CN108260528A - 一种重唇石斛的组织培养育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重唇石斛的组织培养育苗方法，包括：外植体选择步骤、果荚消毒步骤、播种步骤、继代培养步骤、生根培养步骤、炼苗驯化步骤和移栽步骤。该重唇石斛的组织培养育苗方法能够有效的提高重唇石斛种苗的繁育速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现重唇石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种重唇石斛的组织培养育苗方法。
背景技术
重唇石斛(Dendrobium hercoglossum Rchb.f.)为兰科，主要分布在中国、泰国、老挝、越南、马来西亚。茎下垂，圆柱形或有时从基部上方逐渐变粗，具多节；总状花序通常数个，从落了叶的老茎上发出，常具2-3朵花，花开展；萼片和花瓣淡粉红色，唇瓣白色，分前后唇，前唇粉红色，较小，三角形，先端急尖，无毛；后唇半球形，前端密生短流苏，内面密生短毛，花期5-6月。
目前国内市场上的重唇石斛主要靠野生采挖，也有少数是人工栽培的。
但是，现有的重唇石斛人工栽培方法存在以下缺陷：一般通过分株繁殖和扦插的方式进行繁殖，繁殖种苗较少，繁殖率低，生长周期较长，正常生长环境下不经人工授粉结果的几率较小；由于果荚少，果粉细小，在自然环境下不易萌发生长等诸多因素的制约，野生的重唇石斛资源不断减少。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重唇石斛的组织培养育苗方法，能够有效的提高重唇石斛种苗的繁育速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现重唇石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种重唇石斛的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：在重唇石斛母本植株的开花期进行人工授粉，长出果荚后，继续培育，采摘成熟果荚并置于冰箱中保存，得到备用果荚；
果荚消毒步骤：取所述备用果荚，将种壳表面清洗干净，得到第一洁净果荚；将所述第一洁净果荚移至接种室中，进行酒精消毒和无菌水冲洗，得到第二洁净果荚；将所述第二洁净果荚用次氯酸钠消毒和无菌水冲洗，得到第三洁净果荚；将所述第三洁净果荚用升汞消毒和无菌水冲洗，得到第四洁净果荚；
播种步骤：解剖所述第四洁净果荚，将果粉撒到1/2MS培养基上，转移至培养室中培养，得到萌芽种子；
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于培养室中继续培养，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗；
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养，然后移到室外环境中进行驯化，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗3-5天，然后倒出，并用多菌灵浸泡苗根部，接着洗净阴干，移栽至基质中进行驯化。
进一步地，在所述外植体选择步骤中，重唇石斛母本植株的植株年龄为2-4年；长出果荚后继续培育3-4个月；将所述成熟果荚置于3-7℃的冰箱中保存1.5-2.5周。
进一步地，在所述果荚消毒步骤中，将所述备用果荚用洗洁精水或洗衣粉水浸泡15-20min，用毛刷刷干净种壳表面，并用自来水冲洗10-15min，得到第一洁净果荚；将所述第一洁净果荚放至洁净烧杯中，移至接种室，在无菌操作台上用75％医用酒精浸泡30-60s，浸泡期间用镊子不断搅拌，保证消毒彻底，接着用无菌水冲洗3-4次，得到第二洁净果荚；将所述第二洁净果荚用浓度为2％的次氯酸钠消毒外壳1-2min，接着用无菌水冲洗3-4次，得到第三洁净果荚；将所述第三洁净果荚用0.1％的升汞消毒6-8min，接着用无菌水冲洗4-5次，得到第四洁净果荚。
进一步地，在所述播种步骤中，用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述第四洁净果荚；所述培养室的温度为24-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间为10-12小时/天，培养25-30天。
进一步地，在所述播种步骤中，在所述1/2MS培养基中添加2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
进一步地，在所述继代培养步骤中，将所述萌芽种子置于光照强度为2000-2500Lx的培养室中继续培养，光照时间为10-12小时/天，生长40-50天，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养50-60天，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗。
进一步地，在所述继代培养步骤中，在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.8mg/L的6苄基腺嘌呤6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁和0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0。
进一步地，在所述生根培养步骤中，将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养85-95天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加1.8mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6苄基腺嘌呤6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁和0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
进一步地，在所述炼苗驯化步骤中，将所述生根瓶苗置于培养室中培养85-95天，然后将其移到室外环境中放置15-30天，获取驯化苗。
进一步地，在所述移栽步骤中，用800-1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部15-20min，然后用清水洗净并阴干。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明所提供的重唇石斛的组织培养育苗方法，能够有效的提高重唇石斛种苗的繁育速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现重唇石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
(2)本发明所提供的重唇石斛的组织培养育苗方法，繁殖时最重要的一个环节种子消毒彻底，消毒彻底才能保证种子播种后培养基不感染，在温度、光照等特定条件适合的情况下，重唇石斛种子育苗的发芽率大于85％，保证品种纯正。在播种和继代培养步骤时，培养基采用1/2MS培养基，通过和MS培养基对比，对种苗的萌发生长无影响，采用1/2MS培养基可以节约原料，在生产中每瓶培养基可节约1.0-1.5元的成本。
附图说明
图1为本发明的重唇石斛在播种阶段，种子的萌发图；
图2为本发明的重唇石斛在继代培养阶段的增殖图；
图3为本发明的重唇石斛在生根培养阶段的生根图；
图4为本发明的重唇石斛在驯化炼苗阶段的炼苗图；
图5为本发明的重唇石斛在移栽阶段的栽培图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种重唇石斛的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：在重唇石斛母本植株的开花期进行人工授粉，长出果荚后，继续培育，采摘成熟果荚并置于冰箱中保存，得到备用果荚；
果荚消毒步骤：取备用果荚，将种壳表面清洗干净，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚移至接种室中，进行酒精消毒和无菌水冲洗，得到第二洁净果荚；将第二洁净果荚用次氯酸钠消毒和无菌水冲洗，得到第三洁净果荚；将第三洁净果荚用升汞消毒和无菌水冲洗，得到第四洁净果荚；
播种步骤：解剖第四洁净果荚，将果粉撒到1/2MS培养基上，转移至培养室中培养，得到萌芽种子；
继代培养步骤：将萌芽种子置于培养室中继续培养，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将一级瓶苗转移至1/2MS培养基中，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗；
生根培养步骤：将二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；
炼苗驯化步骤：将生根瓶苗置于培养室中培养，然后移到室外环境中进行驯化，获取驯化苗；
移栽步骤：将生根培养基的瓶盖打开，继续放置驯化苗3-5天，然后倒出，并用多菌灵浸泡苗根部，接着洗净阴干，移栽至基质中进行驯化。
作为进一步的实施方式，在播种步骤中，在1/2MS培养基中添加2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0；在继代培养步骤中，在1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.8mg/L的6苄基腺嘌呤6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁和0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0；在生根培养步骤中，生根培养基为MS培养基，在MS培养基中添加1.8mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6苄基腺嘌呤6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁和0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
在播种时，培养基采用1/2MS培养基，只添加蔗糖和琼脂粉，继代培养时都采用1/2MS培养基，在培养基里添加一定浓度的植物生长激素，通过和MS培养基对比，对种苗的萌发生长无影响，采用1/2MS培养基可以节约原料，在生产中每瓶培养基可节约1.0-1.5元的成本。
作为进一步的实施方式，在炼苗驯化步骤中，驯化苗在培养室长到60天左右可以将其移至温度为22-28℃、湿度为45％-75％的大棚中进行炼苗30天，这样可以节约培养室日光灯和空调的耗电量，每月可节约1200-1500元左右的成本；然后将其移到室外环境中。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
实施例1：
一种重唇石斛的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：选择植株年龄为3年重唇石斛母本植株，在重唇石斛母本植株的开花期(6月中旬)进行人工授粉，长出果荚后，继续培育3个月，采摘成熟果荚(外种壳黄绿色，完好无裂)并置于5℃的冰箱中保存2周；
果荚消毒步骤：取备用果荚，用洗洁精水浸泡15min，用毛刷刷干净种壳表面，并用自来水冲洗12min，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚放至洁净烧杯中，移至接种室，在无菌操作台上用75％医用酒精浸泡50s，浸泡期间用镊子不断搅拌，保证消毒彻底，接着用无菌水冲洗4次，得到第二洁净果荚；将第二洁净果荚用浓度为2％的次氯酸钠消毒外壳2min，接着用无菌水冲洗3次，得到第三洁净果荚；将第三洁净果荚用0.1％的升汞消毒7min，接着用无菌水冲洗5次，得到第四洁净果荚；
