CN105265319A - 一种地枫皮的离体保存方法 - Google Patents
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Abstract
一种地枫皮的离体保存方法，包括如下步骤：(1)选取地枫皮无菌苗，(2)将地枫皮无菌苗接种到MS、1/2MS、B5、WPM四种培养基上，考察无机盐水平对地枫皮试管苗离体保存的影响；(3)将地枫皮无菌苗接种到添加矮壮素CCC、多效唑PP333、脱落酸ABA的培养基上，考察各生长抑制剂对地枫皮无菌苗离体保存的影响；(4)将地枫皮无菌苗接种到以琼脂、蔗糖、山梨醇的3个水平设计正交试验培养基上，考察各渗透压对地枫皮无菌苗离体保存的影响；(5)将生长健壮的地枫皮无菌苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后存活的地枫皮无菌苗接种到花宝1号+IAA0.2mg/L繁殖培养基上恢复生长，对第3次继代培养的材料进行芽增殖倍数考察。同时是将第3次培养所得的丛生芽单切接入生根培养基1/2MS+IAA1.0mg/L中进行生根状况调查。本发明找到了能够长时间保存地枫皮试管苗的培养基和控制技术条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物离体保存方法，特别是一种地枫皮离体保存方法。
背景技术
地枫皮(IlliciumdifengpiB.NChangetal.)为木兰科八角茴香属植物，其干燥树皮供药用，具有祛风除湿，行气止痛等功效，临床常用于风湿关节痛、腰肌劳损和跌打损伤等症状治疗，疗效好，药用价值高，是多种中成药产品的主要原材料。经调查发现，地枫皮多生于石灰岩地区的山顶或石山疏林下，其生境分布区域非常狭窄，野生资源蕴藏量稀少，而且由于长期以来不合理的农业生产方式和盲目的资源开发利用，导致岩溶地区土地生产力持续下降、石漠化面积不断扩增，地枫皮的生存环境受到的破坏越来越大，野生地枫皮的生产能力越来越弱，地枫皮于1992年已属于国家Ⅲ级重点保护珍稀濒危植物，1999年又被批准为国家Ⅱ级重点保护野生植物，而目前地枫皮已被列入《中国植物红皮书》渐危种。
发明内容
本发明的目的是提供一种地枫皮离体保存方法，它能够保存地枫皮种质资源。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种地枫皮的离体保存方法，包括以下步骤：
(1)选取地枫皮试管苗在繁殖培养基上培养30d获得的丛生芽作为试验材料；
(2)将步骤(1)获得的丛生芽分别接种到MS、1/2MS、B5、WPM四种培养基上，以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标，接种10瓶，每瓶5株单芽，四种培养基中分别添加30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d；
(3)将步骤(1)获得的丛生芽接种到添加不同浓度矮壮素CCC、脱落酸ABA、多效唑PP333的培养基上，以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标，接种10瓶，每瓶5株单芽，矮壮素CCC、脱落酸ABA、多效唑PP333培养基中分别添加30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d；
(4)将步骤(1)获得的丛生芽接种到以琼脂、蔗糖、山梨醇3个水平设计正交试验培养基上，以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标，接种10瓶，每瓶5株单芽，培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d；
(5)将生长健壮的地枫皮试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后存活的地枫皮试管苗接种到花宝1号+IAA0.2mg/L培养基上，30d后进行增殖倍数及生根状况调查。
所述最佳保存培养基：WPM保存培养基中添加0-2.0mg·L-1矮壮素CCC、0-2.0mg·L-1脱落酸ABA、0-2.0mg·L-1多效唑PP333、4.0-6.0g/L琼脂、30-70g/L蔗糖、0-10g/L甘露醇，在常温下，能够保存地枫皮试管苗300d以上。
本发明的突出优点在于：
(1)进行地枫皮离体保存是实现地枫皮资源保存和可持续利用的有效途径；
(2)采用本发明所述的离体保存方法获得的地枫皮无菌苗经在外观形态、生长发育均与未经过离体保存处理材料无明显差异；表明该保存方法适合地枫皮的种质资源保存长期保存。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
本发明所述的地枫皮的离体保存方法，包括以下步骤：
(1)选取地枫皮试管苗在繁殖培养基上培养30d获得的丛生芽作为试验材料。
(2)无机盐水平对地枫皮试管苗离体保存的影响：将步骤(1)获得的丛生芽接种到MS、1/2MS、B5、WPM四种无机盐浓度水平的培养基上，考察各无机盐浓度对试验材料生长状况的影响，以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标。接种10瓶，每瓶5株单芽。培养基中30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d。由表1可知，WPM为最佳离体保存培养基。
表1培养基对地枫皮离体保存时间的影响
(3)植物生长抑制剂对地枫皮试管苗离体保存的影响：将步骤(1)获得的丛生芽接种到添加不同浓度的矮壮素CCC、脱落酸ABA、多效唑PP333的培养基上，以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标。接种10瓶，每瓶5株单芽。培养基中30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d。由表2、表3可知，矮壮素CCC和多效唑PP333对地枫皮试管苗离体保存影响显著，而脱落酸ABA影响不显著，因此选用矮壮素CCC1.0mg·L-1+PP3331.0mg·L-1加入培养基中对地枫皮试管苗进行离体保存，重复试验发现在该培养基上保存时间最久，为293d。
表2地枫皮种质保存培养生长抑制剂筛选正交实验L9(34)
Note:F1-0.01(2,2)＝99.0F1-0.05(2,2)＝19.0F1-0.1(2,2)＝9.0
(4)渗透压对地枫皮试管苗离体保存的影响：将步骤(1)获得的丛生芽接种到以琼脂、蔗糖、山梨醇3个水平设计正交试验培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽。以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标。培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d。由表5可知在培养基中添加琼脂5.0g/L+蔗糖40g/L+甘露醇3g/L保存效果最好。
表5地枫皮种质保存培养基筛选渗透压正交实验L9(34)
(5)离体保存的地枫皮试管苗的生长恢复情况考察：将生长健壮的地枫皮试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后存活的地枫皮无菌苗接种到花宝1号+IAA0.2mg/L繁殖培养基上恢复生长，对第3次继代培养的材料进行芽增殖倍数考察。同时是将第3次培养所得的丛生芽单切接入生根培养基1/2MS+IAA1.0mg/L中进行生根状况调查。保存材料经培养后，芽增殖倍数比正常水平略低，但无明显差异，生长旺盛，颜色浓绿，生根率则变化不大，根数、根长与正常相近，根系也同样发达，生长没有因长期保存而受到不良影响。
表3离体保存后恢复的试管苗和保存前试管苗的比较
Claims (2)
1.一种地枫皮的离体保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)选取地枫皮试管苗在繁殖培养基上培养30d获得的丛生芽作为试验材料；
(2)将步骤(1)获得的丛生芽分别接种到MS、1/2MS、B5、WPM四种培养基上，以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标，接种10瓶，每瓶5株单芽，四种培养基中分别添加30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d；
(3)将步骤(1)获得的丛生芽接种到添加不同浓度矮壮素CCC、脱落酸ABA、多效唑PP333的培养基上，以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标，接种10瓶，每瓶5株单芽，矮壮素CCC、脱落酸ABA、多效唑PP333培养基中分别添加30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂，培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d；
(4)将步骤(1)获得的丛生芽接种到以琼脂、蔗糖、山梨醇3个水平设计正交试验培养基上，以实验材料存活率不低于50％的保存时间作为种质保存的评价指标，接种10瓶，每瓶5株单芽，培养基的pH值为6.0，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12-14h/d；
(5)将生长健壮的地枫皮无菌苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后存活的地枫皮无菌苗接种到花宝1号+IAA0.2mg/L繁殖培养基上恢复生长，对第3次继代培养的材料进行芽增殖倍数考察，同时是将第3次培养所得的丛生芽单切接入生根培养基1/2MS+IAA1.0mg/L中进行生根状况调查。
2.根据权利要求1所述的地枫皮的离体保存方法，其特征在于，所述最佳保存培养基保存300d后存活的地枫皮试管苗是在常温下，WPM保存培养基中添加0-2.0mg·L-1矮壮素CCC、0-2.0mg·L-1脱落酸ABA、0-2.0mg·L-1多效唑PP333、4.0-6.0g/L琼脂、30-70g/L蔗糖、0-10g/L甘露醇，能够长时间保存地枫皮试管苗。
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