CN105638477B - 一种竹叶石斛种子快速繁殖方法 - Google Patents

一种竹叶石斛种子快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，公开了一种竹叶石斛种子快速繁殖方法，包括预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分化培养阶段和生根壮苗培养阶段四个阶段。本发明提供的竹叶石斛种子快速繁殖方法，在种子萌发阶段，45d即可出现大量原球茎，种子萌发率高达95％；在原球茎分化阶段，分化出小苗的时间控制在60d以内，最优可到50d；在生根壮苗培养阶段，45d左右组培苗长到3cm以上，根的条数为2条以上。从种子萌发到无菌苗生根，达到炼苗移栽要求，这一周期的时间在150d以内，大大加快了竹叶石斛种子繁殖速度，为竹叶石斛的快速生产提供了便利。

Description

一种竹叶石斛种子快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种竹叶石斛种子快速繁殖方法。
背景技术
竹叶石斛又名细叶石斛，学名Dendrobium hancockii Rolfe，是一种名贵中药，具有养阴益胃、生津止渴等功效，药用价值和经济价值极高。
此外，竹叶石斛的观赏价值极高，花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，气味芳香，被喻为“四大观赏洋花”之一，即可作切花，也可盆栽观赏。
竹叶石斛的种子非常细小，自然条件下极难萌发，而传统的分株繁殖和扦插繁殖方法速度较慢，难于满足市场需求。采用植物组织培养技术是大量繁殖种苗的有效途径，但是却未见有关竹叶石斛的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足，克服现有技术的缺陷，提供一种竹叶石斛种子快速繁殖方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种竹叶石斛种子快速繁殖方法，包括预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分化培养阶段和生根壮苗培养阶段；具体步骤如下：
步骤(1)、预处理阶段：竹叶石斛的成熟果荚表面依次用75％酒精、0.1wt％升汞消毒，再用无菌水处理，再将果荚浸入75％酒精，取出除去果荚表面水分，置于灭过菌的接种盘中，切开果荚，取出种子；
步骤(2)、种子萌发培养阶段：将种子接种于种子萌发培养基中萌发，培养温度为25℃～27℃，光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为12h/d；培养40d～50d得到原球茎；所述的种子萌发培养基为1/2MS培养基；
步骤(3)、原球茎分化培养阶段：原球茎采用原球茎分化培养基进行培养，培养温度为25℃～27℃，光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为12h/d，培养50～60d使原球茎分化出竹叶石斛小苗；
步骤(4)、生根壮苗培养阶段：原球茎分化培养阶段得到的竹叶石斛小苗采用生根壮苗培养基进行培养，培养温度为25℃～27℃，光照强度2000lx～3000lx，光照时间12h/d，培养40d～50d得到组培苗。
作为竹叶石斛种子快速繁殖方法进一步优选的技术方案，还包括炼苗移栽阶段：培养在三角瓶中的组培苗在自然光条件下炼苗7d后，先半打开封口膜1d，再完全开瓶炼苗2d；取出组培苗，用清水洗净组培苗根部残留的培养基，并用0.1mg/LNAA水溶液蘸根2～3min，然后移栽至木屑：草炭＝3：1的基质中，根部封土，浇透水，罩上塑料膜进行保温保湿；1周后，撤去塑料膜，并逐渐加大通风、增强光照，注意通风和温湿度的控制，湿度控制在75～90％，温度为20～28℃。1个月后成活率高达90％，完成竹叶石斛种子快速繁殖。
步骤(1)中，用75％酒精擦拭成熟果荚表面，然后用0.1wt％升汞处理10min，再用无菌水处理3-5次；再将成熟果荚浸入75％酒精中30s，取出用灭过菌的滤纸吸干果荚表面的水分，置于灭过菌的接种盘中，冷却后切开果荚，取出种子。
步骤(3)中，所述的原球茎分化培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)和NAA(萘乙酸)，其中6-BA的浓度为0.5～2.0mg/L，NAA的浓度为0.1～0.5mg/L，原球茎分化培养基的pH值为5.8-6.0；培养基配制完成后放入高温灭菌炉中121℃灭菌20min。
作为优选，所述的原球茎分化培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L。
步骤(4)中，所述的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入NAA，NAA的浓度为0.1～1.0mg/L；生根壮苗培养基的pH值为5.8～6.0；培养基配制完成后放入高温灭菌炉中121℃灭菌20min。
作为优选，所述的生根壮苗培养基中NAA的浓度为0.1～0.7mg/L；作为进一步优选，所述的生根壮苗培养基中NAA的浓度为0.7mg/L。
作为另一个替代方案，所述的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入IBA，IBA的浓度为0.1-1.0mg/L；生根壮苗培养基的pH值为5.8-6.0；培养基配制完成后放入高温灭菌炉中121℃灭菌20min。优选的，所述的IBA的浓度为0.1mg/L。
所述的组培苗的苗长为3cm以上，根数为2～3条，根系达1～2cm。
所述的1/2MS培养基的配置方法为，大量元素母液配制成50倍，其中CaCl2·2H2O需要单独配制置于另一小口瓶中；有机物质、微量元素及Fe盐母液分别配制成100倍，其中Fe盐母液需放置在棕色瓶中保存；蔗糖的质量浓度为30g/L，琼脂的质量浓度7.0g/L；培养基的pH 5.8-6.0，配制时根据配制的体积和浓缩的倍数量取所需量；配制完成后放入高温灭菌炉中121℃灭菌20min，放在4℃低温冰箱中保存，保存期限最长1个月左右，如果母液中出现絮状物质时，需重新配制。具体配置方式如表1所示：
表1 1/2MS培养基配置表
本发明的有益效果：
本发明提供的竹叶石斛种子快速繁殖方法，是利用植物组织培养技术，将竹叶石斛种子繁殖分为四个阶段，即预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分化培养阶段和生根壮苗培养阶段四个阶段，考虑到不同阶段培养上的差异性，后三个阶段采用了不同的培养基进行培养，1/2MS更好的满足了种子萌发、原球茎分化和生根壮苗阶段的营养需求，并且结合每个阶段植物组织的成长，在原球茎分化培养阶段和生根壮苗中另外加入物质，来有效调节植物组织的进一步生长。
本发明提供的竹叶石斛种子快速繁殖方法，在种子萌发阶段，种子萌发率高达95％，45d即可出现大量原球茎；在原球茎分化阶段，分化出小苗的时间控制在60d以内，最优可到50d；在生根壮苗培养阶段，45d左右组培苗长到3cm以上，根的条数为2条以上。从种子萌发到无菌苗生根，达到炼苗移栽要求，这一周期的时间在150d左右，大大加快了竹叶石斛种子繁殖速度，为竹叶石斛的快速生产提供了便利。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
一种竹叶石斛种子快速繁殖方法，包括预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分化培养阶段和生根壮苗培养阶段四个阶段，具体步骤如下：
步骤(1)、预处理阶段，步骤如下：用75％酒精擦拭成熟果荚表面，然后0.1％升汞处理10min，再用无菌水处理3次；将经前述处理的成熟果荚浸入75％酒精中30s，取出用灭过菌的滤纸吸干果荚表面的水分，置于灭过菌的接种盘中，冷却后切开果荚，取出种子；
步骤(2)、种子萌发培养阶段：将种子均匀接种于种子萌发培养基中萌发，所述的种子萌发培养基为1/2MS培养基；培养温度为25℃，光照强度为3000lx，光照时间为12h/d；培养45d后，出现大量直径1-3mm的原球茎；
步骤(3)、原球茎分化培养阶段：原球茎采用原球茎分化培养基进行培养，所述的原球茎分化培养基以1/2MS培养基为基础，加入6-BA和NAA，配制完成后放入高温灭菌炉中121℃灭菌20min，培养基的pH为5.8；设置5组培养基处理，考察不同浓度6-BA和NAA对分化培养的影响；
①6-BA 1.0mg/L，NAA 0.1mg/L；
②6-BA 1.0mg/L，NAA 0.5mg/L；
③6-BA 2.0mg/L，NAA 0.2mg/L；
④6-BA 2.0mg/L，NAA 0.5mg/L；
⑤6-BA 2.0mg/L；
⑥NAA 0.2mg/L；
⑦对照组，不加入6-BA和NAA；
培养温度25℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d；
实验证明，五组培养基处理都分化出小苗，获得小苗的时间为60d内，其中第③分化效果最佳，获得小苗的时间短且多，为50d，分化出小苗之后进入生根壮苗培养阶段。
表2不同浓度激素及配比下竹叶石斛的分化能力
步骤(4)、生根壮苗培养阶段：将经过原球茎分化培养阶段得到的小苗接种到生根壮苗培养基进行培养，所述的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入NAA或IBA，配制完成后放入高温灭菌炉中121℃灭菌20min，培养基的pH值为5.8；设置四组培养基处理：
①IBA 0.1mg/L；②NAA 0.7mg/L；③NAA 0.5mg/L、④NAA 0.1mg/L；
培养温度25℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d；经过45d培养即可炼苗移栽，完成竹叶石斛种子快速繁殖。竹叶石斛生根情况如表3所示。
表3竹叶石斛在不同培养基培养下生根情况
综上所述，本发明方法最优的原球茎分化培养基为以1/2MS培养基为基础，加入6-BA和NAA，6-BA浓度为2.0mg/L，NAA浓度为0.2mg/L，培养基的pH为5.8。最优的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入NAA，NAA的浓度为0.7mg/L，培养基的pH值为5.8。依次最优选的竹叶石斛种子快速繁殖方法，包括预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分化培养阶段和生根壮苗培养阶段；具体步骤如下：
步骤(1)、预处理阶段：竹叶石斛的成熟果荚表面用75％酒精擦拭成熟果荚表面，然后0.1％升汞处理10min，再用无菌水处理3次；将经前述处理的成熟果荚浸入75％酒精中30s，取出用灭过菌的滤纸吸干果荚表面的水分，置于灭过菌的接种盘中，冷却后切开果荚，取出种子；
步骤(2)、种子萌发培养阶段：将种子接种于种子萌发培养基中萌发，所述的种子萌发培养基为1/2MS培养基；培养温度为25℃，光照强度为3000lx，光照时间为12h/d；培养45d后，出现直径1-3mm的原球茎；
步骤(3)、原球茎分化培养阶段：原球茎采用原球茎分化培养基进行培养，所述的原球茎分化培养基以1/2MS培养基为基础，加入6-BA2.0mg/L和NAA0.2mg/L，培养温度25℃，光照强度3000lx，光照时间12h/d，培养50d使原球茎分化出竹叶石斛小苗；
步骤(4)、生根壮苗培养阶段：原球茎分化培养阶段得到的竹叶石斛小苗采用生根壮苗培养基进行培养，所述的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入NAA0.7mg/L，培养温度为25℃～27℃，光照强度2000lx～3000lx，光照时间12h/d，培养40d～50d得到苗长为3cm以上，根数为2～3条，根系达1～2cm的组培苗。
步骤(5)、炼苗移栽阶段：培养在三角瓶中的组培苗在自然光条件下炼苗7d后，先半打开封口膜1d，再完全开瓶炼苗2d；取出组培苗，用清水洗净组培苗根部残留的培养基，并用0.1mg/LNAA水溶液蘸根2～3min，然后移栽至木屑：草炭＝3：1的基质中，根部封土，浇透水，罩上塑料膜进行保温保湿；1周后，撤去塑料膜，并逐渐加大通风、增强光照，注意通风和温湿度的控制，湿度控制在75～90％，温度为20～28℃。1个月后成活率高达90％，完成竹叶石斛种子快速繁殖。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.一种竹叶石斛种子快速繁殖方法，其特征在于：包括预处理阶段、种子萌发培养阶段、原球茎分化培养阶段和生根壮苗培养阶段四个阶段，具体步骤如下：
步骤(1)、预处理阶段：竹叶石斛的成熟果荚表面依次用75％酒精、0.1wt％升汞消毒，再用无菌水处理，再将果荚浸入75％酒精，取出除去果荚表面水分，置于灭过菌的接种盘中，切开果荚，取出种子；
步骤(2)、种子萌发培养阶段：将种子接种于种子萌发培养基中萌发，培养温度为25℃～27℃，光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为12h/d；培养45d得到原球茎；所述的种子萌发培养基为1/2MS培养基；
步骤(3)、原球茎分化培养阶段：原球茎采用原球茎分化培养基进行培养，培养温度为25℃～27℃，光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为12h/d，培养50d使原球茎分化出竹叶石斛小苗；所述的原球茎分化培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入6-BA和NAA，其中6-BA的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L，原球茎分化培养基的pH值为5.8～6.0；
步骤(4)、生根壮苗培养阶段：原球茎分化培养阶段得到的竹叶石斛小苗采用生根壮苗培养基进行培养，培养温度为25℃～27℃，光照强度2000lx～3000lx，光照时间12h/d，培养40d～50d得到组培苗；所述的生根壮苗培养基以1/2MS培养基为基础培养基，加入NAA，NAA的浓度为0.7mg/L；生根壮苗培养基的pH值为5.8～6.0；
步骤(5)、炼苗移栽阶段：培养在三角瓶中的组培苗在自然光条件下炼苗7d后，先半打开封口膜1d，再完全开瓶炼苗2d；取出组培苗，用清水洗净组培苗根部残留的培养基，并用0.1mg/LNAA水溶液蘸根2～3min，然后移栽至木屑：草炭＝3：1的基质中，根部封土，浇透水，罩上塑料膜进行保温保湿；1周后，撤去塑料膜；湿度控制在75～90％，温度为20～28℃；
其中，所述的1/2MS培养基的配制方法为，大量元素母液配制成50倍，其中CaCl2·2H2O需要单独配制置于另一小口瓶中；有机物质、微量元素及Fe盐母液分别配制成100倍，其中Fe盐母液需放置在棕色瓶中保存；蔗糖的质量浓度为30g/L，琼脂的质量浓度7.0g/L；培养基的pH 5.8-6.0，配制时根据配制的体积和浓缩的倍数量取所需量；配制完成后放入高温灭菌炉中121℃灭菌20min，放在4℃低温冰箱中保存，保存期限最长1个月左右，如果母液中出现絮状物质时，需重新配制；具体配制方式如下表所示：
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