CN114208677B - 一种食用玫瑰的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种食用玫瑰的组织培养方法，涉及植物组织培养技术领域。本发明食用玫瑰组织培养方法包括外植体消毒、初代培养、继代增殖培养、生根培养和炼苗移栽；本发明通过调整各培养阶段培养基组成，提升食用玫瑰组织培养的启动率、增殖系数和生根率以及移栽成活率，降低污染率与褐化率，提高食用玫瑰的快繁效率。

Description

一种食用玫瑰的组织培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种食用玫瑰的组织培养方法。

背景技术

食用玫瑰营养丰富、用途广泛，具有很高的开发价值和广阔的应用前景，深受人们喜爱，需求量逐年增加，市场前景广阔。其种植及深加工项目己经被江苏、云南等省列入了重点关注和扶持对象。

但食用玫瑰实生苗繁殖存在种子发芽率低、幼苗成活率低，而扦插、嫁接繁殖易造成植株体内病毒积累，生长势减弱，易滋生病虫害，且存在繁殖周期较长，繁殖基数小等问题，使得食用玫瑰工厂化育苗受到限制。采用组织培养手段不仅可提高繁殖速度，还可生产脱毒苗，提高食用玫瑰种苗品质，促进食用玫瑰产业的更快、更好地发展。

本文对食用玫瑰初代培养、继代增殖、生根培养、炼苗与移栽的各阶段主要影响因素进行研究，建立食用玫瑰离体快繁技术体系。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种食用玫瑰的组织培养方法，提升食用玫瑰培养启动率，降低褐化率，提升增殖系数、生根率及组培苗生长性状，提升移栽成活率，形成一种高效、完整的食用玫瑰离体快繁技术体系。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种食用玫瑰的组织培养方法，包括外植体的初代培养、继代增殖培养、生根培养和炼苗移栽，所述初代培养培养基组成为：MS+6-BA 2-3mg/L+NAA 0.2-0.3mg/L+Vc；所述继代增殖培养培养基组成为：MS+6-BA 0.5-2.5mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L；所述生根培养培养基组成为：1/2MS+NAA 0.05-0.2mg/L+活性炭。

优选的是，所述外植体为食用玫瑰带腋芽茎段。

优选的是，所述外植体培养前进行消毒，包括：外植体洗净后75％乙醇浸泡40s，无菌水冲洗2-3遍，4％次氯酸钠浸泡4-10min，无菌水冲洗3-4遍。

优选的是，所述初代培养基Vc添加量为1.0-1.5g/L。

优选的是，所述生根培养基活性炭添加量为1.0-2.5g/L。

优选的是，所述组织培养各阶段培养基的pH＝5.8±0.2。

优选的是，所述组织培养各阶段的培养温度为20±3℃。

优选的是，所述初代培养、生根培养阶段光照强度为2000-2500Lx，继代增殖培养阶段光照强度为2500-3000Lx。

优选的是，所述炼苗包括：室温条件下，组培瓶塞半开放置1-2天，再全部打开放置4-6天，取出移栽。

优选的是，所述移栽的基质为等体积混合的椰糠和珍珠岩。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种食用玫瑰的组织培养方法：

(1)通过75％乙醇浸泡40s和4％次氯酸钠浸泡4-10min进行食用玫瑰外植体的消毒，能够保持较高的启动率和较低的污染率；

(2)通过在初代培养基内添加6-BA 2-3mg/L+NAA 0.2-0.3mg/L作为外源激素，可使玫瑰茎段腋芽启动率达到70％以上，平均芽高达到1.8cm以上；

(3)通过在初代培养基中添加抗褐化物质Vc，能够显著降低褐化率，使外植体长势良好，植株粗壮，生长快，叶绿宽大，无黄叶；

(4)通过在继代增殖培养基内添加6-BA 0.5-2.5mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L作为外源激素，并设置继代增殖光照在2500-3000Lx，可显著提高食用玫瑰组织培养的增殖系数；

