CN106212280B - 一种铁皮石斛微繁殖育种方法 - Google Patents

一种铁皮石斛微繁殖育种方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106212280B
CN106212280B CN201610598873.6A CN201610598873A CN106212280B CN 106212280 B CN106212280 B CN 106212280B CN 201610598873 A CN201610598873 A CN 201610598873A CN 106212280 B CN106212280 B CN 106212280B
Authority
CN
China
Prior art keywords
micropropagation
dendrobium candidum
culture
medium
protocorm
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610598873.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106212280A (zh
Inventor
王景雪
任海虹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanxi University
Original Assignee
Shanxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanxi University filed Critical Shanxi University
Priority to CN201610598873.6A priority Critical patent/CN106212280B/zh
Publication of CN106212280A publication Critical patent/CN106212280A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106212280B publication Critical patent/CN106212280B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

本发明提供了一种铁皮石斛微繁殖育种方法，是用铁皮石斛种子诱导产生原球茎,原球茎诱导产生类原球茎,类原球茎经过高效率的增殖，诱导产生再生芽苗,芽苗经过生根产生再生植株。待再生植株生长到5‑6片叶时，开始炼苗，经过一周的炼苗，小苗便可移栽出来，正常生长。本发明铁皮石斛原球茎经过微繁殖得到类原球茎，数量成倍增加，迅速扩大了未来种苗的数量，加快了铁皮石斛种苗的快速繁殖进程，显著增加了铁皮石斛种苗的繁殖效率，最高繁殖系数可以达到23，从而节省大量的人力、物力。本发明不仅为铁皮石斛提供了一个高效微繁殖育种方法，而且也可为兰科其它植物育种提供借鉴。

