CN103960133A - 一种食用玫瑰组培快繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蔷薇科蔷薇属落叶直立灌木食用玫瑰（RosarugosaThunb.）的组培快繁方法，属于园艺植物种苗繁殖技术领域。本发明通过对食用玫瑰幼茎进行离体培养，建立起食用玫瑰组培快繁体系。包括外植体的选取消毒、初代培养、增殖培养、生根培养四个阶段。本发明具有方法简单，繁殖速率高，培育周期短，繁殖系数高的优点，在实际生产应用中具有较强的可行性，解决了食用玫瑰苗木繁殖率低，繁殖周期长的技术难题，适用于食用玫瑰种苗商业化生产，满足市场的迫切需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种食用玫瑰组培快繁的方法，特别是一种利用食用玫瑰幼茎进行组织培养快速繁殖的方法，属于园艺植物种苗繁殖技术领域。
背景技术
食用玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）为蔷薇科蔷薇属，原产中国，为落叶直立灌木。目前，不仅中国广泛栽培，日本、朝鲜及欧美各国也有大量栽培。其在医药、工业、食品、日用化工等领域使用价值极为广泛。 近几年，云南省食用玫瑰的发展相当迅速，其良好的食用价值和观赏价值使得食用玫瑰受到很多人的亲睐，致使需求量迅速增加，市场前景广阔。目前云南省食用玫瑰面积达10000亩左右，玫瑰加工企业不断增加，玫瑰鲜花产品供不应求，种植生产前景广阔。
由于食用玫瑰种间杂交亲和力低，种子萌发弱，种子幼苗成活率低；其传统繁殖方式主要是嫁接、扦插繁殖，繁殖周期长、繁殖系数低、成活率低，且后代品质下降，远远不能满足市场的需求。因此如何提高食用玫瑰的繁殖效率成为食用玫瑰资源供应要解决的一个关键技术。植物组织培养是植物规模化生产的一种快速高效繁殖方法。可是目前还没有任何关于食用玫瑰组织培养方面的报道。因此，急需对食用玫瑰组培快繁技术进行研究，建立起一套食用玫瑰快速、经济的快繁技术体系。
经文献检索，目前还没有任何关于食用玫瑰组织培养方面公开发表的内容。
发明内容
本发明的目的在于克服上述传统繁殖方式的不足，发明一种利用食用玫瑰幼茎进行组培培养快速繁殖的方法。既可以防止多代无性繁殖种性退化及病毒感染，保证种源的优良性和遗传稳定性，又可以为食用玫瑰生产提供足够的种源。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种食用玫瑰组培快繁的方法，其特征在于包含以下步骤：
A外植体的选择和消毒：于4月剪取生长健壮、无病虫害的食用玫瑰幼茎，去除叶片，用软毛刷蘸少量洗涤剂刷洗干净，然后切成小段，置于烧杯中并用流水冲洗2h，移入无菌操作台进行后续消毒处理；
先用无菌水冲洗2-3次，再用75%乙醇浸泡30s，取出后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1%升汞浸泡8min，取出后用无菌水冲洗5-6次，然后将茎段置于无菌滤纸上吸干表面水分，最后用手术刀将幼茎切成2cm长的茎段备用；
B初代培养：初代培养基成分为MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；初代培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃；将消毒后幼茎横向接种于初代培养基上，培养20d后，嫩芽开始萌发，10d后将嫩芽切取接种于增殖培养基；
C增殖培养：增殖培养基成分为MS+6-BA3mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；增殖培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃；切取初代培养基上的嫩芽转接到增殖培养基上培养20d后，嫩芽会分化出大量丛生芽，每30d切取丛生芽在相同培养条件转接一次，可实现丛生芽的不断增殖；
