CN108207625A - 一种肿节石斛的组织培养方法 - Google Patents

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许冬瑾
严新
顾晓波
雷连海
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Kangmei Pharmaceutical (wenshan) Medicinal Material Planting Management Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种肿节石斛的组织培养方法，包括：外植体选择步骤：选择肿节石斛母本植株，取成熟果荚；预处理步骤：将成熟果荚消毒，待用；播种步骤：剖开成熟果荚取种子，将种子播撒于组培瓶中的种子培养基上，培养使其萌发；继代培养步骤：将萌发的种子培养使其成苗并长至其高度为5‑6cm；生根培养步骤：将经继代培养的苗移至生根培养基中培养；炼苗、驯化移栽步骤：将经生根培养的苗移至自然环境；然后打开组培瓶的瓶盖放置；取出苗，洗净并移栽至基质中进行驯化；该方法有效提高肿节石斛种苗的繁育效率，保证种苗质量，实现肿节石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。

Description

一种肿节石斛的组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种肿节石斛的组织培养方法，属于组织培养育苗技术领域。
背景技术
肿节石斛(Dendrobium pendulum)为兰科，主要分布在云南的普洱、红河、文山等地区；肿节石斛茎斜立或下垂，肉质状肥厚，圆柱形，不分枝，具多节，节肿大呈算盘珠子样。花大，白色，上部紫红色，开展，具有香气，干后蜡质状；花期为3-4月。
目前国内市场上的肿节石斛主要靠野生采挖，尚无人工栽培，一般通过分株繁殖和扦插的方式进行繁殖，繁殖种苗较少，繁殖率低，生长周期较长，正常生长环境下不经人工授粉结果的几率较小；由于果荚少，果粉细小，在自然环境下不易萌发生长等诸多因素的制约，野生的肿节石斛资源不断减少。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿节石斛的组织培养方法，该方法有效提高肿节石斛种苗的繁育效率，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现肿节石斛优质种子种苗的工厂化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种肿节石斛的组织培养方法，包括：
外植体选择步骤：选择2-4年生的肿节石斛母本植株，取成熟果荚，置于3-7℃的环境下保存；
预处理步骤：将成熟果荚以碱性溶液浸泡，并清理表面，然后以水冲洗；在无菌环境下以体积百分比浓度75％的酒精浸泡30-60s并同时搅拌，以水冲洗；用体积百分比浓度为2％的次氯酸钠消毒1-2min，以水冲洗；最后用体积百分比浓度0.1％的升汞消毒6-8min，以水冲洗，待用；
播种步骤：剖开已预处理的成熟果荚取种子，将种子播撒于组培瓶中的种子培养基上，无菌密封，在温度为24-26℃、光照强度为2000-2500Lx、光照时间为10-12h/d的条件下培养使其萌发；
继代培养步骤：将萌发的种子置于光照强度为2000-2500Lx、光照时间为10-12h/d的条件下培养使其成苗并长至2-3cm；将苗移至育苗培养基中培养，至其高度为5-6cm；
生根培养步骤：将经继代培养的苗移至生根培养基中培养；
炼苗、驯化移栽步骤：将经生根培养的苗移至室外放置15-30d；然后打开组培瓶的瓶盖放置3-5d；取出苗并用多菌灵溶液浸泡根部15-20min，洗净并移栽至基质中进行驯化。
进一步地，外植体选择步骤中，选择3年生的肿节石斛母本植株，在肿节石斛开花期间进行人工授粉，使其长出果荚，待果荚为外种壳黄绿色、完好无裂则是成熟果荚。
进一步地，预处理步骤中，用碱性溶液浸泡15-20min，并清理表面，以水冲洗10-15min。
进一步地，预处理步骤中，酒精浸泡后、次氯酸钠消毒和升汞消毒后，以无菌水冲洗。
进一步地，播种步骤中，以经消毒和冷却处理的解剖刀和镊子配合取出种子。
进一步地，所述种子培养基包括：
蔗糖体积百分比浓度2％
琼脂粉4.8g/L；
种子培养基的pH为5.8-6。
进一步地，所述播种步骤中，培养30-35d使其萌发。
进一步地，继代培养步骤中，育苗培养基包括：
进一步地，生根培养步骤中，所述生根培养基包括：
进一步地，用经稀释800-1000倍的多菌灵溶液浸泡根部。
本发明的配方设计原理如下：
本发明配方中，
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明预处理步骤对成熟果荚进行了全面彻底的消毒，保证种子播种后培养基不感染；
2、本发明播种步骤设定特定的培养条件，使得肿节石斛种子的发芽率大于85％，保证品种纯正；
3、本发明以种子培养基、育苗培养基和生根培养基配合植株在种子、育苗和生根阶段的生长需求，更加有针对性，提高植物生长效率；
4、本发明只需要150天左右即可从种子阶段至生根完成，植物离开培养室，大大缩短培养室的耗电量。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
具体实施方式所使用的培养基成分如下：
1)种子培养基：
蔗糖体积百分比浓度2％
琼脂粉4.8g/L；
种子培养基的pH为5.8-6。
2)育苗培养基：
3)生根培养基：
一种肿节石斛的组织培养方法，包括：
外植体选择步骤：选择2-4年生的肿节石斛母本植株，在肿节石斛开花期间进行人工授粉，培育3-4个月使其长出果荚，待果荚为外种壳黄绿色、完好无裂则是成熟果荚；取成熟果荚，置于3-7℃的环境下保存；
预处理步骤：将成熟果荚以碱性溶液浸泡15-20min，用毛刷清理表面，以水冲洗10-15min；在无菌环境下以体积百分比浓度75％的酒精浸泡30-60s并同时搅拌，以无菌水冲洗3-4次；用体积百分比浓度为2％的次氯酸钠消毒1-2min，以无菌水冲洗3-4次；最后用体积百分比浓度0.1％的升汞消毒6-8min，以无菌水冲洗4-5次，待用；
播种步骤：以经286℃高温消毒和冷却处理的解剖刀和镊子配合剖开已预处理的成熟果荚取种子，将种子播撒于组培瓶中的种子培养基上，无菌密封，在温度为24-26℃、光照强度为2000-2500Lx、光照时间为10-12h/d的条件下培养30-35d使其萌发；
继代培养步骤：将萌发的种子置于光照强度为2000-2500Lx、光照时间为10-12h/d的条件下培养40-50d使其成苗并长至高度为2-3c m；将苗移至育苗培养基中培养，至其高度为5-6cm；
生根培养步骤：将经继代培养的苗移至生根培养基中培养90d；
炼苗、驯化移栽步骤：将经生根培养的苗移至自然环境放置15-30d；然后打开组培瓶的瓶盖放置3-5d；取出苗并用经稀释800-1000倍的多菌灵溶液浸泡根部15-20min，洗净并移栽至基质中进行驯化。
其中，碱性溶液包括但不限于洗洁精、洗衣粉溶液。
实施例1：
一种肿节石斛的组织培养方法，包括：
外植体选择步骤：选择2年生的肿节石斛母本植株，在肿节石斛开花期间进行人工授粉，培育3-4个月使其长出果荚，待果荚为外种壳黄绿色、完好无裂则是成熟果荚；取成熟果荚，置于3-7℃的环境下保存；
预处理步骤：将成熟果荚以碱性溶液浸泡20min，用毛刷清理表面，以水冲洗15min；在无菌环境下以体积百分比浓度75％的酒精浸泡40s并同时搅拌，以无菌水冲洗3次；用体积百分比浓度为2％的次氯酸钠消毒2min，以无菌水冲洗3次；最后用体积百分比浓度0.1％的升汞消毒7min，以无菌水冲洗4次，待用；
播种步骤：以经286℃高温消毒和冷却处理的解剖刀和镊子配合剖开已预处理的成熟果荚取种子，将种子播撒于组培瓶中的种子培养基上，无菌密封，在温度为24℃、光照强度为2400Lx、光照时间为10h/d的条件下培养35d使其萌发；
继代培养步骤：将萌发的种子置于光照强度为2400Lx、光照时间为10h/d的条件下培养40-50d使其成苗并长至高度为2cm；将苗移至育苗培养基中培养，至其高度为6cm；
生根培养步骤：将经继代培养的苗移至生根培养基中培养90d；
炼苗、驯化移栽步骤：将经生根培养的苗移至自然环境放置20d；然后打开组培瓶的瓶盖放置3d；取出苗并用经稀释1000倍的多菌灵溶液浸泡根部16min，洗净并移栽至基质中进行驯化。
实施例2：
一种肿节石斛的组织培养方法，包括：
外植体选择步骤：选择3年生的肿节石斛母本植株，在肿节石斛开花期间进行人工授粉，培育3-4个月使其长出果荚，待果荚为外种壳黄绿色、完好无裂则是成熟果荚；取成熟果荚，置于3-7℃的环境下保存；
预处理步骤：将成熟果荚以碱性溶液浸泡15min，用毛刷清理表面，以水冲洗10min；在无菌环境下以体积百分比浓度75％的酒精浸泡60s并同时搅拌，以无菌水冲洗3次；用体积百分比浓度为2％的次氯酸钠消毒1min，以无菌水冲洗3次；最后用体积百分比浓度0.1％的升汞消毒6min，以无菌水冲洗4次，待用；
播种步骤：以经286℃高温消毒和冷却处理的解剖刀和镊子配合剖开已预处理的成熟果荚取种子，将种子播撒于组培瓶中的种子培养基上，无菌密封，在温度为25℃、光照强度为2100Lx、光照时间为10h/d的条件下培养30d使其萌发；
继代培养步骤：将萌发的种子置于光照强度为2100Lx、光照时间为10h/d的条件下培养40-50d使其成苗并长至高度为3cm；将苗移至育苗培养基中培养，至其高度为5cm；
生根培养步骤：将经继代培养的苗移至生根培养基中培养90d；
