CN103039368B - 一种铁皮石斛无糖组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种铁皮石斛无糖组织培养方法，是将铁皮石斛小段组织接种于石斛无糖组织培养初代培养基置于不锈钢外壳植物生长箱进行培养，再将初代培养的无根苗切割为单苗接种于石斛无糖组织培养继代培养基置于不锈钢外壳植物生长箱进行培养。本发明可解决传统组培过程中污染率高、生根率低、品质差的问题，提高铁皮石斛组培苗的质量和产苗率，缩短培养周期，并且降低组培苗生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种铁皮石斛无糖组织培养方法，属于农业技术领域。
背景技术
铁皮石斛，为兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐－5℃的低温。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛和金钗石斛为石斛之极品，铁皮石斛因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，中药名：石斛，属补益药中的补阴药，《中国药典》：益胃生津，滋阴清热。铁皮石斛等少数品种之嫩茎，扭成螺旋状或弹簧状，晒干，商品称为耳环石斛，又名枫斗。多年以来，商品石斛主要依靠野生药用石斛资源，随着药用石斛开发利用的不断深入和国内外需求量的逐年增加，我国野生药用石斛资源遭到了严重破坏，有些地区甚至面临枯竭。为了保护野生兰科植物资源，各国都出台了许多禁止采挖或销售野生兰科植物的法规和条例，如1975年生效的《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES），把所有兰科植物全部列入附录Ⅰ和Ⅱ中；于1987年国务院出台的《野生药材资源保护管理条例》中，环草石斛、黄草石斛、金钗石斛、马鞭石斛和铁皮石斛被列为国家三级珍稀濒危保护植物。这些政策措施对野生药用石斛资源的妥善保护起到了重要作用。传统铁皮石斛组织培养小植株主要依靠培养基中的糖作为碳源，极易引起微生物的污染。为了减少微生物的污染，必须使用封闭的、小的培养容器。培养容器小，并且由于培养基中糖的存在，导致叶片表层结构发育差，气孔开闭功能不强，叶片小，叶绿素含量低，最终抑制和降低了小植株的光合作用能力。与植株自然生长差异悬殊的容器内环境，还导致植株生理、形态上的一定紊乱，难以适应的会生长发育延缓或死亡，有的会出现植株生长细弱，叶片舒展度差，生根不良，引起驯化阶段植株较高的死亡率，为此必须使用植物生长调节剂，但是植物生长调节剂的使用又会导致畸形和变异。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁皮石斛无糖组织培养方法，可解决传统组培过程中污染率高、生根率低、品质差的问题，可提高铁皮石斛组培苗的质量和产苗率，缩短培养周期，并且降低组培苗生产成本。
本发明的目的是这样实现的：
本发明的铁皮石斛无糖组织培养方法包括以下步骤：
（1）外植体准备：选择典型性状健康的铁皮石斛种苗的茎，以茎芽为中心上下各留0.5cm剪下茎段作为体皮石斛无糖组织培养的外植体，将外植体浸泡在酒精体积百分含量70％的烧杯中2分钟进行灭菌，然后用无菌水冲洗l 次；
（2）初代无糖组织培养：将经步骤（1）处理的外植体接种至铁皮石斛无糖组织培养初代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行初代培养；
（3）无根苗筛选：将经过步骤（2）培养的无根苗进行筛选，选择大小达3 - 4cm 的无根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的无根苗切割为单苗；
（4）继代无糖组织培养：将经步骤（3）处理的单苗接种至铁皮石斛无糖组织培养继代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行继代培养。
在步骤（2）所述铁皮石斛无糖组织培养初代培养基中，a-萘乙酸的含量为0.1—0.5mg/L， 6-苄氨基腺嘌呤的含量为1—3mg/L，香蕉汁的含量为80—120g/L，活性炭的含量为200—300mg / L ，0.25毫米的沙粒的含量为8—10g/L，PH为5.6。
在步骤（2）所述的初代无糖组织培养中，培养周期20—40天，CO2浓度650±50μL/L，培养温度20℃—26℃，光照强度1800—2100Lx，光照时间16—20小时/天。
在步骤（4）所述铁皮石斛无糖组织培养继代培养基中，6-苄氨基腺嘌呤的含量为1—3mg/L，香蕉汁的含量为80—120g/L，活性炭的含量为300—600mg / L， 0.25毫米的沙粒的含量为8—10g/L， PH为5.6。
在步骤（4）所述的继代无糖组织培养中，培养周期30—60天，CO2浓度650±50μL/L，培养温度20℃—26℃，光照强度1800—2100Lx，光照时间16—20小时/天。
本发明的这种铁皮石斛无糖组织培养方法与传统铁皮石斛组织培养方法区别在于：
（1）碳源的改变：在传统的植物组培快繁技术中，小植株以糖（如蔗糖、白砂糖、果糖等）作为主要碳源进行异养或兼养生长，糖被看作是植物组织培养中必不可少的物质。而本发明中则用 CO2替代糖作为小植株生长的唯一碳源，通过强制性换气系统供给小植株生长所需CO2，使其在人工光照下，吸收 CO2 进行完全的自养生长，在一定程度上避免了微生物的污染。
（2） 培养基质的改变：在传统的组织培养中，通常使用琼脂作为培养基质，它的透气性差，不利于水分、气体和营养物质的移动和吸收。本发明使用沙粒作为培养基质，此基质具有良好的透气性，可以极大地提高小植株的生根率和生根质量， 而且与琼脂相比，此无机基质价格相对低廉， 节约了培养成本。
（3 ）培养容器的改变：在传统的组织培养中，由于培养基中糖的存在，为了防止污染，只能使用小的培养容器。本发明在培养过程中不使用糖及各类有机物质，极大地避免了污染的发生，因此选用不锈钢外壳植物生长箱作为培养容器，既可以人工控制CO2浓度又可以人工控制光照强度。
具体实施方式
本发面详细实施方式如下：
（1）外植体准备：选择典型性状健康的铁皮石斛种苗的茎，以茎芽为中心上下各留0.5cm剪下茎段作为体皮石斛无糖组织培养的外植体，将外植体浸泡在酒精体积百分含量70％的烧杯中2分钟进行灭菌，然后用无菌水冲洗l 次；
