景
石斛是我国常用中药，我国药典2010年版一部已把铁皮石斛单列为一个品种收藏，因此呈现出其功效或价值比一般石斛更珍贵的独特疗效，铁皮石斛Dendrobium 0fficinale Kimura Et Migo具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等功效，常用于热病伤津，口干烦渴、病后虚热等多种病症。因森林生态破坏与资源过度开采，野生资源频临枯竭，1987年国务院将其列为国家重点保护植物。
为了实现铁皮石斛资源的可持续发展，科研人员自20世纪70年代开始了人工栽培技术的研究工作，直到新世纪，新种子生产、组织培养和设施栽培等人工繁育关键技术才得以突破，并迅速推广应用。
现有的铁皮石斛组培技术。从种子的萌发、原球茎及种苗的诱导，种子的生根、再到种苗的增殖及壮苗培养，其时间周期要9-12个月，其整个周期长，耗能大，人工成本高。本发明使用的培养快繁技术，包括开始的种子无菌萌发，原球茎及种子的诱导和培养，直到小苗形成后，开始在非无菌条件下继代快繁，具有出苗时间快，节约能源和成本，所培育出的壮苗叶大茎粗的优质苗，本发明在近自然的条件下进行可明显提高其成活率。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁皮石斛在非无菌条件下的繁殖技术，该方法成本低，操作简便，节省能源和人力成本，较好的解决了目前存在铁皮石斛组织培养过程成本高，组培周期长的问题。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
1、种子的无菌萌发
采摘铁皮石斛的果实进行表面消毒处理，将种子播种常规石斛无菌萌发培养基上诱导种子无菌萌发
2、原球茎及其种苗的诱导和培养
播种后的培养瓶置于原球茎及种幼苗诱导条件下培养，培养条件为：温度10-30℃，光照为自然光或日光灯500-1500Lux，种子萌发形成原球茎和种苗
3、也可将无菌苗继续生根
根据需要将上述条件下培养的种苗转移到诱导生根的条件下培养以获得大量形状优良的无菌苗，诱导生根的培养条件为：自然光、日光灯、led灯没日光照12-14小时，光照强度为300-4000Lux，培养温度为20-35℃
铁皮石斛在非无菌条件下无糖微体繁殖
无根或有根的无菌苗洗去培养基晾干待用
将松树皮自然晒干后打成粗粉(20目)备用
可用1/2MS、MS、N6、CHB、B5等培养基，他们中的成分除不加蔗糖、琼脂、维生素，其他的无机物和有机物均要
激素
同时加在培养基液体中，包括NAA及6BA，NAA的浓度为0.1mg/L-2mg/L，6BA0.2mg/L-2mg/L。
配置培养基
其固体基质如松树皮粗粉加培养基液体如1/2MS(含激素)的比例为1∶2-5，以混匀后手抓成团，一压即散，不宜含过多的水份，一般以1：2.5-3.5为好，配置好的培养基备用。
装并或托盘
并子或托盘适当用消毒剂如1/2000高锰酸钾溶液或1/1000的新洁而灭，擦洗消毒完后可装入备用的培养基。
实施环境
是在密闭的容器(包括各种大小的容器、框架)或房间等，在生产中应用大型容器或房间为宜
非无菌条件的快速繁殖
将无菌条件下的培养成的幼苗(有2张叶以上)，用常水小心洗去培养基后，晾干即可种入已装有培养基的容器内，并将上述种好苗的容器(并子或托盘)，放置在密封的环境中，并开始通入二氧化碳气体，二氧化碳的浓度为0.1％-20％，其中以0.5％-5％为好，光照开始5天为3000Lux，5-10天为5000Lux，10天后8000Lux以上，但不超过20000Lux，每天光照12h-14h，密封环境内的温度20℃-36℃，相对湿度60％-90％，在上述条件下培养50-80天，待苗有5片以上，茎有3mm-5mm以上粗即为大苗。
培养出的大苗的驯化
将在CO2培养器(室)形成上述大苗取出后放置在有遮阴和自然温度条件下，放置10-15天，保持通风、遮阳，适当淋水，到时即可出苗移栽。
具体实施方式
实施例1
下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。但本发明的内容并不仅仅局限于此。
自广西桂平采集的铁皮石斛蒴果表面消毒，获得无菌种子，种子播种在无菌萌发固体培养基上面，培养基组成为1/2MS，添加蔗糖2％，马铃薯提取物20％，煮20分钟后搅成乳状加入培养基中，激素0.5mg/L，琼脂为0.5％，PH值6.2。培养瓶置于温度为20-25℃，光照为自然光或日光灯1500Lux，培养2个月。
将萌发的原球茎进行诱导和繁殖
诱导和繁殖的方法为1/2MS，15％马铃薯，3％的蔗糖，煮沸半小时，搅成乳状加入培养基中，另加NAA0.5mg/L，6BA0.5mg/L，活性炭0.2％，琼脂0.6％，在上述培养基中培养一个月。
将上述繁殖的无菌幼苗可移植进行生根培养，培养基为1/2MS，香蕉提取物10％，蔗糖2％，琼脂为0.5％，NAA0.5mg/L，活性炭2g/L，PH5.8，常规高压灭菌，培养条件温度20-32℃，光照度2500-3500Lux。培养时间一个月
