CN103734014B - 一种地枫皮的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种地枫皮的组织培养快速繁殖方法,包括如下步骤:(1)取地枫皮种子作为外植体进行消毒;(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导发芽得到无菌试管苗;(3)将所述无菌试管苗置于MS繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽;(4)将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株;(5)将所述健壮植株置于MS生根培养基中培养得到完整的带根苗;(6)取完整的带根苗进行炼苗后移植于沙床生长一个月,再移栽至大田。采用本发明所述的培养方法得到的地枫皮丛生芽增殖系数达到8-12倍,获得的组培苗生根率在85%以上,移栽苗床成活率在90%以上,有效解决了地枫皮的规模化育苗问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物繁殖方法,特别是一种地枫皮的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
地枫皮(IlliciumdifengpiB.NChangetal.)为木兰科八角茴香属植物,其干燥树皮供药用,具有祛风除湿,行气止痛等功效,临床常用于风湿关节痛、腰肌劳损和跌打损伤等症状治疗,疗效好,药用价值高,是多种中成药产品的主要原材料。经调查发现,地枫皮多生于石灰岩地区的山顶或石山疏林下,其生境分布区域非常狭窄,野生资源蕴藏量稀少,而且由于长期以来不合理的农业生产方式和盲目的资源开发利用,导致岩溶地区土地生产力持续下降、石漠化面积不断扩增,地枫皮的生存环境受到的破坏越来越大,野生地枫皮的生产能力越来越弱,地枫皮于1992年已属于国家Ⅲ级重点保护珍稀濒危植物,1999年又被批准为国家Ⅱ级重点保护野生植物,而目前地枫皮已被列入《中国植物红皮书》渐危种。
在自然条件下,地枫皮主要以种子进行繁殖,但是因其种皮较薄,干燥时种子的油脂会变质,过湿时又容易腐烂,极易丧失发芽力,而其生长环境岩石多,土壤稀薄,无法为地枫皮种子的正常繁殖提供理想的生长环境,致使在自然环境中地枫皮的繁殖能力非常低弱,资源更新速度非常缓慢,难以满足市场需要。虽然也有科研工作者对地枫皮的扦插繁殖技术进行一定程度的研究,但效果不是十分明显,无法满足人工栽培的需要。而采用生物技术组织培养技术,可以有效快速地提高地枫皮种苗的繁殖速度和质量,实现地枫皮优质种苗的工厂化育苗,以满足生产上的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种地枫皮的组织培养快速繁殖方法,它能够快速繁殖出大量适合移栽的优良地枫皮种苗、满足生产需要。
本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种地枫皮的组织培养快速繁殖方法,包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取地枫皮种子作为外植体,依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次,最后用消毒滤纸除去表面水分,得到外植体,其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水;
(2)种子萌发获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天,种子发芽后获得无菌试管苗,其中MS培养基中含0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽,其中MS繁殖培养基中含0.5-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-1.5mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到健壮植株,其中MS壮苗培养基中含1.0-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.5mg/L的萘乙酸NAA、0.1-0.5mg/L的生根粉ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(6)炼苗与移栽:步骤(5)获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内打开瓶盖,在瓶中加入少量自来水,炼苗2-4天,洗净根部培养基,立即移栽到沙床中,在沙床中生长一个月后移栽大田。
本发明的突出优点在于:
(1)采用生物技术对地枫皮进行组织培养快速繁殖,通过地枫皮丛生芽的繁殖,在短时间内可培育出大量适合栽培种植的地枫皮幼苗,显著提高了地枫皮种苗的增殖系数和种苗质量,实现规模化生产,满足生产上的需要。
(2)在MS繁殖培养基中添加的6-苄基腺嘌呤6-BA、吲哚乙酸IAA和激动素KT属于化学合成物质,价格较为便宜,可大大降低地枫皮组织培养的成本消耗,达到降低成本的目的;
在MS繁殖培养基中添加0.5-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA和0.1-1.5mg/L的激动素KT可促进丛生芽的分化;添加浓度为0.1-0.5mg/L的生长激素吲哚乙酸IAA可促进丛生芽的生长;
在MS壮苗培养基中添加浓度为1.0-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA和0.2-1.0的吲哚乙酸IAA可促进丛生芽的再次增殖及长高展叶;
在MS生根培养基上组合使用浓度为0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.5mg/L的萘乙酸NAA、0.1-0.5mg/L的生根粉ABT可获得带根的完整植株,这些植株经炼苗后可直接移栽沙床。
(3)采用本发明所述的培养方法得到的地枫皮丛生芽增殖系数达到8-12倍,丛生芽经过复壮后,接种到含有生根粉IAA、ABT的生根培养基上,获得的组培苗生根率在85%以上,移栽苗床成活率在90%以上;快速、便捷、高效地进行地枫皮组织培养,实现地枫皮组培种苗的规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
本发明所述的地枫皮的组织培养快速繁殖方法的一个实例,包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取地枫皮种子作为外植体,依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次,最后用消毒滤纸除去表面水分,得到外植体,其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水;
(2)种子萌发获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天,种子发芽后获得无菌试管苗,其中MS培养基中含0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽,其中MS繁殖培养基中含0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、1.5mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,丛生芽增殖系数为8.8;
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到健壮植株,其中MS壮苗培养基中含1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.5mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,丛生芽再次增殖的系数为3.5;
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含0.1mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的生根粉ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,生根率为85.6%;
(6)炼苗与移栽:步骤(5)获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内打开瓶盖,在瓶中加入少量自来水,炼苗2-4天,洗净根部培养基,立即移栽到沙床中,在沙床中生长一个月后移栽大田。
实施例2
本发明所述的地枫皮的组织培养快速繁殖方法的另一个实例,包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取地枫皮种子作为外植体,依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次,最后用消毒滤纸除去表面水分,得到外植体,其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水;