播种步骤：用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖第四洁净果荚；将黄色果粉撒到1/2MS培养基上，在1/2MS培养基中添加2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0，然后转移至培养室中培养，培养室的温度为25℃，光照强度为2300Lx，光照时间为11小时/天，培养25天，得到萌芽种子；
继代培养步骤：将萌芽种子置于光照强度为2300Lx的培养室中继续培养，光照时间为11小时/天，生长45天，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将一级瓶苗转移至1/2MS培养基中，且在1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.8mg/L的6苄基腺嘌呤6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁和0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0；培养55天，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗；
生根培养步骤：将二级瓶苗转移至生根培养基中培养90天，获取生根瓶苗；生根培养基为MS培养基，在MS培养基中添加1.8mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6苄基腺嘌呤6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁和0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0；
炼苗驯化步骤：驯化苗在培养室长到60天左右可以将其移至温度为22-28℃、湿度为45％-75％的大棚中进行炼苗30天，生根良好，苗粗壮，然后将其移到室外环境(避免强光直射)中放置20天，让其适应外界环境，获取驯化苗；
移栽步骤：将生根培养基的瓶盖打开，继续放置驯化苗4天，然后倒出，并用900倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部17min，然后用清水洗净并阴干，移栽至基质中进行驯化。
实施例1的试验结果：在播种步骤中，重唇石斛种子育苗的发芽率为90％，并且，重唇石斛在果荚发芽(见图1)时，以及在继代培养(见图2)、生根培养(见图3)、炼苗驯化(见图4)和移栽(见图5)时，重唇石斛的长势均良好。
实施例2：
实施例2与实施例1的不同之处在于：
外植体选择步骤中：选择植株年龄为4年重唇石斛母本植株，长出果荚后，继续培育4个月，采摘成熟果荚置于7℃的冰箱中保存2.5周；
果荚消毒步骤中：取备用果荚，用洗衣粉水浸泡20min，用毛刷刷干净种壳表面，并用自来水冲洗15min，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚放至洁净烧杯中，移至接种室，在无菌操作台上用75％医用酒精浸泡30s，浸泡期间用镊子不断搅拌，保证消毒彻底，接着用无菌水冲洗3次，得到第二洁净果荚；将第二洁净果荚用浓度为2％的次氯酸钠消毒外壳1min，接着用无菌水冲洗4次，得到第三洁净果荚；将第三洁净果荚用0.1％的升汞消毒6min，接着用无菌水冲洗4次，得到第四洁净果荚；
播种步骤中：培养室的温度为24℃，光照强度为2500Lx，光照时间为12小时/天，培养26天；
继代培养步骤中：将萌芽种子置于光照强度为2000Lx的培养室中继续培养，光照时间为12小时/天，生长40天；
生根培养步骤中：将二级瓶苗转移至生根培养基中培养95天；
炼苗驯化步骤中：将生根瓶苗置于培养室中培养85天，然后将其移到室外环境中放置30天；
移栽步骤中：将生根培养基的瓶盖打开，继续放置驯化苗5天，然后倒出，并用800倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部15min；
其它与具体实施例1相同。
实施例2的试验结果：在播种步骤中，重唇石斛种子育苗的发芽率为89％，并且，重唇石斛在果荚发芽时，以及在继代培养、生根培养、炼苗驯化和移栽时，重唇石斛的长势均良好，每一个生长阶段的示意图与实施例1相似，在此不再赘述。
实施例3：
实施例3与实施例1的不同之处在于：
外植体选择步骤中：选择植株年龄为2年重唇石斛母本植株，长出果荚后，继续培育3.5个月，采摘成熟果荚置于3℃的冰箱中保存1.5周；
果荚消毒步骤中：取备用果荚，用洗衣粉水浸泡15min，用毛刷刷干净种壳表面，并用自来水冲洗10min，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚放至洁净烧杯中，移至接种室，在无菌操作台上用75％医用酒精浸泡60s，浸泡期间用镊子不断搅拌，保证消毒彻底，接着用无菌水冲洗3次，得到第二洁净果荚；将第二洁净果荚用浓度为2％的次氯酸钠消毒外壳1.5min，接着用无菌水冲洗4次，得到第三洁净果荚；将第三洁净果荚用0.1％的升汞消毒8min，接着用无菌水冲洗4次，得到第四洁净果荚；
播种步骤中：培养室的温度为26℃，光照强度为2000Lx，光照时间为10小时/天，培养30天；
继代培养步骤中：将萌芽种子置于光照强度为2500Lx的培养室中继续培养，光照时间为10小时/天，生长50天；
生根培养步骤中：将二级瓶苗转移至生根培养基中培养85天；
炼苗驯化步骤中：将生根瓶苗置于培养室中培养95天，然后将其移到室外环境中放置15天；
移栽步骤中：将生根培养基的瓶盖打开，继续放置驯化苗3天，然后倒出，并用1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部20min；
其它与具体实施例1相同。