非无菌条件下快速繁殖，将无菌条件下培养的幼苗(2张叶以上)，包括生根或不生根的均可，用糖水洗去培养基后，即可种入无糖的培养基托盘中，无糖培养基的配方为：松树皮粗粉加1/2MS培养基，含激素，固体更液体的比例为1∶2.5，以混匀后手抓成团，一压即散，不宜含过多的水份，装入托盘，托盘预先用消毒剂抹洗干净，然后放入密闭的容器内，然后通入二氧化碳，二氧化碳浓度为1％-5％，光照开始5天为3000Lux，5-10天为5000Lux，10天后8000Lux以上，但不超过20000Lux，每天光照12h-14h，密封环境内的温度20℃-36℃，相对湿度60％-90％，在上述条件下培养50-80天，待苗有5片以上，茎有3mm-5mm以上粗即为大苗。
将在CO2培养器(室)形成上述大苗取出后放置在有遮阴和自然温度条件下，放置10-15天，保持通风、遮阳，适当淋水，到时即可出苗移栽。
实施例2
浙江乐亲采集的铁皮石斛蒴果表面消毒，获得无菌种子，种子播种在无菌萌发固体培养基上面，培养基组成为1/2MS，添加蔗糖2％，马铃薯提取物20％，煮20分钟后搅成乳状加入培养基中，激素0.5mg/L，琼脂为0.5％，PH值6.2。培养瓶置于温度为20-25℃，光照为自然光或日光灯1500Lux，培养2个月。
将萌发的原球茎进行诱导和繁殖
诱导和繁殖的方法为1/2MS，15％马铃薯，3％的蔗糖，煮沸半小时，搅成乳状加入培养基中，另加NAA0.1mg/L，6BA1.0mg/L，活性炭0.2％，琼脂0.6％，在上述培养基中培养一个月。
将上述繁殖的无菌幼苗可移植进行生根培养，培养基为MS，香蕉提取物15％，蔗糖3％，琼脂为0.5％，NAA0.5mg/L，活性炭2g/L，PH5.8，常规高压灭菌，培养条件温度20-32℃，光照度2500-3500Lux。培养时间一个月
非无菌条件下快速繁殖，将无菌条件下培养的幼苗(2张叶以上)，包括生根或不生根的均可，用常水洗去培养基后，即可种入无糖的培养基托盘中，无糖培养基的配方为：松树皮粗粉加MS培养基，含激素0.5mg/L，固体与液体的比例为1∶2.5，以混匀后手抓成团，一压即散，不宜含过多的水份，装入托盘，托盘预先用消毒剂抹洗干净，然后放入密闭的容器内，然后通入二氧化碳，二氧化碳浓度为2％-10％，光照开始5天为3000Lux，5-10天为5000Lux，10天后8000Lux以上，但不超过20000Lux，每天光照12h-14h，密封环境内的温度20℃-30℃，相对湿度80％-90％，在上述条件下培养60-90天，待苗有5片叶以上，茎有3mm-5mm以上粗即为大苗。
将在CO2培养器(室)形成上述大苗取出后放置在有遮阴和自然温度条件下，放置5-10天，保持通风、遮阳，适当淋水，到时即可出苗移栽。

Claims (2)

1.一种铁皮石斛在非无菌条件下无糖微体繁殖技术，前期的种子无菌萌发、圆球茎的繁殖及种苗的诱导和培养直到长成幼苗均为常规的有糖无菌培养，当铁皮石斛幼苗有2张叶以上时即可进行非无菌条件下的无糖微体繁殖阶段。
(1)其实施环境
是在密闭的容器(包括各种大小的容器、框架)或房间等，在生产中应用大型容器或房间为宜。
(2)培养基质
采用松树皮，经过天然阳光下晒干，机械打碎成20目粗粉备用，亦可适当添加无机或有机的其他基质，如蛭石、珍珠岩、沙子、塑料泡沫、石棉、纤维素物质，一般添加的比例为0％-50％，还可适当加入活性炭和泥炭。
(3)培养基液体
可用1/2MS、MS、N6、CHB、B5等均可，他们中的成分除不加蔗糖、琼脂、维生素，其他的无机物和有机物均要。
(4)激素
同时加在培养基液体中，包括NAA及6BA，NAA的浓度为0.1mg/L-2mg/L，6BA0.2mg/L-2mg/L。
(5)配置培养基
其固体基质如松树皮粗粉加培养基液体如1/2MS(含激素)的比例为1：2-5，以混匀后手抓成团，一压即散，不宜含过多的水份，一般以1：2.5-3.5为好，配置好的培养基备用。
(6)装并或托盘
并子或托盘适当用消毒剂如1/2000高锰酸钾溶液或1/1000的新洁而灭，擦洗消毒完后可装入备用的培养基。
(7)非无菌条件的快速繁殖
将无菌条件下的培养成的幼苗(有2张叶以上)，用常水小心洗去培养基后，晾干即可种入已装有培养基的容器内，并将上述种好苗的容器(并子或托盘)，放置在密封的环境中，并开始通入二氧化碳气体，二氧化碳的浓度为0.1％-20％，其中以0.5％-5％为好，光照开始5天为3000Lux，5-10天为5000Lux，10天后8000Lux以上，但不超过20000Lux，每天光照12h-14h，密封环境内的温度20℃-36℃，相对湿度60％-90％，在上述条件下培养50-80天，待苗有5片以上，茎有3mm-5mm以上粗即为大苗。
2.根据权利要求1所述方法，其特征是培养出的大苗的驯化方法为：
将在CO2培养器(室)形成上述大苗取出后放置在有遮阴和自然温度条件下，放置10-15天，保持通风、遮阳，适当淋水，到时即可出苗移栽。
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