(5)通过在生根培养基内添加NAA 0.05-0.2mg/L作为外源激素，并添加活性炭，能够显著提升食用玫瑰组培苗的生根率、根长和根数。

(6)通过以椰糠和珍珠岩作为食用玫瑰组培苗移栽基质，能够显著提升组培苗长势，提升移栽成活率。

本发明提供了一整套食用玫瑰组织培养快繁体系，该技术体系可为食用玫瑰扩大繁殖规模提供理论依据和技术指导。

附图说明

图1：本发明食用玫瑰组织培养流程图；

图2：外植体不同消毒处理对污染率和启动率的影响；

图3：初代培养腋芽萌发状况；

图4：增殖培养不同培养基组培苗情况，从左至右依次为：MS、WPM、B5基本培养基；

图5：生根培养组培苗生根状况。

具体实施方式

本发明提供了一种食用玫瑰的组织培养方法，包括外植体的初代培养、继代增殖培养、生根培养和炼苗移栽。

优良的外植体材料是植物组织培养体系建立的基础。玫瑰是多年生的本植物，极易感染病菌，且由于其木质化结构，导致其内生菌问题突出，加上玫瑰茎段上的绒毛，细刺等结构，严重影响外植体消毒。作为一种可实施方式，本发明外植体来源为：在晴天中午，挑选生长健壮、无病虫害的当年生长枝条，除去小刺和叶柄，放置于流水下冲洗10min，用软毛刷将枝条上的灰尘刷洗干净，注意不要损伤腋芽，然后放入洗涤剂震荡，再放置在流水下冲洗30min。

外植体进行组织培养前，还需要消毒处理，以杀灭携带的病原菌。目前组织培养中最常见的消毒剂有75％的酒精与次氯酸钠，主要研究消毒时间对外植体污染率，启动率的影响，处理时间过长会对外植体造成损伤，影响外植体萌发率以及加重褐化现象的产生，但处理时间过短会导致污染现象的产生。因此在选择最佳消毒处理时，应当综合多方面考虑。本发明优选外植体消毒方式为先用75％乙醇浸泡40s，无菌水冲洗2-3遍，再用4％次氯酸钠浸泡4-10min，无菌水冲洗3-4遍；进一步优选的是，75％乙醇浸泡40s，无菌水冲洗3遍，4％次氯酸钠浸泡10min，无菌水冲洗4遍。考虑到玫瑰茎段绒毛较多，作为一种可实施方式，在次氯酸钠溶液中加入几滴表面活化剂吐温20，增大灭菌剂与外植体的接触面积，可以增加灭菌效果。

玫瑰腋芽的萌发与生长是受细胞分裂素与生长素共同调控的，适宜的激素种类及浓度对玫瑰组织培养至关重要，当细胞分裂素的浓度较高时会加速细胞的分裂从而诱导出较多的不定芽产生，但同时也会增加组培过程中玻璃化现象的出现，且容易出现不定芽细弱，叶片瘦小卷曲，莲座化等现象。本发明在初代培养阶段，选择以带腋芽茎段做外植体，优选初代培养基中6-BA 2.0-3.0mg/L+NAA 0.2-0.3mg/L作为外源激素，进一步优选6-BA3.0mg/L+NAA 0.2mg/L；优选继代增殖培养基中6-BA 0.5-2.5mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L作为外源激素，进一步优选6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L，能够显著提升玫瑰组织培养的启动率、芽高和增殖系数。

褐化现象是由于外植体受自身分泌的酚类化合物的作用出现褐变与褐化从而影响组培苗正常生长的现象。褐化是玫瑰组织培养过程中常见的现象，严重影响着玫瑰组培产业的发展。本发明在初代培养基中添加Vc作为抗褐化物质，优选添加量为1.0-1.5g/L，进一步优选添加量为1.0g/L，能够显著降低玫瑰组织培养的褐化率。作为一种可实施方式，Vc对褐化的抑制作用虽然最佳，但是当Vc的含量过高时，会对植株的生长有一定限制，且Vc性质不稳定，使用时应当注意适量使用并及时转接新培养基。

组织培养中组培苗的生根是组培的难点，也是组培成功与否的关键。其中生根培养基的选择与植物激素的种类与配比对根的发生有着重要影响。MS培养基中无机盐离子浓度过高，抑制了根的形成与生长，本发明以1/2MS作为玫瑰生根培养基的基础培养基，促进玫瑰组培苗根系生长健壮。在不定根的形成过程中，生长素起主要作用，添加适量生长素可加速组培苗根部增殖分化，形成愈伤组织，从而诱导产生不定根，常用的生长素有NAA、IBA、IAA。本发明生根培养基中添加NAA 0.05-0.2mg/L作为外源激素，优选NAA 0.1mg/L，NAA性状稳定，低浓度的NAA利于根系的产生与生长。另外，本发明生根培养基中添加活性炭作为促生根物质，进一步优选活性炭添加量为1.0-2.5g/L，更优选的是添加量为1.5g/L，活性炭减少了根部激素因光照产生的分解以及吸附了根系生长过程中产生的抑制物，能够显著提升玫瑰组培丛生芽的生根率及生根状况。