Description

一种铁皮石斛微繁殖育种方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养，具体属于一种铁皮石斛微繁殖育种方法。
背景技术
石斛是兰科(Orchidaceae)石斛属Dendrobium多年生草本植物，又名黄草，也称吊兰和金铰，是一种名贵稀有的中药材，素有“千金草”、“人间仙草”之称。医学经典《道藏》中称铁皮石斛为中华九大仙草之首，民间将其称为救命仙草(孙永玉等，药用石斛丰产栽培技术.2014)。铁皮石斛Dendrobium officinale又名黑节草，俗称铁皮枫斗，为我国特有的名贵药材。东汉末年的《神农本草经》中就有应用铁皮石斛记载，《本草纲目》、《中药大词典》等我国古代多部医学著作中都有铁皮石斛入药的记载。现代生物技术分析表明，石斛含有多糖、菲类、生物碱类、氨基酸类、酚类、芴酮类、倍半萜类、香豆素及挥发油等多种药用有效成分(张光浓等.中草药,2003,34:1005-1008)，多糖和生物碱是石斛兰中最重要的生物活性化合物(Yang et al.Acta Physiologiae Plantarum,2015,37:94)，具有滋阴清热、清音明目、益胃生津、止痛、提高免疫力等功效。野生石斛对生长条件要求苛刻，多分布于海拔几百到一千多米的山地森林中，是一种典型的附生植物，常附生悬崖石壁或大树上，自然繁殖力极低，生长缓慢。因其种子极小、无胚乳，需结合共生菌才能正常萌发，因此很难用实生苗栽培。传统的无性繁殖方式所需时间长、繁殖率极低，难以满足大面积栽培需求。加上铁皮石斛，属国家一级保护植物，具有极高的药用与经济价值，人们长期掠夺性的采挖，致使野生铁皮石斛资源日渐枯竭，野生石斛资源极其匮乏。为了解决这一日益突出的供需紧张的尖锐矛盾，石斛属植物的组培和快繁方法的研究一直受到人们的关注。利用组织培养技术对铁皮石斛进行快速繁殖，是目前解决生产种苗短缺的有效方法。目前铁皮石斛组培快繁的外植体主要有根尖(詹忠根.中草药,2006,37(06):928-931)、种子(杜刚等.中药材,2007,30(10):1207-1208)、茎段(吴菊等,浙江农业科学,2014(04):492-497)等，虽然国内外学者已在石斛快繁等方面做了大量的研究，但普遍存在成本高、幼苗弱、增殖率低等情况。因此,高效微繁殖育种方法对铁皮石斛规范化生产是非常重要的。
发明内容
本发明的目的是针对现有铁皮石斛组织培养存在的成本较高、幼苗弱、增殖率低的问题，提供一种铁皮石斛微繁殖育种方法。
本发明提供的一种铁皮石斛微繁殖育种方法，包括如下步骤：
1)将铁皮石斛种子接种在萌发培养基上诱导产生原球茎；
2)将原球茎接种于微繁殖培养基上培养，得到类原球茎；
3)将类原球茎转移到分化培养基中诱导芽苗分化，待分化的芽苗长到1cm-2cm左右时，转移到生根培养基诱导生根，最终长成完整的再生植株。
待再生植株生长到5-6片叶时，开始炼苗，经过一周的炼苗，小苗便可移栽出来，正常生长。
步骤1)至3)均在组织培养间室内完成，整个培养条件为：温度维持在25±2℃，光照周期为光照16h，黑暗8h。
所述的萌发培养基为基本培养基+6-BA 0.1-2mg/L+NAA-0.05-0.5mg/L。所述的基本培养基为MS培养基、1/2MS培养基、B5培养基、N6培养基、花宝一号或MS无机元素+B5有机物。
所述的微繁殖培养基为1/2MS培养基或MS培养基+6-BA 0.5-2.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L。
所述的分化培养基为1/2MS培养基或MS培养基+6-BA 2.0-5.0mg/L+NAA0.1-0.5mg/L。
所述的生根培养基为1/2MS培养基或MS培养基+NAA 0-0.5mg/L。
本发明所述的微繁殖育种方法不仅适用于铁皮石斛,还适用于兰科其它植物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：现有的铁皮石斛快速繁殖技术是用原球茎诱导分化成苗。本发明铁皮石斛原球茎经过微繁殖得到类原球茎,数量成倍增加,迅速扩大了未来种苗的数量，加快了铁皮石斛种苗的快速繁殖进程,显著增加了铁皮石斛种苗的繁殖效率,从而节省大量的人力、物力。
附图说明
图1MS培养基、1/2MS培养基、花宝一号培养基上原球茎增殖的情况
图2.铁皮石斛微繁殖过程图片，图中：A.果荚；B.种子诱导的原球茎；C.原球茎增殖；D.原球茎分化；E.幼苗生根；F.成苗
具体实施方式
实施例1
本实施例所用铁皮石斛种苗购于江苏丰收大地种业发展有限公司，种子来自于该铁皮石斛种苗经人工授粉后生长成的种子。
1.试验方法
(1)种子接种方法
取人工授粉后成熟的、尚未开裂的蒴果(图2中A)，用清水清洗蒴果表面，无菌条件下用75％的酒精消毒1min，再将蒴果放入0.1％的HgCl2溶液中消毒10min，用无菌水冲洗5次，置于无菌滤纸上吸干表面水，用解剖刀将蒴果切开，取种子接种于萌发培养基上。接种好的种子置于植物组培室中进行无菌培养。
(2)育种方法
铁皮石斛种子诱导产生原球茎:
在无菌条件下，将铁皮石斛种子播种在MS培养基+NAA 0.2mg/L+6-BA 1.0mg/L的培养基上，诱导铁皮石斛种子产生原球茎。45d后统计原球茎诱导率。
将从种子发育的原球茎，分别接种于如下微繁殖培养基：MS培养基添加6-BA0.5mg/L、NAA 0.5mg/L；1/2MS培养基添加6-BA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L；花宝一号添加6-BA0.5mg/L、NAA 0.5mg/L；诱导铁皮石斛原球茎微繁殖成类原球茎。每个处理重复3次。45d后统计增殖系数。对所得结果进行统计分析。
类原球茎分化成苗：
以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的生长调节剂6-BA(2.0mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L)和NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L)诱导类原球茎分化成苗。接种外植体时取生长情况基本相同、生长良好的原球茎进行接种。每个处理重复3次，45d后统计原球茎分化率，对所得结果进行统计分析。
诱导生根培养：
以1/2MS为基本培养基，分别加入NAA 0、0.2mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L进行瓶苗生根试验。类原球茎分化培养60d后，分别接种到上述不同培养基诱导生根，45d后统计结果。
实验中所有处理的外植体均在组培室内进行培养，培养温度(25±1)℃，全光谱LED灯照射，光照强度1500-2000lx，光照周期为16h光照，8h黑暗，空气湿度为65％-80％。
统计指标:
原球茎微增殖系数＝增殖后的有效原球茎总数/起始接种总数；
原球茎分化系数＝分化后的有效丛芽总数/起始原球茎总数。
2.实验结果
2.1铁皮石斛种子诱导原球茎
按上述1所述方法，用铁皮石斛的种子诱导原球茎。种子在诱导培养基上培养8-19d后，种子颜色逐渐变得鲜绿，并可见胚慢慢长大，呈球形；30-45d发育成原球茎。铁皮石斛种子诱导原球茎诱导率在95％以上，诱导出的原球茎颜色碧绿，颗粒状膨大，长势较好(图2中B)。
2.2铁皮石斛原球茎微繁殖
铁皮石斛原球茎微繁殖的基本培养基比较，以MS、1/2MS和花宝一号培养基为基本培养基，添加相同浓度的6-BA和NAA诱导原球茎微繁殖，结果见图1。比较三种基本培养基进行原球茎微繁殖时，相同植物生长调节剂浓度下，1/2MS基本培养基平均增殖系数最高,微繁殖的效果最好。
以1/2MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA和NAA诱导原球茎增殖，结果见表1。由表1结果可知，在9种植物生长调节剂组合处理中，当NAA 0.5mg/L时，6-BA浓度分别为1.0mg/L和0.5mg/L时，原球茎的增殖系数明显高于其它的植物生长调节剂组合处理，尤其是6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L，平均增殖系数为4.93，最大增殖系数可达23(图2中C)。
表1 1/2MS培养基上原球茎增殖情况
2.3类原球茎分化
以1/2MS为基本培养基，附加NAA，6-BA等进行不同植物生长调节剂,培养45d后统计类原球茎分化的情况，实验结果列于表2。当6-BA浓度为2-5mg/L，NAA0.1-0.5mg/L时，类原球茎均可以分化出芽苗，不同的植物生长调节剂浓度组合，类原球茎分化率不同(图2中D)。
表2不同植物生长调节剂对类原球茎分化的影响
2.4铁皮石斛芽苗生根
待上述分化得到的铁皮石斛幼苗生长到2-3厘米高时，将芽苗切下，移入加或不加NAA的1/2MS培养基中，诱导芽苗生根，45d后所有芽苗均生根，见表3。
表3不同植物生长调节剂配方对铁皮石斛生根的影响

