CN104813932A

CN104813932A - 一种铁皮石斛的离体保存方法

Info

Publication number: CN104813932A
Application number: CN201510106214.1A
Authority: CN
Inventors: 蒋瑛倩
Original assignee: CHANGZHOU ZHANHUA ROBOT Co Ltd
Current assignee: CHANGZHOU ZHANHUA ROBOT Co Ltd
Priority date: 2015-03-12
Filing date: 2015-03-12
Publication date: 2015-08-05

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛的离体保存方法，包括铁皮石斛的组培快繁，再利用组培快繁得到的具有4~5片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，所述的保存培养基为1/2MS+CCC 0.9mg/l +AC 0.45%，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。利用本发明的方法保存的铁皮石斛的恢复率较高，恢复情况良好。

Description

一种铁皮石斛的离体保存方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体地，涉及铁皮石斛的离体保存方法。

背景技术

铁皮石斛，为兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐－5℃的低温。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，属补益药中的补阴药。野生铁皮石斛的自然繁殖能力低、生长缓慢，对生长的环境条件要求苛刻。在引种栽培时较难成活，给种质保存与利用带来较大的困难。因此找出一种种质资源保护的有效新途径，对铁皮石斛资源的修复和再生，防止流失、退化和灭绝，保障资源的可持续利用具有重要意义。

目前如何妥善保存稀有的种质资源已成为一个急需解决的问题，而组织培养为离体种质保存提供了最便捷、稳定的手段。

组织培养的关键技术是培养基及其培养条件，同一属不同种的植物其培养条件也不尽相同，因此，对同一个属的不同种的植物组织培养条件的研究也十分必要。

公开号为CN101213941A的中国发明专利“石斛属的快繁与离体保存方法”一文中公开了石斛属包括铁皮石斛的离体保存方法，但是在实际操作过程中，发现此保存条件下铁皮石斛的保存效果并不是十分理想，因此，本发明在此基础上，对其离体保存进行了进一步的研究，提供一种针对铁皮石斛保存效果更好的保存方法。

发明内容

针对现状，本发明提供一种铁皮石斛的离体保存方法，利用组织培养技术对其进行离体繁殖，通过采用合适的保存培养基对其进行离体保存，可以大大提高种质资源的利用率。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种铁皮石斛的离体保存方法，包括如下步骤：

（1）外植体诱导培养：取野外采集的铁皮石斛的茎尖作为外植体，在70%乙醇中浸泡10~30s，无菌水冲洗2~3次，投入添加2%吐温-20的0.1%升汞4min，最后用无菌水冲洗2~3次后切割为0.5~1.0cm长接种在接种培养基上，培养10~14天，顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述培养基的pH值为5.1，培养温度为24~28°C，光照强度1600~2000lx，光照时间为12小时/天。

（2）壮苗生根培养：经30~50天，丛生芽长至2~3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4~6片叶的试管苗；所述培养基的pH值为5.1，温度为23~27°C，光照强度3500~4200lx，光照时间为12小时/天。

（3）离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4~5片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存；所述培养基的pH值为5.1，温度为15-18°C，光照强度1200~1600lx，光照时间为8小时/天。

前述铁皮石斛的离体保存方法中，步骤（1）中所述的接种培养基为：MS+6-BA1.2mg/l+NAA0.1 mg/l，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。

前述铁皮石斛的离体保存方法中，步骤（2）中所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 1.0mg/l +AC1.0%，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。

前述铁皮石斛的离体保存方法中，所述的保存培养基为1/2MS+CCC 0.9mg/l +AC 0.45%，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。

本发明的有益效果：

利用本发明的方法可以使种质资源得到长期的保存，并且得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量铁皮石斛的优质种苗，有效解决了铁皮石斛属种质资源保存及规模化育苗问题。

本发明通过摸索一系列合理的培养基配方和培养条件，实现了使铁皮石斛有效繁殖的目的，另外，对其保存培养进行了一系列的研究，通过筛选合适的保存培养基达到本发明的目的，实现了铁皮石斛的离体保存。使铁皮石斛的规模化工业生产成为可能，具有广泛的应用前景。

本发明在现有技术的基础上进一步改进，其保存时间得以延长，保存效果得以提高。

利用本发明的方法保存的铁皮石斛的恢复率较高，试管苗恢复情况良好。

附图说明

图1表示本发明光强对铁皮石斛离体保存的影响。

其中，横坐标表示光照强度（lx），纵坐标表示保存天数（d）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一种铁皮石斛属离体保存方法，通过以下方法实现：

一、铁皮石斛经快速繁殖得培养物：

1、供试材料

采自于浙江天台的铁皮石斛的茎尖。

2、外植体的消毒处理

将选择的茎尖，在70%乙醇中浸泡10~30s，无菌水冲洗2~3次，投入添加2%吐温-20的0.1%升汞4min，最后用无菌水冲洗2~3次。

3、外植体诱导

将采集到的铁皮石斛茎尖灭菌后切割为0.5~1.0cm长的小段，接种在MS+6-BA1.2mg/l+NAA0.1 mg/l培养基上，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。培养10~14天，顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述培养基的pH值为5.1，培养温度为24~28°C，光照强度1600~2000lx，光照时间为12小时/天。