在植物组织培养中，温度、光照等各种环境条件会影响组织培养的生长和发育，植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能更好，温度过高或过低都会影响生长，且不同培养目标的培养温度也不相同。本发明优选各阶段培养基的pH＝5.8±0.2，进一步优选pH＝5.8；优选各阶段培养温度为20±3℃，进一步优选20℃。光照条件，即光强、光周期及光质也影响着细胞的增殖和器官的分化。本发明优选初代培养、生根培养阶段光照强度为2000-2500Lx，继代增殖培养阶段光照强度为2500-3000Lx；进一步优选初代培养、生根培养阶段光照强度为2500Lx，继代增殖培养阶段光照强度为3000Lx，能够显著提升增殖系数，使组培苗植株长势良好，叶柄与节间的长度、粗细正常，分化良好，生长较快，叶片绿色，无黄叶。

组培苗因其长期处于无菌、恒温、恒湿的培养基环境中，导致生长状况与外界环境下生长的小苗差异巨大，从根系方面看，组培苗由于环境条件稳定，营养丰富，导致其根部吸收能力差，根上基本无根毛，组培苗叶片脆弱，气孔锁水能力弱，若是直接移栽到外界环境，很难从外界吸收到足够的水分与养分加之蒸腾作用，最终导致幼苗死亡。因此移栽之前需要炼苗驯化，逐渐提高组培苗对外界环境的适应能力。本发明优选室温条件下，组培瓶塞半开放置1-2天，再全部打开放置4-6天进行炼苗；进一步优选生根培养中根系良好、生长健壮、高度合适的组培苗移出到光照培养箱中，进行炼苗，在室温条件下，将瓶塞半打开放置1d，再将其全部打开分别放置5d。

组培苗移栽是否成活是植物组织培养能否规模化生产关键所在，玫瑰喜疏松排水良好的基质，透气性是其移栽基质选择的第一要素。本发明优选移栽基质为椰糠：珍珠岩＝1：1(体积比)，该移栽基质能够显著提升玫瑰组培苗移栽成活率。作为一种可实施方式，本发明在移栽前，对移栽基质进行消毒处理，可防止组培苗烂根、污染等问题发生。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明以安玫1号食用玫瑰带腋芽茎段为外植体，探究食用玫瑰组培快繁体系的建立。

实施例1

外植体不同消毒处理对污染率和启动率的影响

在晴朗天气的中午，挑选生长健壮、无病虫害的当年生长的枝条，除去小刺和叶柄，放置于流水下冲洗10min，用软毛刷将枝条上的灰尘刷洗干净，注意不要损伤腋芽，然后放入洗衣粉震荡，再放置在流水下冲洗30min，然后在超净工作台上做进一步消毒处理。先用75％酒精浸泡，无菌水冲洗2到3遍，再经过添加过吐温20的4％次氯酸钠消毒，无菌水冲洗3-4遍，用灭菌过滤纸吸干外植体表面水分，最后在培养皿中将材料切成长约1cm的单腋芽茎段，注意上端平切，下端斜切并按照形态学下端朝下将茎段接种于初代培养基中。每处理接种20瓶，每瓶接种外植体3个，重复3次。20d后统计污染率和启动率。处理见表1。

表1外植体不同消毒时间组合

由图2可看出(注：小写字母表示p＝0.05差异显著水平，字母不相同表示差异显著(p<0.05))，不同消毒处理对外植体污染率和启动率的影响差异很大。9种处理中，外植体的污染率和启动率均与75％乙醇和4％次氯酸钠处理时间正相关，均随着处理时间的延长逐渐降低。其中，A1处理外植体的启动率最高，为86.1％，但污染率也最高，为31.1％；A9处理外植体的启动率最低，为44.8％，但污染率也最低，为1.7％。这说明，随着消毒处理时间的延长，污染率不断降低，但外植体的启动率也不断降低。消毒剂长时间的浸泡在起杀菌作用的同时，还对外植体造成了伤害。进一步延长处理时间(A7\A8\A9)的污染率差异不显著，但启动率显著降低。综合分析污染率和启动率的测定结果，确定A6处理，即75％乙醇40s+4％次氯酸钠10min为最佳消毒处理方案。