（2）初代无糖组织培养：将经步骤（1）处理的外植体接种至铁皮石斛无糖组织培养初代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行初代培养，培养周期20—40天，CO2浓度（650±50）μL/L，培养温度20℃—26℃，光照强度1800—2100Lx，光照时间16—20小时/天；所述铁皮石斛无糖组织培养初代培养基包含以下成分：MS培养基， a-萘乙酸的含量为0.1—0.5mg/L， 6-苄氨基腺嘌呤的含量为1—3mg/L，香蕉汁的含量为80—120g/L，活性炭的含量为 200—300mg / L ，0.25毫米的沙粒的含量为8—10g/L，PH为5.6；
（3）无根苗筛选：将经过步骤（2）培养的无根苗进行筛选，选择大小达3 - 4cm 的无根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的无根苗切割为单苗；
（4）继代无糖组织培养：将经步骤（3）处理的单苗接种至铁皮石斛无糖组织培养继代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行继代培养，培养周期30—60天，CO2浓度（650±50）μL/L，培养温度20℃—26℃，光照强度1800—2100Lx，光照时间16—20小时/天；所述铁皮石斛无糖组织培养继代培养基包含以下成分：MS培养基， 6-苄氨基腺嘌呤的含量为1—3mg/L，香蕉汁的含量为80—120g/L，活性炭的含量为300—600mg / L， 0.25毫米的沙粒的含量为8—10g/L， PH为5.6。
实施例
选择产于福建优质铁皮石斛种苗的茎，经步骤（1）处理，接种至铁皮石斛无糖组织培养初代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行初代培养，培养按照培养基配方和培养条件分8组进行。
| 组A | 组B | 组C | 组D | 组E | 组F | 组G | 组H | |
| a-萘乙酸（mg/L） | 0.1 | 0.2 | 0．2 | 0.3 | 0.3 | 0.4 | 0.4 | 0.5 |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 | 120 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 200 | 250 | 250 | 275 | 275 | 300 | 300 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 9 | 10 | 10 | 9 | 8 | 9 | 10 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 | 2000 | 2100 | 2100 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 24 | 26 | 26 | 22 | 24 | 24 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 | 18 | 20 | 18 |
| 培养周期（天） | 40 | 35 | 30 | 25 | 20 | 30 | 35 | 30 |
将经过步骤（2）培养的无根苗进行筛选，选择大小达3 - 4cm 的无根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的无根苗切割为单苗；
经步骤（3）处理的同组单苗，接种至铁皮石斛无糖组织培养继代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行继代培养，培养按照培养基配方和培养条件再分5组进行。
组A
| 组A1 | 组A2 | 组A3 | 组A4 | 组A5 | |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 250 | 274 | 300 | 250 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 10 | 10 | 9 | 8 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 26 | 24 | 20 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 |
| 培养周期（天） | 30 | 40 | 50 | 55 | 60 |
组B
| 组B1 | 组B2 | 组B3 | 组B4 | 组B5 | |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 250 | 274 | 300 | 250 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 10 | 10 | 9 | 8 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 26 | 24 | 20 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 |
| 培养周期（天） | 30 | 40 | 50 | 55 | 60 |
组C
| 组C1 | 组C2 | 组C3 | 组C4 | 组C5 | |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 250 | 274 | 300 | 250 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 10 | 10 | 9 | 8 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 26 | 24 | 20 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 |
| 培养周期（天） | 30 | 40 | 50 | 55 | 60 |
组D