炼苗、驯化移栽步骤：将经生根培养的苗移至自然环境放置30d；然后打开组培瓶的瓶盖放置4d；取出苗并用经稀释800倍的多菌灵溶液浸泡根部18min，洗净并移栽至基质中进行驯化。
对比例1
预处理步骤中，将成熟果荚以碱性溶液浸泡20min，用毛刷清理表面，以水冲洗15min；在无菌环境下仅以体积百分比浓度75％的酒精浸泡40s并同时搅拌，以无菌水冲洗。其余步骤与实施例2相同。
对比例2
播种步骤中，在温度为20℃、光照强度为1500Lx、光照时间为12h/d的条件下培养使其萌发。其余步骤与实施例2相同。
对实施例1-2和对比例1-2的植物生长情况进行记录如表格1所示，其中萌发率为萌发的种子在全部播撒的种子中的比例；萌发时间为播种至萌发所需天数；5cm育苗时间为继代培养步骤中，从萌发的种子长至高度为5-6cm的苗所需天数；生根时间为生根培养步骤中，移至生根培养基开始至苗生根所需天数；
表格1实施例1-2和对比例1-2的生长情况
实施例1 实施例2 对比例1 对比例2
萌发率(％) 90 93 76 80
萌发时间(d) 35 30 33 38
5cm育苗(d) 58 52 62 69
生根时间(d) 60 48 76 71
从实施例与对比例比较可以看出，本发明在预处理步骤对种子消毒过程进行了改进，可大大提高萌发率，促进组织分化及生长，并结合对种子培养条件的设置，能够缩短种子的萌发时间，并在育苗和生根阶段均能体现出更快的生长速度，缩短育种流程。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肿节石斛的组织培养方法，其特征在于，包括：
外植体选择步骤：选择2-4年生的肿节石斛母本植株，取成熟果荚，置于3-7℃的环境下保存；
预处理步骤：将成熟果荚以碱性溶液浸泡，并清理表面，然后以水冲洗；在无菌环境下以体积百分比浓度75％的酒精浸泡30-60s并同时搅拌，以水冲洗；用体积百分比浓度为2％的次氯酸钠消毒1-2min，以水冲洗；最后用体积百分比浓度0.1％的升汞消毒6-8min，以水冲洗，待用；
播种步骤：剖开已预处理的成熟果荚取种子，将种子播撒于组培瓶中的种子培养基上，无菌密封，在温度为24-26℃、光照强度为2000-2500Lx、光照时间为10-12h/d的条件下培养使其萌发；
继代培养步骤：将萌发的种子置于光照强度为2000-2500Lx、光照时间为10-12h/d的条件下培养使其成苗并长至2-3cm；将苗移至育苗培养基中培养，至其高度为5-6cm；
生根培养步骤：将经继代培养的苗移至生根培养基中培养；
炼苗、驯化移栽步骤：将经生根培养的苗移至自然环境放置15-30d；然后打开组培瓶的瓶盖放置3-5d；取出苗并用多菌灵溶液浸泡根部15-20min，洗净并移栽至基质中进行驯化。
2.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，外植体选择步骤中，选择3年生的肿节石斛母本植株，在肿节石斛开花期间进行人工授粉，使其长出果荚，待果荚为外种壳黄绿色、完好无裂则是成熟果荚。
3.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，预处理步骤中，用碱性溶液浸泡15-20min，并清理表面，以水冲洗10-15min。
4.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，预处理步骤中，酒精浸泡后、次氯酸钠消毒和升汞消毒后，以无菌水冲洗。
5.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，播种步骤中，以经消毒和冷却处理的解剖刀和镊子配合取出种子。
6.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述种子培养基包括：
蔗糖体积百分比浓度2％
琼脂粉4.8g/L；
种子培养基的pH为5.8-6。
7.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述播种步骤中，培养30-35d使其萌发。
8.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，继代培养步骤中，育苗培养基包括：
育苗培养基的pH为6。
9.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，生根培养步骤中，所述生根培养基包括：
10.如权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，用经稀释800-1000倍的多菌灵溶液浸泡根部。
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