实施例2

不同激素组合对初代培养的影响

以MS培养基作为初代培养基本培养基，采用不同浓度的细胞分裂素6-BA(1mg/L、2mg/L、3mg/L)和不同浓度的生长素NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L)进行试验，试验处理方法见表2。每处理接种20瓶，每瓶接种外植体3个，重复3次。30d后统计启动率和芽高。

表2初代培养中不同浓度激素组合

由表3可看出(注：小写字母表示p＝0.05差异显著水平，字母不相同表示差异显著(p<0.05))：随着6-BA浓度的增加，茎段腋芽的启动率也不断提高；随着NAA浓度的增加，茎段腋芽的启动率呈现先上升后下降的趋势。这说明6-BA和NAA对腋芽启动率的影响不同。其中，T1培养基的启动率(53.3％)最低，T8培养基的启动率(91.7％)最高。随着6-BA，NAA浓度的增加，不定芽的平均芽高先上升后下降的趋势，但通过分析两者对茎段不定芽平均芽高的影响差异显著性不同。其中，T1培养基的平均芽高最低，T8培养基的平均芽高(1.62cm)最高。

表3不同浓度激素配比对初代培养的影响

由表4可得出，6-BA和NAA对芽高的影响都达到显著水平。由芽高的邓肯检验多重比较结果表可以得出，6-BA浓度为3.0mg/L时平均芽高达到最大值1.93cm，与浓度为1.0mg/L与浓度为2.0mg/L对芽高影响差异显著。0.2mg/L的NAA处理芽高达到最大值1.9cm且与0.2mg/L，0.3mg/L的处理对芽高影响差异显著。

综合分析6-BA和NAA对腋芽启动率和平均芽高的影响发现，T8培养基对玫瑰茎段腋芽的启动率和芽高近乎有最好的效果。所以，确定T8培养基，即MS+6-BA 3.0mg/L+NAA0.2mg/L为最佳初代培养基。

表4初代培养中芽高的方差分析

表5芽高的事后多重比较(邓肯检验)

实施例3

不同抗褐化物对外植体褐化的影响

通过试验发现在食用玫瑰的组织培养过程中发现褐化现象较为严重，直接影响组培苗的正常生长。因此论文探讨不同浓度的各抗褐化物对外植体褐化的控制效果，试验处理见表6。每处理接种20瓶，每瓶接种外植体3个，重复3次。30d后统计褐化情况和生长状况。

表6抗褐化处理试验设计方案

由表7可知，试验结果表明：培养基中加入维CVC(0.5-1.5g/L)、活性炭AC(0.5-1.5g/L)、聚乙烯吡咯烷酮PVP(1-3g/L)均能在不同程度上降低茎段褐化的发生，统计其褐变率及植株生长情况。其中抑制效果最佳的是1.0g/L的维C处理，褐变率最低。植株长势良好，植株粗壮，生长快，叶绿宽大，无黄叶。

表7不同处理对带腋芽茎段褐化的影响

实施例4

培养基种类与激素配比对增殖系数的影响

选用三因素三水平正交实验设计，以适于玫瑰生长发育的MS、B5、WPM培养基为基本培养基，添加不同浓度的细胞分裂素6-BA(0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L)和不同浓度的生长素NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L)，处理方法见表8。将初代培养培育的生长健壮的丛生苗在无菌环境中去除多余的老化黄化组织，剪切之后接种到增殖培养基中，每处理接种20瓶，每瓶接种3个茎段，重复3次。30d后统计增殖系数。

表8增殖培养三因素三水平正交试验设计方案

通过设计三因素三水平正交实验，探究最适宜食用玫瑰继代培养的培养基种类及6-BA，NAA浓度搭配。由表9可知(注：K1、K2、K3分别为各列各水平的增殖系数均值；R为极值；各列数据后的不同字母表示差异显著性水平(p＜0.05))，培养基、6-BA、NAA的极值分别为1.38、0.34、0.19。由此可知，影响继代培养中增殖系数主因子效应大小依次为基本培养基＞6-BA＞NAA。A因素培养基种类效果明显好于B、C因素。由表9正交分析可知，培养基与6-BA对增殖系数的影响显著性均小于0.05，NAA对增殖系数的影响显著性大于0.05，说明培养基与6-BA对影响效果显著，NAA对增殖系数的影响效果不显著。且由表可得正交试验最优组合为A1B2C2，即MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA为继代培养最佳培养基组合。