实施例3试验结果：在播种步骤中，重唇石斛种子育苗的发芽率为88％，并且，重唇石斛在果荚发芽时，以及在继代培养、生根培养、炼苗驯化和移栽时，重唇石斛的长势均良好，每一个生长阶段的示意图与实施例1相似，在此不再赘述。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，包括：
外植体选择步骤：在重唇石斛母本植株的开花期进行人工授粉，长出果荚后，继续培育，采摘成熟果荚并置于冰箱中保存，得到备用果荚；
果荚消毒步骤：取所述备用果荚，将种壳表面清洗干净，得到第一洁净果荚；将所述第一洁净果荚移至接种室中，进行酒精消毒和无菌水冲洗，得到第二洁净果荚；将所述第二洁净果荚用次氯酸钠消毒和无菌水冲洗，得到第三洁净果荚；将所述第三洁净果荚用升汞消毒和无菌水冲洗，得到第四洁净果荚；
播种步骤：解剖所述第四洁净果荚，将果粉撒到1/2MS培养基上，转移至培养室中培养，得到萌芽种子；
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于培养室中继续培养，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗；
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养，然后移到室外环境中进行驯化，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗3-5天，然后倒出，并用多菌灵浸泡苗根部，接着洗净阴干，移栽至基质中进行驯化。
2.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述外植体选择步骤中，重唇石斛母本植株的植株年龄为2-4年；长出果荚后继续培育3-4个月；将所述成熟果荚置于3-7℃的冰箱中保存1.5-2.5周。
3.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述果荚消毒步骤中，将所述备用果荚用洗洁精水或洗衣粉水浸泡15-20min，用毛刷刷干净种壳表面，并用自来水冲洗10-15min，得到第一洁净果荚；将所述第一洁净果荚放至洁净烧杯中，移至接种室，在无菌操作台上用75％医用酒精浸泡30-60s，浸泡期间用镊子不断搅拌，保证消毒彻底，接着用无菌水冲洗3-4次，得到第二洁净果荚；将所述第二洁净果荚用浓度为2％的次氯酸钠消毒外壳1-2min，接着用无菌水冲洗3-4次，得到第三洁净果荚；将所述第三洁净果荚用0.1％的升汞消毒6-8min，接着用无菌水冲洗4-5次，得到第四洁净果荚。
4.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述播种步骤中，用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述第四洁净果荚；所述培养室的温度为24-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间为10-12小时/天，培养25-30天。
5.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述播种步骤中，在所述1/2MS培养基中添加2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
6.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述继代培养步骤中，将所述萌芽种子置于光照强度为2000-2500Lx的培养室中继续培养，光照时间为10-12小时/天，生长40-50天，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养50-60天，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗。
7.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述继代培养步骤中，在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.8mg/L的6苄基腺嘌呤6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁和0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0。
8.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述生根培养步骤中，将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养85-95天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加1.8mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6苄基腺嘌呤6-BA、3％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁和0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
9.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述炼苗驯化步骤中，将所述生根瓶苗置于培养室中培养85-95天，然后将其移到室外环境中放置15-30天，获取驯化苗。
10.如权利要求1所述的重唇石斛的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述移栽步骤中，用800-1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部15-20min，然后用清水洗净并阴干。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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