CN115250923A

CN115250923A - 一种八角茴香的组培快繁方法

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Publication number: CN115250923A
Application number: CN202211172209.7A
Authority: CN
Inventors: 杨绍兵; 徐兴才; 梁明泰; 刘家迅; 陈霞; 桂敏; 高正清; 李玉琼; 李石开; 于菲; 胡华冉; 吴丽艳
Original assignee: Institute of Medicinal Plants Yunnan Academy of Agricultural Sciences; HORTICULTURAL RESEARCH INSTITUTE YUNNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: Institute of Medicinal Plants Yunnan Academy of Agricultural Sciences; HORTICULTURAL RESEARCH INSTITUTE YUNNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2042-09-26
Also published as: CN115250923B

Abstract

本发明涉及一种八角茴香的组培快繁方法，所述八角茴香的组培快繁方法包括以下步骤：步骤1）选取八角茴香的幼嫩具芽茎段为外植体；步骤2）消毒后接种至初代丛生芽诱导培养基中诱导出丛生芽，步骤3）后转接至丛生芽继代增殖培养基中获得更多的丛生芽，步骤4）丛生芽最后接种于丛生芽生根培养基中形成生根苗。本发明的方法步骤消毒效率高，生产成本低，且培育出的八角茴香药材价值显著，且遗传稳定性高。

Description

一种八角茴香的组培快繁方法

技术领域

本发明属于中药材及组织培养领域，特别涉及八角茴香的组培育苗方法。

背景技术

八角茴香（Illicium verum Hook.f．）为木兰科八角属多年生常绿乔木，以干燥果实入药，亦是著名的香料植物。

八角茴香自然条件下一般采用种子繁殖，但种子繁殖存在较大的变异，在优良品种选育时其母本的优良性状不能稳定遗传，因此在八角茴香优良品种扩繁时，大多采用无性繁殖，目前的无性繁殖技术主要有分株繁殖、扦插繁殖和嫁接等，但其主要缺点是短期内不能获得大量种苗，且极易导致病虫害积累。

近年来，随着组培技术的应用，部分科研院所及企业开展了八角的组培技术研究。郑茂林在（《八角组织培养试验初报》[J]，四川林业科技，2008，29（6）：85~87）中详细报道了八角茴香的组培技术的初代培养研究，其存在消毒污染率高，褐化率高，初代诱导率低等缺点，同时在继代增殖以及生根培养方面无进一步报道。陈金水在名称：《一种八角茴香离体组培快繁方法》（专利公布号CN107509635A）中对八角茴香的初代培养、继代增殖以及生根培养等整个组培环节进行了比较详细的研究报道，其主要有以下弊端：1、组培技术在八角茴香中的应用主要是在于优良品种的迅速扩繁，而种子作为外植体，其存在遗传不稳定性；2、其组培过程是通过诱导愈伤，愈伤进行再分化后生根，最终获得完整植株，而愈伤为细胞团，在组培领域中，愈伤亦有一定几率产生变异，特别是在增殖代数较多时变异概率倍数增加；3、经过愈伤诱导、愈伤增殖、愈伤再分化、分化苗生根，其生产工艺相对较为繁琐；4、本发明团队在采用本发明技术中的继代增殖苗，使用《一种八角茴香离体组培快繁方法》中的生根技术时，生根率较低，苗较为纤弱。

另外，申请人在名称：一种滇鸡血藤的组培育苗方法（专利公布号CN114680045A）中对滇鸡血藤的组培育苗进行了研究报道，该方法包含有外植体的消毒方法、初代丛生芽诱导培养方法等内容。但八角茴香为木兰科八角属多年生木本乔木，而对比文件中的滇鸡血藤为木兰科南五味子属多年生木质藤本，两种植物不仅不是同一物种，更不是同一属的植物。更为具体的区别在于：1）关于消毒方法：使用滇鸡血藤的组培育苗方法中的消毒步骤不能实现本发明的消毒效果，且其还采用了0.1%的升汞溶液消毒3~4min。会导致八角茴香外植体几乎全部被杀死。2）关于褐化：滇鸡血藤中的化合物与八角茴香中的化合物种类也几乎不同；其中的高浓度PVP虽能一定程度抑制八角茴香的褐化，但会造成八角茴香中毒；3）关于植物生长调节剂：滇鸡血藤的组培育苗方法中采用了一定浓度的NAA和6-BA为丛生芽诱导培养基，一定浓度的NAA、IAA与TDZ 、BR组合的丛生芽继代增殖培养基，不论是植物生长调节剂种类、浓度还是植物生长调节剂上的搭配使用及比例，均没有参考性，同时其诱导率、增殖系数亦均远达不到试验要求；4）关于基本培养基：滇鸡血藤的组培育苗方法中所采用的Ca并不能实现本发明的生根率。综上，该文献技术方案针对本发明所研究的八角茴香，两者并没有相关性，更没有可参考性。