表9增殖系数的极差分析与多重比较

实施例5

不同强度光照对增殖系数的影响

玫瑰是喜阳植物，适合的光照强度对玫瑰生长至关重要。试验研究了不同强度光照处理(1000lx、2000lx、3000lx、4000lx)对不定芽增殖的影响，每个处理接种20个不定芽，3次重复、30d后统计计算增殖系数。

由表10可见(注：小写字母表示p＝0.05差异显著水平，字母不相同表示差异显著(p<0.05))，适宜的光照强度是食用玫瑰组培苗正常生长的必要条件。2000-3000lx的光照强度是组培苗的最佳光强范围。不同强度光照对增殖系数的影响均显著，光照强度为3000lx时增殖系数最高。低于2000lx的光强时组培苗叶片较小，叶柄细长，茎细长、节间较大，植株瘦弱、脆嫩，几乎无分化，部分出现玻璃化。2000lx的光强是保证组培苗正常生长的最低光照强度。光强过高时组培苗叶片浓绿，叶柄较短，茎节较短，植株粗壮、生长缓慢，衰老较快，分化较低。3000lx的光强是保证组培苗具有较高增殖系数的最高光照强度。

表10不同强度光照对增殖继代的影响

实施例6

培养基种类对生根的影响

选取在增殖培养中长势良好的组培苗分别接种在MS、1/2MS、1/4MS、WPM、B5培养基上，添加0.2mg/L NAA进行玫瑰生根培养，以筛选出最适于玫瑰生根培养的基本培养基。每个处理接种20个组培苗，重复3次，培养30d后统计各处理生根率与植株生长状况。

不同生根培养基的生根状况如表11所示，培养基种类对生根影响差异较大，其中1/2MS培养基生根率最高，根部生长健壮。MS与1/4MS培养基虽然生根率较高，但根生长状况略逊与1/2MS，B5培养基生根状况不佳而WPM根数较少。综合考虑1/2MS培养基为最适生根培养基。

表11培养基种类对生根的影响

实施例7

不同浓度NAA对组培苗生根的影响

以实施例9中生根率最高的基本培养基作为生根培养基，添加不同浓度的NAA。将增殖培养后生长良好的组培苗接种于生根培养基中，进行生根培养，每处理接种20瓶，每瓶接种外植体3个，重复3次。30d后统计生根率、根长和根数。

由表12可知(注：小写字母表示p＝0.05差异显著水平，字母不相同表示差异显著(p<0.05))，与空白对照相比，添加了植物激素NAA各处理组培苗的生根率有效提高。随着NAA浓度的增加，食用玫瑰组培苗生根率呈先逐渐升高再逐渐降低的趋势，在浓度0.1mg/L左右到达生根率达到最大值83.3％，说明适当的NAA浓度有利于组培苗的生根，浓度太高或太低都不利于食用玫瑰组培苗的生根；有效根长方面随NAA浓度的增加，有效根长呈先升高后下降的趋势，在NAA浓度为0.1mg/L时有效根长达到最大值4.75cm且与其余处理差异均显著。且NAA浓度较高时，愈伤组织大量生长，影响组培苗正常生根。组培苗有效根数在NAA浓度为0.05mg/L与0.1mg/L时有效根数最高但差异并不显著，说明较低浓度的NAA处理有利于组培苗根的发生。因此综合考虑生根率、根长与根数，最适宜食用玫瑰生根培养的NAA浓度为0.1mg/L。

表12不同浓度NAA对生根的影响

实施例8

不同浓度活性炭对组培苗生根的影响

因活性炭能够保护植物激素受光照分解与吸附植物生长抑制物，有促进生根的效果。在上述的基础上，添加不同浓度活性炭(0、0.50、1.50、2.00、2.50、3.00g/L)对组培苗进行生根培养，每个处理接种20个组培苗，3次重复，培养30d后，统计其生根情况。

由表13可知(注：小写字母表示p＝0.05差异显著水平，字母不相同表示差异显著(p<0.05))，适宜浓度的AC对玫瑰组培苗的生根有较大的促进作用，AC是非选择性吸附剂，随着AC浓度的上升，生根率呈现先上升在下降的趋势，说明适宜浓度的AC对启动率由一定促进作用且浓度较高或较低都会抑制生根。对根长的研究发现活性炭浓度较低时对根长有促进作用。对根数的研究发现，活性炭对生根数目由一定促进作用，到达一定浓度后促进作用不显著。另外发现与空白对照相比，过低或过高浓度活性炭处理生根率与根长方面有所退化，但组培苗长势较好，说明活性炭有一定壮苗效果。综合生根率、根长与根数考虑，1.5g/L的活性炭处理对生根促进效果最佳。

表13不同含量活性炭处理对生根指数的影响

实施例9

移栽基质的筛选

选取生根培养中根系良好、生长健壮、高度合适的组培苗移出到光照培养箱中，进行炼苗。在室温条件下，将瓶塞半打开放置1d，再将其全部打开分别放置5d，选择组培苗高于3.00cm，根系未老化的植株在温室中按上述最佳炼苗时间对其进行炼苗后，去除掉表面附着的生根培养基移栽于经高温高压灭菌过的不同基质K1(椰糠:珍珠岩＝1:1)、K2(椰糠:细沙＝1:1)和K3(珍珠岩:细沙＝1:1)中，每个处理移栽20棵组培苗，3次重复，在光照培养箱中培养30d后观察植株的生长情况，统计计算成活率。所述比例为体积比。

将炼苗过的组培苗清洗干净后移入不同的培养基中，一段时间后统计成活率，结果如表14所示。K1基质中幼苗成活率最高，达到了93.3％，植株生长状况良好，茎秆粗壮，叶片深绿。而K3处理成活率最低只有76.7％，植株长势偏弱，部分叶片黄绿。

表14移栽基质对幼苗成活率的影响

实施例10

一种食用玫瑰的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择：在晴朗天气的中午，挑选生长健壮、无病虫害的当年生长的枝条，除去小刺和叶柄，放置于流水下冲洗10min，用软毛刷将枝条上的灰尘刷洗干净，注意不要损伤腋芽，然后放入洗衣粉震荡，再放置在流水下冲洗30min。

(2)外植体的消毒：在超净工作台上，先用75％酒精浸泡40s，无菌水冲洗3遍，再经过添加过吐温的4％次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗4遍，用灭菌过滤纸吸干外植体表面水分，最后在培养皿中将材料切成长1cm的单腋芽茎段。

(3)初代培养：将单腋芽茎段上端平切，下端斜切并按照形态学下端朝下将茎段接种于初代培养基中。初代培养基组成为：MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.2mg/L+Vc 1.0g/L；初代培养条件为：培养基pH＝5.8，培养温度20℃，光照强度2500Lx。启动率91.7％，褐变率10％。

(4)继代增殖培养：初代培养外植体芽高至1.8cm以上后，挑选生长健壮的丛生苗在无菌环境中去除多余的老化黄化组织，剪切之后接种到继代增殖培养基中。继代增殖培养基组成为：MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L；继代增殖培养条件为：培养基pH＝5.8，培养温度20℃，光照强度3000Lx。增殖系数3.50。

(5)生根培养：将继代增殖培养基获得的丛生芽转移至生根培养基进行培养。生根培养基组成为：1/2MS+NAA 0.1mg/L+活性炭1.5g/L；生根培养条件为：培养基pH＝5.8，培养温度20℃，光照强度2500Lx。生根率85％。

(6)炼苗移栽：待组培苗在生根培养基发育出完整根系后，将生根组培苗进行炼苗移栽。移栽基质为椰糠:珍珠岩＝1:1。移栽成活率93.3％。

实施例11

(1)外植体的选择：在晴朗天气的中午，挑选生长健壮、无病虫害的当年生长的枝条，除去小刺和叶柄，放置于流水下冲洗10min，用软毛刷将枝条上的灰尘刷洗干净，注意不要损伤腋芽，然后放入洗衣粉震荡，再放置在流水下冲洗30min。

(2)外植体的消毒：在超净工作台上，先用75％酒精浸泡40s，无菌水冲洗2遍，再经过添加过吐温的4％次氯酸钠消毒4min，无菌水冲洗4遍，用灭菌过滤纸吸干外植体表面水分，最后在培养皿中将材料切成长1cm的单腋芽茎段。