| 组D1 | 组D2 | 组D3 | 组D4 | 组D5 | |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 250 | 274 | 300 | 250 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 10 | 10 | 9 | 8 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 26 | 24 | 20 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 |
| 培养周期（天） | 30 | 40 | 50 | 55 | 60 |
组E
| 组E1 | 组E2 | 组E3 | 组E4 | 组E5 | |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 250 | 274 | 300 | 250 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 10 | 10 | 9 | 8 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 26 | 24 | 20 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 |
| 培养周期（天） | 30 | 40 | 50 | 55 | 60 |
组F
| 组F1 | 组F2 | 组F3 | 组F4 | 组F5 | |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 250 | 274 | 300 | 250 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 10 | 10 | 9 | 8 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 26 | 24 | 20 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 |
| 培养周期（天） | 30 | 40 | 50 | 55 | 60 |
组G
| 组G1 | 组G2 | 组G3 | 组G4 | 组G5 | |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 250 | 274 | 300 | 250 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 10 | 10 | 9 | 8 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 26 | 24 | 20 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 |
| 培养周期（天） | 30 | 40 | 50 | 55 | 60 |
组H
| 组H1 | 组H2 | 组H3 | 组H4 | 组H5 | |
| 6-苄氨基腺嘌呤（mg/L） | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 |
| 香蕉汁（g/L） | 80 | 80 | 100 | 100 | 120 |
| 活性炭（mg/L） | 200 | 250 | 274 | 300 | 250 |
| 0.25毫米的沙粒（g/L） | 8 | 10 | 10 | 9 | 8 |
| 光照强度（LX） | 1800 | 1800 | 1800 | 2000 | 2000 |
| 培养温度（℃） | 20 | 24 | 26 | 24 | 20 |
| 光照时间（小时/天） | 16 | 18 | 20 | 18 | 16 |
| 培养周期（天） | 30 | 40 | 50 | 55 | 60 |
通过上述实验显示：本发明40组实施例基本都能在3个月培养周期达到茎高8㎝，根数3根，叶片数6片可以用于种植的合格组培苗，其中以组E3生长最为显著，到达组平均茎高8.5㎝，组平均根数3.7根，组平均叶片数7.4片。
Claims (1)
1.一种铁皮石斛无糖组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）外植体准备：选择典型性状健康的铁皮石斛种苗的茎，以茎芽为中心上下各留0.5cm剪下茎段作为铁皮石斛无糖组织培养的外植体，将外植体浸泡在酒精体积百分含量70％的烧杯中2分钟进行灭菌，然后用无菌水冲洗l 次；
（2）初代无糖组织培养：将经步骤（1）处理的外植体接种至铁皮石斛无糖组织培养初代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行初代培养；
（3）无根苗筛选：将经过步骤（2）培养的无根苗进行筛选，选择大小达3 - 4cm 的无根苗并用无菌水冲洗，将冲洗干净的无根苗切割为单苗；
（4）继代无糖组织培养：将经步骤（3）处理的单苗接种至铁皮石斛无糖组织培养继代培养基中，置于不锈钢外壳植物生长箱进行继代培养；
在步骤（2）所述铁皮石斛无糖组织培养初代培养基中，a-萘乙酸的含量为0.1—0.5mg/L， 6-苄氨基腺嘌呤的含量为1—3mg/L，香蕉汁的含量为80—120g/L，活性炭的含量为200—300mg / L ，0.25毫米的沙粒的含量为8—10g/L，pH为5.6；
在步骤（2）所述的初代无糖组织培养中，培养周期20—40天，CO2浓度650±50μL/L，培养温度20℃—26℃，光照强度1800—2100Lx，光照时间16—20小时/天；
在步骤（4）所述铁皮石斛无糖组织培养继代培养基中，6-苄氨基腺嘌呤的含量为1—3mg/L，香蕉汁的含量为80—120g/L，活性炭的含量为300—600mg / L， 0.25毫米的沙粒的含量为8—10g/L， pH为5.6；
在步骤（4）所述的继代无糖组织培养中，培养周期30—60天，CO2浓度650±50μL/L，培养温度20℃—26℃，光照强度1800—2100Lx，光照时间16—20小时/天。
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