发明内容

针对八角茴香现有技术的不足，提供一种生产工艺科学合理、遗传性状稳定、生产成本低廉的八角茴香组织培养技术，即本发明所述一种八角茴香的组培快繁方法。

本发明是通过以下技术方案实现。

一种八角茴香的组培快繁方法，本发明所述八角茴香的组培快繁方法包括以下步骤：

步骤1）选取八角茴香的幼嫩具芽茎段为外植体；

步骤2）消毒后接种至初代丛生芽诱导培养基中诱导出丛生芽；

步骤3）后转接至丛生芽继代增殖培养基中获得更多的丛生芽；

步骤4）丛生芽最后接种于丛生芽生根培养基中形成生根苗。

本发明幼嫩具芽茎段为春季或夏季未木质化具芽枝条。

本发明所述消毒的方法步骤依次为75%酒精20~25s，饱和漂白粉溶液20~25min，0.05%升汞溶液6~7min。

进一步为，本发明初代丛生芽诱导培养基为改良WPM+NAA 0.02~0.05mg/L+CPPU0.5~0.7mg/L+ZT 1.0~1.2mg/L+硝酸银 0.1~0.2μg/L+活性炭 1.0g/L。

进一步为，本发明丛生芽继代增殖培养基为WPM+IBA 0.05~0.08mg/L+NAA 0.1~0.2mg/L+TDZ 2.0~3.0mg/L+TIBA 0.01~0.02mg/L（三碘苯甲酸）+Vc 120~140mg/L+活性炭0.6g/L。

进一步为，本发明丛生芽生根培养基为改良WPM+NAA 0.3~0.4mg/L+IAA 0.2~0.3mg/L+椰汁80~100ml/L+活性炭0.8g/L。

进一步为，本发明所述改良WPM培养基为，在常规WPM培养基基础上，将以下成分调整为：硝酸铵200mg/L，硫酸钾550mg/L，硝酸钙820mg/L，磷酸二氢钾150mg/L；其余成分不变。

具体为：

1、外植体的选择：在春季或夏季，采用树枝顶端未木质化的幼嫩具腋芽茎段，在夏季采外植体时，应避免采到花芽。

2、外植体的清洁：将采到的外植体，剪成2~3cm具芽小段，用饱和肥皂水溶液，反复涮洗表面至无泥土残留，并用自来水洗净肥皂水，后在烧杯中加适量水并滴加2~3滴吐温-80，震摇10~15min，自来水冲淋60~70min。

3、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精20~25s，无菌水涮洗2~3次，饱和漂白粉溶液20~25min，无菌水涮洗3~4次，0.05%升汞溶液6~7min，无菌水涮洗6~8次。

4、初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于改良WPM+NAA 0.02~0.05mg/L+CPPU 0.5~0.7mg/L+ZT 1.0~1.2mg/L+硝酸银 0.1~0.2μg/L+活性炭 1.0g/L的丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃下暗培养10~15天，后温度不变，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30天。

5、丛生芽的继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，接种于WPM+IBA 0.05~0.08mg/L+NAA 0.1~0.2mg/L+TDZ 2.0~3.0mg/L+TIBA 0.01~0.02mg/L（三碘苯甲酸）+Vc120~140mg/L+活性炭 0.6g/L的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养40~50天。

6、丛生芽的生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种在改良WPM+NAA 0.3~0.4mg/L+IAA 0.2~0.3mg/L+椰汁80~100ml/L+活性炭0.8g/L的丛生芽生根培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30~40天。

7、步骤4及步骤6所述的改良WPM培养基为，在常规WPM培养基基础上，硝酸铵改为200mg/L，硫酸钾550mg/L，硝酸钙820mg/L，磷酸二氢钾改为150mg/L，其余成分不变。

本发明的有益效果在于：

1、八角茴香以挥发油以及反式茴香脑含量为主要质量指标，是其药材价值的重要体现，而挥发油的种类组成、各种类含量、香气是其香料品种的评价指标。在优良品种筛选时，根据市场应用选育相应的优良种源，而本发明是利用现代生物技术进行的无性繁殖，能最大程度的保证母本的优良性状的稳定遗传的同时，可短期内大量获得优质的种苗。

2、一般而言，75%酒精与0.1%升汞溶液组合是组培领域外植体消毒的最佳消毒方法，但八角茴香在采用0.1%升汞溶液消毒时，时间短，不能达到消毒目的，而消毒时间延长，消毒污染率虽然有所下降，但会造成外植体大量死亡，同时引起外植体严重褐化，几乎不能诱导出丛生芽。本发明在消毒时采用了75%酒精、饱和漂白粉溶液、0.05%升汞溶液、0.1%升汞溶液进行前期的消毒，可将外植体中的微生物量大部分消杀，同时再配合低浓度的升汞溶液，可基本将外植体携带的微生物基本杀灭，使污染率降低到最低，基本不会引起外植体的死亡，同时还能降低了外植体的褐化率。

3、八角茴香外植体较难诱导丛生芽，一方面由于初代诱导过程中的褐化抑制了丛生芽的生长，另一方面八角茴香在初代诱导时对6-BA、KT等常规的细胞分裂素极不敏感。本发明采用低浓度的NAA与超高活性的CPPU和ZT组合，能有效诱导丛生芽的发生，而采用改良WPM为基本培养基，同时添加适量浓度的硝酸银以及活性炭，可有效抑制外植体褐化的发生但又不影响丛生芽的生长。

4、在继代增殖培养时，褐化率以及褐化程度较初代诱导有很大程度的降低，但褐化仍普遍发生且影响丛生芽的生长，而硝酸银虽能较好的抑制褐化的发生，但长期使用，易造成其在体内的积累，最终影响生长，本发明在继代增殖培养时，不添加硝酸银，而改为适宜浓度的Vc，同时降低活性炭浓度，能有效将褐化降低到不影响丛生芽生长的状态。

5、本发明在继代增殖时，采用生长素IBA、NAA与细胞分裂素TDZ以及TIBA，可使增殖系数提高到5.5以上，优于现有报道中的4.6。

6、本发明在生根培养时，采用改良WPM为基本培养基，进行NAA和IAA适宜浓度的组合，还添加了一定浓度的椰汁，能将生根率提高至97%，亦可使苗更加健壮，叶片亮绿，最终更加利于驯化的成活以及驯化生长势的提高。

以下结合具体实施方式对本发明做进一步解释。

具体实施方式

步骤1）选取八角茴香的幼嫩具芽茎段为外植体；

步骤4）丛生芽最后接种于丛生芽生根培养基中形成生根苗。

本发明幼嫩具芽茎段为春季或夏季未木质化具芽枝条。

实施例

实施例1

2、外植体的清洁：将采到的外植体，剪成2~3cm具芽小段，用饱和肥皂水溶液，反复涮洗表面至无泥土残留，并用自来水洗净肥皂水，后在烧杯中加适量水并滴加2~3滴吐温-80，震摇10min，自来水冲淋60min。

3、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精20s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液20min，无菌水涮洗3次，0.05%升汞溶液6min，无菌水涮洗6次，7天污染率为18.8%，消毒死亡率为7.3%。

4、初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于改良WPM+NAA 0.02mg/L+CPPU 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L+硝酸银 0.1μg/L+活性炭1.0g/L的丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃下暗培养15天，后温度不变，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30天，诱导率为72.1%，褐化率为34.6%，且褐化不影响丛生芽的诱导。