4、丛生芽壮苗生根

上述丛生芽经30~50天长至2~3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4~6片叶的试管苗；所述培养基的pH值为5.1，温度为23~27°C，光照强度3500~4200lx，光照时间为12小时/天。

5、试管苗移栽

当试管苗至少具有4~5片伸展叶，根系正常，健康，高度为6cm左右时，即可出瓶移栽，先要经室内炼苗，出瓶时不能折伤叶片和根尖，清除根系上的培养基，分株种植，种植基质为苔藓：锯末：树皮=3：2：4，盖上透光率50%的黑色遮阴网以保持较低光强，2天浇水1次以保持湿润。栽后放在大棚内，隐蔽度为70%，棚内温度控制在20℃~28℃，注意保湿。7~15天用1/8MS液，喷施一次，促进幼苗生长。约20天试管苗长出新根，揭开遮阴网，单株移栽入盆。移栽的成活率可达96%。

二、离体保存

选择上述具有4~5片叶铁皮石斛试管苗为试验材料进行离体保存。

下面对其进行培养基类型、温度、光强、生长抑制剂的筛选，保存天数均以试管苗存活率为80%进行统计。

1、培养基对铁皮石斛离体保存的影响

将试验材料接种到试验设计MS、1/2MS、1/4MS三种培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有25g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.1，培养温度20±1℃，光强1600lx，光照8h/d；结果表明铁皮石斛在1/2MS培养基上保存时间最长，具体结果见表1。

表1 培养基对铁皮石斛离体保存时间的影响

培养基	保存时间（d）
		MS	420
1/2MS	482
		1/4MS	320

2、温度对铁皮石斛离体保存的影响

将接入1/2MS培养基上的铁皮石斛分别放置于温度12℃，15℃，18 ℃、21℃的光照培养箱培养，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有25g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.1，光强1600lx，光照8h/d，结果表明铁皮石斛在温度为15-18℃的培养箱中保存时间较长；具体见表3。

表2 温度对铁皮石斛离体保存时间的影响

温度（℃）	保存时间（d）
		12	432
15	468
		18	471
21	421

3、光强对铁皮石斛离体保存的影响

将试验材料接种到1/2MS培养基上，设计0、1000lx，1200lx、1400lx、1600lx、1800 lx六种光照强度，每种光强接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有25g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.1，培养温度20±1℃，光照8h/d；结果表明，铁皮石斛在光强为1400lx左右保存天数最长，具体比较结果见图1。

4、生长抑制剂对铁皮石斛离体保存的影响

将试验材料接种到添加不同浓度矮壮素（CCC）、多效唑（PPP₃₃₃）的1/2MS培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有25g/L的蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.1，培养温度20±1℃，光照8h/d；结果如表3，CCC浓度为0.9mg/l时保存时间最长。

表3 激素对铁皮石斛保存时间的影响

激素	浓度（mg/L）	保存时间（d）
			CCC	0.8	467
CCC	0.9	475
			CCC	1.0	465
PP333	0.8	345
			PP333	0.9	341
PP333	1.0	351

通过上述实验，确定铁皮石斛最佳离体保存培养基为1/2MS+CCC 0.9mg/l +AC 0.45%，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。所述培养基的pH值为5.1，温度为15-18°C，光照强度1200~1600lx，光照时间为8小时/天。

5、生长状况考察

离体保存的铁皮石斛试管苗的生长恢复情况考察：将生长健壮的铁皮石斛试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存450d后，存活的试管苗接种到MS+6-BA1.2mg/l+NAA0.1 mg/l培养基上，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。每30d继代1次，继代3次后，以株高、生长率、繁殖倍数、单株生根率为指标考察铁皮石斛试管苗的恢复情况，见表4。从对比中可以看出，经过450d离体保存后的试管苗恢复情况良好。

表4 离体保存后恢复的试管苗和保存前试管苗的比较

材料	平均生长率/%	繁殖系数/倍	生根率/%	株高/cm
					正常	6.25±0.14	7.12±0.40	98.5±0.35	6.43±0.11
保存	6.12±0.25	5.61±0.31	97.2±0.27	6.05±0.23

Claims

1.一种铁皮石斛的离体保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）外植体诱导培养：取野外采集的铁皮石斛的茎尖作为外植体，在70%乙醇中浸泡10~30s，无菌水冲洗2~3次，投入添加2%吐温-20的0.1%升汞4min，最后用无菌水冲洗2~3次后切割为0.5~1.0cm长接种在接种培养基上，培养10~14天，顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述培养基的pH值为5.1，培养温度为24~28°C，光照强度1600~2000lx，光照时间为12小时/天；

（2）壮苗生根培养：经30~50天，丛生芽长至2~3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4~6片叶的试管苗；所述培养基的pH值为5.1，温度为23~27°C，光照强度3500~4200lx，光照时间为12小时/天；

2.如权利要求1所述的铁皮石斛的离体保存方法，其特征在于，步骤（1）中所述的接种培养基为：MS+6-BA1.2mg/l+NAA0.1 mg/l，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。

3.如权利要求1所述的铁皮石斛的离体保存方法，其特征在于，步骤（2）中所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 1.0mg/l +AC1.0%，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。

4.如权利要求1所述的铁皮石斛的离体保存方法，其特征在于，所述的保存培养基为1/2MS+CCC 0.9mg/l +AC 0.45%，培养基中添加2.5%的蔗糖和0.4%的琼脂。