(3)初代培养：将单腋芽茎段上端平切，下端斜切并按照形态学下端朝下将茎段接种于初代培养基中。初代培养基组成为：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+Vc 1.0g/L；初代培养条件为：培养基pH＝5.6，培养温度17℃，光照强度2000Lx.启动率71.7％，褐变率11.3％。

(4)继代增殖培养：初代培养外植体芽高至1.8cm以上后，挑选生长健壮的丛生苗在无菌环境中去除多余的老化黄化组织，剪切之后接种到继代增殖培养基中。继代增殖培养基组成为：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L；继代增殖培养条件为：培养基pH＝5.6，培养温度17℃，光照强度2500Lx。增殖系数3.05。

(5)生根培养：将继代增殖培养基获得的丛生芽转移至生根培养基进行培养。生根培养基组成为：1/2MS+NAA 0.05mg/L+活性炭1.0g/L；生根培养条件为：培养基pH＝5.6，培养温度17℃，光照强度2000Lx。生根率72％。

(6)炼苗移栽：待组培苗在生根培养基发育出完整根系后，将生根组培苗进行炼苗移栽。移栽基质为椰糠:珍珠岩＝1:1。移栽成活率93.0％。

实施例12

(1)外植体的选择：在晴朗天气的中午，挑选生长健壮、无病虫害的当年生长的枝条，除去小刺和叶柄，放置于流水下冲洗10min，用软毛刷将枝条上的灰尘刷洗干净，注意不要损伤腋芽，然后放入洗衣粉震荡，再放置在流水下冲洗30min。

(2)外植体的消毒：在超净工作台上，先用75％酒精浸泡40s，无菌水冲洗3遍，再经过添加过吐温的0.1％次氯酸钠消毒7min，无菌水冲洗5遍，用灭菌过滤纸吸干外植体表面水分，最后在培养皿中将材料切成长1cm的单腋芽茎段。

(3)初代培养：将单腋芽茎段上端平切，下端斜切并按照形态学下端朝下将茎段接种于初代培养基中。初代培养基组成为：MS+6-BA 3mg/L+NAA 0.3mg/L+Vc 1.5g/L；初代培养条件为：培养基pH＝6.0，培养温度23℃，光照强度2200Lx，启动率78.3％，褐变率12.5％。

(4)继代增殖培养：初代培养外植体芽高至1.8cm以上后，挑选生长健壮的丛生苗在无菌环境中去除多余的老化黄化组织，剪切之后接种到继代增殖培养基中。继代增殖培养基组成为：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.3mg/L；继代增殖培养条件为：培养基pH＝6.0，培养温度23℃，光照强度2700Lx。增殖系数3.00。

(5)生根培养：将继代增殖培养基获得的丛生芽转移至生根培养基进行培养。生根培养基组成为：1/2MS+NAA 0.2mg/L+活性炭2.5g/L；生根培养条件为：培养基pH＝6.0，培养温度23℃，光照强度2200Lx。生根率70％。

(6)炼苗移栽：待组培苗在生根培养基发育出完整根系后，将生根组培苗进行炼苗移栽。移栽基质为椰糠:珍珠岩＝1:1。移栽成活率92.5％

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种食用玫瑰的组织培养方法，包括外植体的初代培养、继代增殖培养、生根培养和炼苗移栽，其特征在于，

所述外植体为食用玫瑰带腋芽茎段；所述外植体培养前进行消毒，包括：外植体洗净后75％乙醇浸泡40s，无菌水冲洗2-3遍，4％次氯酸钠浸泡4-10min，无菌水冲洗3-4遍；

所述初代培养培养基组成为：MS+6-BA2-3mg/L+NAA0.2-0.3mg/L+Vc 1.0-1.5g/L；

所述继代增殖培养培养基组成为：MS+6-BA0.5-2.5mg/L+NAA0.1-0.3mg/L；

所述生根培养培养基组成为：1/2MS+NAA0.05-0.2mg/L+活性炭1.0-2.5g/L；

所述组织培养各阶段培养基的pH＝5.8±0.2；所述组织培养各阶段的培养温度为20±3℃；

所述初代培养、生根培养阶段光照强度为2000-2500Lx，继代增殖培养阶段光照强度为2500-3000Lx；

所述移栽的基质为等体积混合的椰糠和珍珠岩。

2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述炼苗移栽包括：室温条件下，组培瓶塞半开放置1-2天，再全部打开放置4-6天，取出移栽。

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