5、丛生芽的继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，接种于WPM+IBA0.05mg/L+NAA 0.1mg/L+TDZ 2.0mg/L+TIBA 0.01mg/L+Vc 120mg/L+活性炭 0.6g/L的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养40天，丛生芽增殖系数为5.8，褐化率为21.4%，且褐化不影响丛生芽的增殖。

6、丛生芽的生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种在改良WPM+NAA0.3mg/L+IAA 0.2mg/L+椰汁80ml/L+活性炭0.8g/L的丛生芽生根培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养40天,丛生芽生根率为97.4%，且苗健壮，颜色鲜绿。

实施例2

2、外植体的清洁：将采到的外植体，剪成2~3cm具芽小段，用饱和肥皂水溶液，反复涮洗表面至无泥土残留，并用自来水洗净肥皂水，后在烧杯中加适量水并滴加2~3滴吐温-80，震摇15min，自来水冲淋70min。

3、外植体的消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，用75%酒精25s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液25min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液7min，无菌水涮洗8次，7天污染率为14.7%，消毒死亡率为9.6%。

4、初代丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于改良WPM+NAA 0.05mg/L+CPPU 0.7mg/L+ZT 1.2mg/L+硝酸银 0.2μg/L+活性炭1.0g/L的丛生芽诱导培养基中，在温度25±2℃下暗培养15天，后温度不变，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养30天，诱导率为73.2%，褐化率为38.9%，且褐化不影响丛生芽的诱导。

5、丛生芽的继代增殖培养：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，接种于WPM+IBA0.08mg/L+NAA 0.2mg/L+TDZ 3.0mg/L+TIBA 0.02mg/L（三碘苯甲酸）+Vc 140mg/L+活性炭0.6g/L的丛生芽继代增殖培养基中，在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养50天，丛生芽增殖系数为5.7，褐化率为19.0%，且褐化不影响丛生芽的增殖。

6、丛生芽的生根培养：将继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种在改良WPM+NAA0.4mg/L+IAA 0.3mg/L+椰汁100ml/L+活性炭0.8g/L的丛生芽生根培养基中，在温度25±2℃下，每日照光12h，光强2000~3000lx的光暗交替下培养40天，丛生芽生根率为98.1%，且苗健壮，颜色鲜绿。

部分试验数据

试验一：消毒方法对污染率、消毒死亡率、褐化等的影响

选择以改良WPM+NAA 0.02mg/L+CPPU 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L+硝酸银 0.1μg/L+活性炭 1.0g/L，进行以下方法的消毒试验，并统计相关数据。

表1：消毒方法

本实验采用75%酒精、0.05%升汞、0.1%升汞和饱和漂白粉溶液4种消毒方式，设计15种消毒组合方法。

表2：消毒统计数据

通过对7天污染率、消毒死亡率和褐化率统计，结果表明：消毒方法X13效果较良好，7天污染18.9%，消毒死亡率为8.7%，褐化率为37.6%，褐化不影响诱导。

试验二：抗褐化剂对褐化以及丛生芽诱导的影响

采用75%酒精20s，饱和漂白粉溶液20min，0.05%升汞溶液6min的消毒方法，诱导培养基选择改良WPM+NAA 0.02mg/L+CPPU 0.5mg/L+ZT 1.0mg/L，并在培养基中添加以下抗褐化剂，统计相关数据。

表3：抗褐化剂添加处理

采用添加活性炭、Vc、硝酸银和PVPP 4种抗褐化剂，设计12种抗褐化剂添加方法。

表4：抗褐化剂单独添加效果

抗褐化剂添加效果结果表明：单独添加硝酸银0.1μg/L褐化率为41.2%，褐化不影响丛生芽的诱导。

试验三：细胞分裂素对诱导的影响

采用75%酒精20s，饱和漂白粉溶液20min，0.05%升汞溶液6min的消毒方法，诱导基本培养基选择改良WPM在培养基中添加0.02mg/L的NAA以及硝酸银 0.1μg/L与活性炭1.0g/L的抗褐化剂，选择不同植物细胞分裂素组合，统计相关数据。

表5：植物生长调节剂诱导组合

本实验采用BA、KT、ZT、CPPU和TDZ 5种植物生长调节剂进行诱导实验，设计15种诱导组合方法。

表6：植物生长调节剂对诱导的影响

注：丛生芽健壮程度用“+”表示，细弱程度用“—”表示

5种植物生长调节剂对诱导的影响结果表明：方法T11（CPPU=1.0mg/L）诱导率77.9%，丛生芽健壮。

WPM：指WPM培养基，是1981年由Lloyd和McCown为山月桂茎尖培养专业设计，根据MS培养基改良而来，相对MS培养基而言，使用了硫酸钾替换了KNO₃，NH₄NO₃的含量也降低到了MS培养基的1/4，氮盐也主要以硝酸钙的形式供应。

NAA：a-萘乙酸

CPPU：膨大素

ZT：玉米素

IBA：吲哚-3-丁酸

TDZ：脱叶灵

TIBA：三碘苯甲酸

Vc：维生素C

IAA：吲哚-3-乙酸

PVPP：交联聚维酮(Polyvinylpolypyrrolidone cross-linked)

BA：丙烯酸丁酯

KT：激动素，6-糠基氨基嘌呤（或N6-呋喃甲基腺嘌呤,分子式C₁₀H₉N₅O）。

结合上述实施例内容，本发明再次针对名称：一种滇鸡血藤的组培育苗方法（专利公布号CN114680045A）更为详细地阐述本发明的内涵所在。

1、关于消毒方法

在植物组培技术领域，不同植物对不同种类、浓度的耐受力不同，而75%酒精以及0.1%升汞溶液是植物组培领域最常使用的消毒剂种类及浓度组合，其中75%酒精有一定的消毒效果，同时还能增加表面活性张力，能增加后续消毒剂的消毒效果，而0.1%升汞其对病原菌的杀灭能力极强，因此在大部分植物中都能适用，但0.1%升汞对植物的细胞亦具有较强的杀灭作用。一般情况下，适宜时长的消毒可达到既能有效杀灭外植体上的微生物，又能保证植物细胞不被损伤或损伤程度在可接受范围内，即达到消毒目的。

但在八角茴香组培的无菌体系建立过程中，0.1%的升汞溶液，消毒时间过长时，能使外植体上的微生物基本被杀灭，但亦使植物细胞收到极大的损伤，一方面导致外植体死亡，另一方面导致外植体严重褐化，从而不能诱导丛生芽。但当0.1%升汞溶液消毒时间缩短时，虽然可减少对植物细胞的伤害，但不能有效杀灭八角茴香外植体的微生物，造成大量的消毒污染。而在0.1%升汞溶液多少不能多少时长均不能达到消毒目的时，一般会采用与其他消毒剂搭配使用或降低升汞浓度的方法，但本发明成员在采用降低消毒剂浓度时亦存在使用0.1%升汞溶液时的困境，但在与饱和漂白粉溶液搭配时，能有效降低消毒污染率，同时亦有一定程度的外植体存活并能诱导。

同时，对于八角茴香来说，不适的消毒方法，还会导致外植体的褐化，而褐化也会极大的影响了八角茴香外植体的丛生芽诱导。

在组培快繁技术中，对于不同植物，其消毒剂种类、消毒剂消毒浓度以及消毒时间三种综合因素是消毒成功率的基本保障，而消毒成功率是植物能否建立组培快繁体系的前提。

本发明在处理八角茴香外植体时，依次采用了适宜时长的75%酒精20~25s，饱和漂白粉溶液20~25min，0.05%升汞溶液6~7min，既能将消毒污染率控制在20%以内，又能使消毒死亡率控制在10%以内，是最适宜于八角茴香的消毒技术，而当0.05%升汞溶液消毒时间延长时，消毒污染率并不会有显著下降，但消毒死亡率会直线上升，仅凭这一项消毒措施，一种滇鸡血藤的组培育苗方法所包括的技术内容就不能实现本发明的消毒效果，何况在其还采用了0.1%的升汞溶液消毒3~4min。

由此确定，采用一种滇鸡血藤的组培育苗方法所包括的消毒技术时，会导致八角茴香外植体几乎全部被杀死。

2、关于褐化

植物组培褐化是较为常见的现象，其主要为外植体内某种成分在有氧条件下进行反应，产生褐化物质，其引起因素主要有基因本身决定，外植体的生理状态，取材时间和部位，消毒方法，外植体的培养条件以及培养基等，目前防治褐化的主要方法有调整适宜的取材部位和时间，如木本基本采取在春季时，取未木质化的幼嫩部位为外植体；改善培养环境，如低温培养、暗培养等，添加防褐化剂等，其中添加抗褐化剂是最常用方法。

而由于不同植物其引起褐化的机理不同，使得不同植物在抗褐化剂的种类及浓度上存在极大差异，同时，褐化剂选择不宜的种类或浓度的添加，亦可能引起植物的中毒反应，使植物不能良好生长甚至死亡等。

在八角茴香中，八角茴香内含茴香脑、山奈酚、爱草脑、桂皮酸等黄酮、有机酸和挥发油类化合物，极易导致褐化的发生，使得不论何种消毒方法，均能一定程度的引起八角茴香外植体褐化的发生，而八角茴香的褐化亦会对其生长造成极大的影响。与此同时，在初代诱导培养基中添加任何浓度的Vc、柠檬酸等其他褐化抑制剂均不能抑制褐化的发生，而在使用硫代硫酸钠、PVP等其他抗褐化剂时，低浓度时不能有效抑制褐化，而浓度过高时，虽能有效抑制八角茴香的褐化，但会导致八角茴香的生长受到抑制或者完全不能生长甚至死亡。

较高浓度的硝酸银和活性炭能有效抑制八角茴香褐化的发生，但浓度过高时，使得八角茴香的生长受到一定程度的抑制，尤其是硝酸银的使用，八角茴香对其浓度的敏感性极高，而在适宜浓度时，既能有效降低褐化的发生，还能在初代诱导培养时，均能有效的诱导出丛生芽，但对其丛生芽的生长仍有一定的抑制作用。

与此同时，本发明在防治八角茴香褐化时，在初代诱导培养时还采用了暗培养10~15天的方式相结合，是褐化的抑制效果达到最佳。

而一种滇鸡血藤的组培育苗方法中，其物种并八角茴香，其内含的化合物种类也几乎不同，使得其在选择不同种类的褐化剂也有所不同，同时，不同植物对褐化剂的敏感程度不同，其中的高浓度PVP虽能一定程度抑制八角茴香的褐化，但会造成八角茴香中毒，而低浓度又不能达到抑制效果。

3、关于植物生长调节剂

无菌体系的建立是植物组培成功与否的前提，而不论是初代诱导、继代增殖还是生根培养，其植物生长调节剂的种类、浓度以及搭配方式，是植物组培最为关键的因子。而不同的植物对不同种类、浓度的植物生长调节剂敏感性不同，即使同属植物的不同物种，甚至同种植物的不同品种，对植物生长调节剂的敏感度亦不同，如本发明团队成员曾进行了同科同属不同种甚至同种不同品系的组培研究，但其对植物生长调节剂的种类和浓度的敏感性上存在天差地别，更别说不同科属的物种。

本发明在初代丛生芽诱导时，采用了一定浓度的NAA7、CPPU和ZT的组合，其目的是最大程度的诱导出丛生芽，可使诱导率达70%以上。

在继代增殖过程中，一般是在初代诱导培养基的基础上进行适当调整，从而达到最佳的增殖系数，但本发明团队在研究过程中发现，NAA7、CPPU和ZT的组合，不论怎么调整浓度以及搭配比例，其增殖系数均低于3.0，同时亦进行了其他常规植物生长调节剂的组合使用，亦不能较大幅度的提高八角茴香继代增殖过程中的增殖系数，在陷入困境后，偶然间采用了组培中极为不常用的TIBA，发现八角茴香对TIBA极为敏感，浓度稍微偏大时，八角茴香即会导致生长停滞甚至死亡，而低浓度时能有效促进八角茴香芽的分化及生长，当采用适宜浓度NAA和IBA两种生长素与TDZ和TIBA的有效搭配，使得增殖系数得到了大幅的提高，使增殖系数达到了5.0以上，有效的缩短了八角茴香组培生产过程中的生产周期和大幅降低了组培生产成本。

一种滇鸡血藤的组培育苗方法记载的技术方案中，主要采用了一定浓度的NAA和6-BA为丛生芽诱导培养基，一定浓度的NAA、IAA与TDZ 、BR组合的丛生芽继代增殖培养基，不论是植物生长调节剂种类、浓度还是植物生长调节剂上的搭配使用及比例，均没有参考性，同时其诱导率、增殖系数亦均远低于本发明。

4、关于基本培养基

目前组培技术的经典培养基有MS、WPM、B5、N6等，对于大多植物来说，这类基本培养基均能较好的适宜生长，但在八角茴香的基本培养基选择过程中发现，WPM是最为适宜八角茴香的生长的基本培养基，但在多次试验过程中发现，WPM在初代培养时会造成八角茴香的叶脉黄化现象，不利于丛生芽的诱导，而在生根培养时，不仅会造成叶脉黄化，苗不健壮，还会造成生根率低的结果。

本发明在WPM的基础上，进行了硝酸铵、硫酸钾、硝酸钙、磷酸二氢钾的调整，能有效改善叶脉黄化的现象，同时能提高苗的生根率。

本发明与一种滇鸡血藤的组培育苗方法的修改种类有些类似，但调整浓度是根据植物对元素的需求确定的，比如高浓度N和K，均会造成八角茴香的叶脉黄化，只有调整到适宜浓度的N和K的浓度，才能使叶脉不会黄化，而八角茴香生根时对Ca特别敏感，当浓度过低时能有效促进生根，但会导致苗极弱，而当浓度过高时，苗生根率会受到极大压制。本发明对硝酸钙的浓度进行了适当调整，是最适宜八角茴香生根的Ca浓度，而一种滇鸡血藤的组培育苗方法所采用的Ca并不能实现本发明的生根率。

5、关于八角茴香与滇鸡血藤

八角茴香为木兰科八角属多年生木本乔木，而滇鸡血藤为木兰科南五味子属多年生木质藤本，两种植物不仅不是同一物种，更不是同一属的植物。

在植物组织培养技术中，两者并没有相关性，更没有可参考性。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例（由于本发明的配方包含数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围包含本发明的数值范围和其他技术要点范围），方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种八角茴香的组培快繁方法，其特征在于，所述八角茴香的组培快繁方法包括以下步骤：

步骤1）选取八角茴香的幼嫩具芽茎段为外植体；幼嫩具芽茎段为春季或夏季未木质化具芽枝条；

步骤2）消毒后接种至初代丛生芽诱导培养基中诱导出丛生芽；所述消毒的方法步骤依次为75%酒精20~25s，饱和漂白粉溶液20~25min，0.05%升汞溶液6~7min；初代丛生芽诱导培养基为改良WPM+NAA 0.02~0.05mg/L+CPPU 0.5~0.7mg/L+ZT 1.0~1.2mg/L+硝酸银 0.1~0.2μg/L+活性炭 1.0g/L；

步骤4）丛生芽最后接种于丛生芽生根培养基中形成生根苗。

2.根据权利要求1所述的一种八角茴香的组培快繁方法，其特征在于，丛生芽继代增殖培养基为WPM+IBA 0.05~0.08mg/L+NAA 0.1~0.2mg/L+TDZ 2.0~3.0mg/L+TIBA 0.01~0.02mg/L+Vc 120~140mg/L+活性炭 0.6g/L。

3.根据权利要求1所述的一种八角茴香的组培快繁方法，其特征在于，丛生芽生根培养基为改良WPM+NAA 0.3~0.4mg/L+IAA 0.2~0.3mg/L+椰汁80~100ml/L+活性炭0.8g/L。

4.根据权利要求1或3所述的一种八角茴香的组培快繁方法，其特征在于，所述改良WPM培养基为，在常规WPM培养基基础上，将以下成分调整为：硝酸铵200mg/L，硫酸钾550mg/L，硝酸钙820mg/L，磷酸二氢钾150mg/L；其余成分不变。