(2)种子萌发获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天,种子发芽后获得无菌试管苗,其中MS培养基中含0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽,其中MS繁殖培养基中含3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,丛生芽增殖系数为10.6;
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到健壮植株,其中MS壮苗培养基中含3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,丛生芽再次增殖的系数为4.8;
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.1mg/L的生根粉ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,生根率为89.2%;
(6)炼苗与移栽:步骤(5)获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内打开瓶盖,在瓶中加入少量自来水,炼苗2-4天,洗净根部培养基,立即移栽到沙床中,在沙床中生长一个月后移栽大田。
实施例3
本发明所述的地枫皮的组织培养快速繁殖方法的再一个实例,包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取地枫皮种子作为外植体,依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次,最后用消毒滤纸除去表面水分,得到外植体,其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水;
(2)种子萌发获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天,种子发芽后获得无菌试管苗,其中MS培养基中含0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽,其中MS繁殖培养基中含2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的吲哚乙酸IAA、0.8mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,丛生芽增殖系数为10.3;
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到健壮植株,其中MS壮苗培养基中含2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.6mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,丛生芽再次增殖的系数为4.2;
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含0.6mg/L的吲哚乙酸IAA、0.3mg/L的萘乙酸NAA、0.3mg/L的生根粉ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,生根率为92.6%;
(6)炼苗与移栽:步骤(5)获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内打开瓶盖,在瓶中加入少量自来水,炼苗2-4天,洗净根部培养基,立即移栽到沙床中,在沙床中生长一个月后移栽大田。
实施例4
本发明所述的地枫皮的组织培养快速繁殖方法的又一个实例,包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取地枫皮种子作为外植体,依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次,最后用消毒滤纸除去表面水分,得到外植体,其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水;
(2)种子萌发获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天,种子发芽后获得无菌试管苗,其中MS培养基中含0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽,其中MS繁殖培养基中含,2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,丛生芽增殖系数为11.5;
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到健壮植株,其中MS壮苗培养基中含1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.8mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,丛生芽再次增殖的系数为4.0;
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含0.8mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.2mg/L的生根粉ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8,生根率为93.3%;
(6)炼苗与移栽:步骤(5)获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内打开瓶盖,在瓶中加入少量自来水,炼苗2-4天,洗净根部培养基,立即移栽到沙床中,在沙床中生长一个月后移栽大田。
Claims (1)
1.一种地枫皮的组织培养快速繁殖方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
(1)外植体的选择与消毒:取地枫皮种子作为外植体,依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次,最后用消毒滤纸除去表面水分,得到外植体,其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水;
(2)种子萌发获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体接种到MS培养基中,在培养温度为23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天,种子发芽后获得无菌试管苗,其中MS培养基中含0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到试管苗丛生芽,其中MS繁殖培养基中含0.5-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-1.5mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到健壮植株,其中MS壮苗培养基中含1.0-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(5)健壮植株生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于MS生根培养基中,在培养温度23-27℃,光照强度1500lux,光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带根的完整植株,其中MS生根培养基中含0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.5mg/L的萘乙酸NAA、0.1-0.5mg/L的生根粉ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂,培养基的pH值为5.8;
(6)炼苗与移栽:步骤(5)获得带根的完整植株后,在室温为25℃的室内打开瓶盖,在瓶中加入适量自来水,炼苗2-4天,洗净根部培养基,立即移栽到沙床中,在沙床中生长一个月后移栽大田。
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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Symbiotic Fungal Flora in Leaf Galls Induced by Illiciomyia yukawai (Diptera: Cecidomyiidae) and in Its Mycangia;Shun kobune,et al.;《Microb Ecol》;20111021;第63卷;第619-627页 * |
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