Claims (3)

1.一种铁皮石斛微繁殖育种方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将铁皮石斛种子接种在萌发培养基上诱导产生原球茎；
2)将原球茎接种于微繁殖培养基上培养，得到类原球茎；
3)将类原球茎转移到分化培养基中诱导芽苗分化，待分化的芽苗长到1cm-2cm左右时，转移到生根培养基诱导生根，最终长成完整植株；
所述的萌发培养基为基本培养基+6-BA 0.1-2mg/L+NAA 0.05-0.5mg/L。
所述的微繁殖培养基为1/2MS培养基或MS培养基+6-BA 0.5-2.0mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L；
所述的分化培养基为1/2MS培养基或MS培养基+6-BA 2.0-5.0mg/L+NAA0.1-0.5mg/L；
所述的生根培养基为1/2MS培养基或MS培养基+NAA 0-0.5mg/L。
2.如权利要求1所述的一种铁皮石斛微繁殖育种方法，其特征在于步骤1)至3)均在组织培养间室内完成，整个培养条件为：温度维持在25±2℃，光照周期为光照16h，黑暗8h。
3.如权利要求1所述的一种铁皮石斛微繁殖育种方法，其特征在于所述的基本培养基为MS培养基、1/2MS培养基、B5培养基、N6培养基、花宝一号或MS无机元素+B5有机物。
CN201610598873.6A 2016-07-27 2016-07-27 一种铁皮石斛微繁殖育种方法 Active CN106212280B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610598873.6A CN106212280B (zh) 2016-07-27 2016-07-27 一种铁皮石斛微繁殖育种方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610598873.6A CN106212280B (zh) 2016-07-27 2016-07-27 一种铁皮石斛微繁殖育种方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106212280A CN106212280A (zh) 2016-12-14
CN106212280B true CN106212280B (zh) 2018-06-29