D生根培养：生根培养基成分为1/2MS+NAA1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；选取增殖培养基中生长健壮的丛生芽，将其切分为单芽茎段，转接到生根培养基上；生根培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃，培养20d后不定根开始萌发。
所述步骤（A）中取材于4月的食用玫瑰幼茎为最佳接种外植体。
所述步骤（A）中食用玫瑰幼茎的消毒方法为：75％乙醇30s + 0.1％升汞8min。
所述步骤（B）中食用玫瑰初代培养基配方为：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1 mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8。
于所述步骤（B）中食用玫瑰幼茎横向接种于初代培养基上。
所述步骤（C）中食用玫瑰增殖培养基配方为：MS+6-BA3mg/L+NAA0.1 mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8。
所述步骤（D）中食用玫瑰生根培养基配方为：1/2MS+NAA1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8。
本发明的优点在于：通过采用外植体选择消毒、初代培养、增殖培养、生根培养相结合的配套技术，实现了食用玫瑰的组织培养快速繁殖。
本发明具有方法简单，繁殖速率高，培育周期短，繁殖系数高的优点，在实际生产应用中具有较强的可行性，解决了食用玫瑰苗木繁殖率低，繁殖周期长的技术难题，适用于食用玫瑰种苗商业化生产，满足市场的迫切需求。
附图说明
图1 为本发明初代培养20天的无菌苗状态。
图2 为本发明增殖培养20天的无菌苗状态。
图3 为本发明生根培养40天无菌苗的根系情况。
具体实施方式
本发明方法是针对蔷薇科蔷薇属落叶直立灌木食用玫瑰（Rosa rugosa Thunb.），通过外植体的选择消毒、初代培养、增殖培养、生根培养等四个技术环节的调控，能有效实现食用玫瑰组织培养快速繁殖。具体包含以下步骤：
A外植体的选择和消毒：于4月剪取生长健壮、无病虫害的食用玫瑰幼茎，去除叶片，用软毛刷蘸少量洗涤剂刷洗干净，然后切成小段，置于烧杯中并用流水冲洗2h，移入无菌操作台进行后续消毒处理。先用无菌水冲洗2-3次，再用75%乙醇浸泡30s，取出后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1%升汞浸泡8min，取出后用无菌水冲洗5-6次，然后将茎段置于无菌滤纸上吸干表面水分，最后用手术刀将幼茎切成2cm长的茎段备用。
初代培养：初代培养基成分为MS+6-BA1mg/L+NAA0.1 mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；初代培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃；将消毒后幼茎横向接种于初代培养基上，培养20d后，嫩芽开始萌发，10d后将嫩芽切取接种于增殖培养基。
增殖培养：增殖培养基成分为MS+6-BA3mg/L+NAA0.1 mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；增殖培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃；切取初代培养基上的嫩芽转接到增殖培养基上培养20d后，嫩芽会分化出大量丛生芽，每30d切取丛生芽在相同培养条件转接一次，可实现丛生芽的不断增殖。
生根培养：生根培养基成分为1/2MS+NAA1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；选取增殖培养基中生长健壮的丛生芽，将其切分为单芽茎段，转接到生根培养基上；生根培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃，培养20d后不定根开始萌发。
为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用以下实例中对外植体的选择消毒、初代培养、增殖培养、生根培养技术的研究筛选过程进行充分的说明，以证明/说明本研究成果的正确性，可靠性和能够工业化生产，但并非说明本发明仅限用于这些例子。
不同外植体取样时间的选择研究
本发明为研究外植体的最佳取样时期，研究了不同取样时期幼茎的污染率和萌动情况。分别于4月、10月剪取生长健壮、无病虫害的食用玫瑰幼茎，去除叶片，用软毛刷蘸少量洗涤剂刷洗干净，然后切成小段，置于烧杯中并用流水冲洗2h，移入无菌操作台进行后续消毒处理。先用无菌水冲洗2-3次，再用75%乙醇浸泡30s，取出后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1%升汞浸泡8min，取出后用无菌水冲洗5-6次，然后将茎段置于无菌滤纸上吸干表面水分，最后用手术刀将幼茎切成2cm长的茎段接种于MS+6-BA1mg/L+NAA0.1 mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8的初代培养基上；每处理接种30瓶，每瓶接种3个外植体，接种后的材料在光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃的条件下培养，2d后开始统计萌动时间、污染率并记录。
试验发现，处理1外植体污染率低，为3.3％；处理2污染率高，为26.7％；处理1的外植体3d后便开始萌动，生长很快，芽生长健壮；而处理2幼茎7d后才开始萌动，且生长慢。表明4月为食用玫瑰幼茎的最佳取样时期。
表1 外植体不同取样时期对污染率和萌动时间的影响
b. 不同消毒方法的选择研究
为研究外植体最佳的消毒方法。用3种消毒方法对4月取样的幼茎进行表面消毒，然后分别接种于a中的培养基上，每处理接种30瓶，每瓶接种3个外植体；外植体清洗方法、培养条件同a，2d后开始统计污染率、启动率并记录。
试验发现污染率由高到低依次为处理1、处理2、处理3，污染率分别为37.3%、20.5%、6.7%，启动率由高到低依次为处理2、处理1、处理3，分别为97.5%、80.3%、66.7%。处理1、处理2的外植体萌动较快，3天后外植体部分萌动，7d后全部萌动；处理3的外植体萌动慢，5d后部分萌动，10天后全部萌动。综合考虑污染率、启动率、萌动时间三个因素，认为75％乙醇30s + 0.1％升汞8min为食用玫瑰幼茎的最佳表面消毒方法。
表2 外植体不同消毒方法对污染率和启动率的影响
c. 不同糖分含量对初代培养的影响
为研究不同糖分对初代培养的影响，分别在糖分浓度不同的培养基上接种外植体，外植体清洗方法、培养条件同a。每处理接种30瓶，每瓶接种外植体3个，20d后统计启动率、平均生长量并记录生长情况。
试验发现处理1的平均生长量为1.6cm，启动率为63.3％，芽生长细弱，叶黄绿色。处理2和处理1的启动率相同，平均生长量稍低，为1.5cm，芽生长健壮，叶绿色。因此认为30g/L是食用玫瑰组织的初代培养的适宜的糖浓度。
表3 不同糖分含量对初代培养的影响
d. 不同接种方式对初代培养的影响
为研究不同接种方式对初代培养的影响，分别采用横、竖两种方式接种外植体，诱导萌芽。外植体清洗方法、培养条件同a。每处理接种30瓶，每瓶接种外植体3个，20d后统计启动率、平均生长量并记录生长情况。
试验发现处理2，离体芽平均生长量、启动率均明显高于处理1，分别为1.5cm、83％，幼茎两端产生大量愈伤组织，中部有少量愈伤组织产生，愈伤组织长势紧密，芽生长健壮；处理1离体芽的平均生长量、启动率、愈伤组织诱导率相对较低，分别为1.2cm、60％、52.7％、幼茎下端产生少量愈伤组织，叶托上产生少量愈伤组织。由此可知，横接更利于幼茎侧芽诱导，这是因为我们采用的横接的外植体与培养基接触面积比传统的竖接要大一些，从而更有利于材料接受外源激素刺激和营养物质的吸收有关。
表4 外植体不同接法对初代培养的影响
| 处理 | 横竖接法 | 平均生长量（cm） | 启动率（%） |
| 1 | 竖 | 1.2 | 60 |
| 2 | 横 | 1.5 | 83 |
e. 不同植物生长调节物质组合对初代培养的影响
为研究不同浓度植物生长调节物质组合对侧芽诱导的影响，在含有不同浓度植物生长调节物质的培养基上接种外植体。外植体清洗方法、培养条件同a。每处理接种30瓶，每瓶接种外植体3个，20d后统计平均生长量、启动率并记录生长情况。
试验发现食用玫瑰幼茎侧芽诱导情况因培养基植物生长调节物质浓度的改变而不同，不同植物生长调节物质组合对平均生长量有较大的影响。当6-BA浓度为0.5mg／L时，侧芽的平均生长量随着NAA浓度的提高而增加；当6-BA浓度为1mg／L时，侧芽的平均生长量随着NAA的浓度的提高而减少；处理4的侧芽平均生长量最大。6个处理均能启动外植体产生愈伤组织，处理4启动率最高，为81.3％；处理1、处理2、处理3愈伤组织较疏松，且稀少；而处理4、处理5愈伤组织较紧密，较多。因此初代培养基植物生长调节物质的最佳组合为：6-BA1mg／L，NAA0.1mg／L，侧芽平均生长量最大，生长健壮，叶绿色。
表5 不同植物生长调节物质对平均生长量的影响
| 处理 | 6-BA（mg/L） | NAA（mg/L） | 平均生长量（cm） | 启动率（%） |
| 1 | 0.5 | 0.1 | 1.5 | 61.1 |
| 2 | 0.5 | 0.3 | 2.0 | 64.7 |
| 3 | 0.5 | 0.5 | 2.1 | 70.6 |
| 4 | 1.0 | 0.1 | 2.7 | 81.3 |
| 5 | 1.0 | 0.3 | 2.2 | 75.0 |
| 6 | 1.0 | 0.5 | 1.1 | 58.8 |
f. 不同植物生长调节物质对增殖培养的影响
为研究不同浓度植物生长调节物质对芽增殖和芽生长的影响，将初代培养中萌发的嫩芽切下转接到含有不同浓度植物生长调节物质的培养基中，培养条件同a。每处理接种30瓶，每瓶接种外植体3个，20d后统计苗高、计算增殖系数并记录生长情况。
试验发现将诱导的不定芽分别接种于含不同植物生长调节物质的MS培养基中培养，7d后不定芽开始膨大，14d后不定芽开始分化出丛生芽，但不同植物生长调节物质的增值效果不同。在6-BA浓度不变的情况下，芽的增殖系数随着NAA浓度的增加而增加，其中处理6的增值倍数为3.5，增殖效果最佳，且继代3次后生长良好，丛生芽多，叶色绿，芽生长健壮。因此增殖培养基的最佳配方为MS+6-BA3mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。
表6 不同植物生长调节物质组合对芽增值的影响
| 处理 | 6-BA(mg/L) | NAA(mg/L) | 增殖系数 | 生长情况 |
| 1 | 1.0 | 0.05 | 2.3 | 丛生芽少，叶色绿，芽生长弱 |
| 2 | 1.0 | 0.10 | 2.5 | 丛生芽少，叶色绿，芽生长弱 |
| 3 | 2.0 | 0.05 | 2.5 | 丛生芽多，叶色深绿，芽生长壮 |
| 4 | 2.0 | 0.10 | 2.7 | 丛生芽多，叶色深绿，芽生长壮 |
| 5 | 3.0 | 0.05 | 3.0 | 丛生芽多，叶色绿，芽生长壮 |
| 6 | 3.0 | 0.10 | 3.5 | 丛生芽最多，叶色绿，芽生长壮 |
g. 不同植物生长调节物质对生根培养的影响
为研究不同浓度植物生长调节物质对生根培养的影响，选取继代培养基中生长健壮的丛生芽，将其切分为单芽茎段，转接到含有不同浓度生长调节物质的1/2MS培养基上，培养条件同a。每处理接种30瓶，每瓶接种外植体3个，30d后统计生根率并记录生长情况。
试验发现3个处理组培苗根系发生早，茎基部均有少量愈伤组织，但根均从茎上长出；处理1根较粗，有少量根毛，黄色，处理2根粗短，愈伤化，黄色，处理3根较粗而长，根毛多，淡黄色，且其中处理3生根率最高，因此生根培养的最佳配方为1/2MS+NAA1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。
表7植物生长调节物质对组培苗生根的影响
| 处理 | NAA（mg/L） | IBA（mg/L） | 生根率（%） | 生根情况 |
| 1 | 0 | 1 | 75 | 根较粗，有少量根毛，黄色，茎基部有少量愈伤， |
| 2 | 0.5 | 0.5 | 56.7 | 根粗短，愈伤化，黄色，茎基部有少量愈伤 |
| 3 | 1 | 0 | 81.7 | 根较粗而长，根毛多，淡黄色，茎基部有少量愈伤 |
本发明具有方法简单，繁殖速率高，培育周期短，繁殖系数高的优点，在实际生产应用中具有较强的可行性，解决了食用玫瑰苗木繁殖率低，繁殖周期长的技术难题，适用于食用玫瑰种苗商业化生产，满足市场的迫切需求。
本发明利用食用玫瑰幼茎，进行组织培养快速繁殖的方法，对于提高食用玫瑰种苗繁殖系数，缩短繁殖周期，满足市场的迫切需求具有现实意义。
Claims (7)
1.一种食用玫瑰组培快繁的方法，其特征在于包含以下步骤：
A外植体的选择和消毒：于4月剪取生长健壮、无病虫害的食用玫瑰幼茎，去除叶片，用软毛刷蘸少量洗涤剂刷洗干净，然后切成小段，置于烧杯中并用流水冲洗2h，移入无菌操作台进行后续消毒处理；
先用无菌水冲洗2-3次，再用75%乙醇浸泡30s，取出后用无菌水冲洗3-4次，再用0.1%升汞浸泡8min，取出后用无菌水冲洗5-6次，然后将茎段置于无菌滤纸上吸干表面水分，最后用手术刀将幼茎切成2cm长的茎段备用；
B初代培养：初代培养基成分为MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；初代培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃；将消毒后幼茎横向接种于初代培养基上，培养20d后，嫩芽开始萌发，10d后将嫩芽切取接种于增殖培养基；
C增殖培养：增殖培养基成分为MS+6-BA3mg/L+NAA0.1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；增殖培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃；切取初代培养基上的嫩芽转接到增殖培养基上培养20d后，嫩芽会分化出大量丛生芽，每30d切取丛生芽在相同培养条件转接一次，可实现丛生芽的不断增殖；
D生根培养：生根培养基成分为1/2MS+NAA1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8；选取增殖培养基中生长健壮的丛生芽，将其切分为单芽茎段，转接到生根培养基上；生根培养条件为光照强度2000lx，光照10h/d，温度25±2℃，培养20d后不定根开始萌发。
2. 根据权利要求1所述的一种食用玫瑰组培快繁方法，其特征在于所述步骤（A）中取材于4月的食用玫瑰幼茎为最佳接种外植体。
3.根据权利要求1所述的一种食用玫瑰组培快繁方法，其特征在于所述步骤（A）中食用玫瑰幼茎的消毒方法为：75％乙醇30s + 0.1％升汞8min。
4.根据权利要求1所述的一种食用玫瑰组培快繁方法，其特征在于所述步骤（B）中食用玫瑰初代培养基配方为：MS+6-BA1mg/L+NAA0.1 mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8。
5.根据权利要求1所述的一种食用玫瑰组培快繁方法，其特征在于所述步骤（B）中食用玫瑰幼茎横向接种于初代培养基上。
6.根据权利要求1所述的一种食用玫瑰组培快繁方法，其特征在于所述步骤（C）中食用玫瑰增殖培养基配方为：MS+6-BA3mg/L+NAA0.1 mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8。
7.根据权利要求1所述的一种食用玫瑰组培快繁方法，其特征在于所述步骤（D）中食用玫瑰生根培养基配方为：1/2MS+NAA1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.8。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140806 |