Family

ID=57533604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610598873.6A Active CN106212280B (zh) 2016-07-27 2016-07-27 一种铁皮石斛微繁殖育种方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106212280B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107926702A (zh) * 2017-11-29 2018-04-20 大连市金贵缘科技开发有限公司 一种铁皮石斛原球茎快速增殖固液混合培养方法
CN108207625A (zh) * 2017-12-27 2018-06-29 康美药业（文山）药材种植管理有限公司 一种肿节石斛的组织培养方法
CN109392710A (zh) * 2018-11-14 2019-03-01 上海摩天农业科技有限公司 一种石斛的育苗方法
CN109744147A (zh) * 2018-12-04 2019-05-14 万龙凯 石斛的有性快速繁殖及组培相结合的开放性培育方法
CN110583490A (zh) * 2019-02-25 2019-12-20 十堰市农业科学院 一种促进红秆软脚铁皮石斛原球茎快速诱导的方法
CN110679484A (zh) * 2019-10-23 2020-01-14 李晓晖 一种米斛种苗培育技术

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105638477A (zh) * 2016-01-27 2016-06-08 南京农业大学 一种竹叶石斛种子快速繁殖方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105638477A (zh) * 2016-01-27 2016-06-08 南京农业大学 一种竹叶石斛种子快速繁殖方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
铁皮石斛的种子培养;谢启鑫等;《北方园艺》;20101231;摘要，第90页第1.1节至第91页第2.4节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106212280A (zh) 2016-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106212280B (zh) 一种铁皮石斛微繁殖育种方法
Hussain et al. Tissue culture of black pepper (Piper nigrum L.) in Pakistan
CN106561456B (zh) 一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法
CN106332782B (zh) 独蒜兰组织培养一步成苗培养方法
CN102440192B (zh) 芍药高频胚性愈伤组织分化的培养基及培养方法
CN105766654B (zh) 一种南川木菠萝组织培养方法
CN117296711B (zh) 一种仙茅多倍体育苗方法
CN104160962B (zh) 同源四倍体七叶一枝花植株的培育方法
Zahara et al. A Review: The effect of plant growth regulators on micropropagation of Aglaonema sp.
CN107629967A (zh) 用于天麻种植的萌发菌的液体培养基和天麻种植方法
CN104996304B (zh) 一种通过芍药叶片诱导愈伤组织分化的培养基及培养方法
CN104145814A (zh) 一种高盆樱桃（原变种）茎段组织培养获得再生植株的方法
CN103798044B (zh) 甘薯近缘野生种抗茎线虫病抗性鉴定方法
CN106165648B (zh) 一种紫荆组培培养基及培养方法
CN105284612A (zh) 一种快速繁殖茅苍术试管苗的方法
CN102124953B (zh) 通过芽孢快速繁殖老鹰茶树试管苗的方法
CN107079816A (zh) 一种甘蔗新品种粤糖03‑373的组培快繁方法
CN105532452A (zh) 一种欧亚瑞香种子诱导及快速繁殖的方法
CN110024685A (zh) 一种水稻稻曲病抗病材料的选育方法
CN107155879B (zh) 一种黑松无菌快速繁殖方法
Tikendra et al. Dendrobium sp.: in vitro propagation of genetically stable plants and ethno-medicinal uses
CN103270860A (zh) 一种铁皮石斛的种植方法
CN106718846A (zh) 一种兰科植物的育种方法
CN102657089A (zh) 一种榉树无菌播种方法
CN103583367B (zh) 三倍体丹参脱毒新品种的快速选育方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant