CN106718846A - 一种兰科植物的育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种兰科植物的育种方法，包括步骤：依据选育目标取不同的兰科植物品种进行杂交或自交，收获实生种子；将收获到的实生种子在无菌条件下播种在种子萌发培养基上，诱导实生种子产生原球茎，原球茎通过继代培养诱导产生类原球茎；类原球茎经过增殖培养，迅速扩大类原球茎种子量；利用同工酶技术或者分子标记技术，对类原球茎进行基因型鉴定；根据鉴定结果，选择符合育种目标的类原球茎作为外植体，诱导其分化产生再生植株。本发明的育种方法可大大缩短兰科植物新品种选育的时间。

Description

一种兰科植物的育种方法
技术领域
本发明涉及植物育种技术，具体属于一种兰科植物的育种方法。
背景技术
兰科植物是单子叶第一大植物，其中许多极具价值的高档花卉和珍贵药用植物。君子兰、蕙兰等中国兰自古以来就是文人心中高风亮节的代表花朵。兰花以其强韧的生命力和环境适应力，优美雅丽的花朵，被赋予高雅脱俗的人文意义。蝴蝶兰(Phalaenopsis)又称蝶兰,是兰科植物中栽培最广泛、最普及的种类之一。由于，花色艳丽丰富，花形别致，花大，开花期长(2-3个月)，深受人们的喜爱,享有“花中皇后”的美誉。素有“九大仙草之首”之称的铁皮石斛更是名贵的中药材。具有滋阴养胃，抗癌抑菌，降糖降压等重要功效。
虽然兰科植物具有重要的经济价值，但是由于兰科植物的种子无胚乳，自然条件下，萌发率极低或者不能萌发，加之兰科植物生长发育慢，新品种选育需要经过漫长的时间，因此，兰科植物普遍存在着品种结构单调，优种繁育周期长等弊病。因此，高效的育种、繁殖技术对兰科植物产业的高速发展具有重要意义，同时也是育种行业迫切需要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种兰科植物的育种方法。
本发明提供的一种兰科植物的育种方法，包括如下步骤：
1)根据育种目标选取兰科植物亲本材料进行栽植培养，在盛花期进行人工授粉，授粉后100-150天采收果荚；
果荚经消毒后，在无菌条件下播种于种子萌发培养基上，置于25±2℃下培养，光照时间16小时/天，光照强度2000±100lx；50天后，诱导出原球茎；
所述的萌发培养基为：花宝1号2-4g/L+6-BA1-5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭1-2g/L；
2)将诱导出的原球茎转入类原球茎诱导培养基上诱导产生类原球茎及增殖培养；培养条件：25±2℃，光照时间16小时/天，光照强度2000±100lx；
所述的类原球茎诱导培养基为：花宝1号2-4g/+6-BA 1.0-6.0mg/L+NAA0.1-0.8mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭1-2g/L；
3)类原球茎基因型鉴定：利用过氧化物酶(POD)同工酶对类原球茎的进行鉴定；根据POD同工酶条带的位置和颜色深浅确定其与亲本的关系，对获得的类原球茎个体进行筛选；
4)将入选的类原球茎，无菌条件下，接种于花宝1号2-4g/L+6-BA 1.0-4.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭1-2g/L，pH为5.4-5.8的分化培养基中培养；培养条件：温度为25.0±2℃，光照时间16小时/天，光照强度2000±100lx；培养30天后分化出芽和根；
5)将分化出的兰科植物幼苗培养于壮苗培养基中生长至幼苗长出3-5片叶，移入温室生长至开花；
所述的壮苗培养基为：花宝1号2-4g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭1-2.0g/L，pH为5.4-5.8；培养条件：温度为25.0±2℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000±100lx，空气湿度为65％-80％。
与目前常规的兰科植物杂交育种技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
1)本发明利用现代生化技术或分子生物学技术，对杂交一代进行快速鉴定，不需要先选育自交系，节省了育种的时间。
2)本发明利用原球茎诱导产生类原球茎并诱导类原球茎进行增殖，大大扩大了种子的数量，又节省了种子繁育时间。
3)本发明不仅为兰科植物提供了一个新的育种技术，而且也为其他难以进行正常有性繁殖的植物种提供了可以借鉴得育种技术。
附图说明
图1蝴蝶兰品种HCH(左)和品种HOO7(右)，为本实验蝴蝶兰杂交的母本和父本。
图2蝴蝶兰原球茎发育图，其中：A播种45天的蝴蝶兰原球茎；B蝴蝶兰原球茎接种于增殖培养基30d后的生长情况；C类蝴蝶兰原球茎接种于分化培养基60天后的生长情况
图3蝴蝶兰类原球茎POD同工酶分析，其中：1.母本；5.父本；2-4.为不同的杂交后代。
图4铁皮石斛原球茎发育图，其中：A播种50天的铁皮石斛原球茎；B铁皮石斛原球茎增殖；C铁皮石斛再生苗
图5铁皮石斛类原球茎POD同工酶分析，其中：1.为自交亲本；2-为自交后代。
具体实施方式
实施例1蝴蝶兰杂交育种
(1)蝴蝶兰杂交及杂交种子无菌播种方法
在盛花期取蝴蝶兰HCH和HOO7(见图1)的花粉进行杂交。杂交花朵注意保湿，仔细管理，直到发育为成熟的果荚。
取发育到120天尚未开裂的蝴蝶兰果荚，在超净工作台中用0.1％的HgCl2溶液中处理8-10min，用无菌水冲洗5-8次。在超净台上用解剖刀将果荚纵剖，将果荚中的种子取出接种到种子萌发培养基：花宝1号3.5g/L+6-BA 3mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭2g/L上培养室中培养。培养条件为：光照时间16小时/天，温度为25.0±2℃，光照强度为2000lx。蝴蝶兰种子播种在种子萌发培养基上14天后开始膨胀，呈白色；30天后种子开始萌发，少量胚出现，呈淡黄色；50天后种子萌发完成，胚大量出现，呈黄绿色；种子萌发率达到65.04％，见图2中A。
(2)类原球茎诱导及增殖
种子播种后50天后，将诱导出的原球茎转入类原球茎诱导培养基上诱导产生类原球茎并进行类原球茎增殖培养。培养条件同上。
类原球茎的诱导培养基为：花宝1号3.5g/L+6-BA5.0mg/L+NAA0.7mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2.0g/L，pH为5.4-5.8；蝴蝶兰类原球茎诱导和增殖效果较好，增殖系数达到17.33，见图2中B。
(3)类原球茎过氧化物酶同工酶鉴定
取类原球茎0.5g加入液氮研磨成细粉，加入1ml样品提取液(Tis-HCl pH7.0)，冰上放置30分钟，4℃条件下12000r/min离心15分钟。取上清得到POD同工酶粗提液。每个样品取10ul酶粗提液上样，用SDS-PAGE胶进行检测。POD同工酶采用醋酸联苯胺染色法染色。如图3所示，样品2，3的带型与亲本1，5一致，表明样品2，3具有与亲本相同的基因型，为本实验入选的材料。
(4)类原球茎分化
将入选的类原球茎细胞块，在超净工作台中小心切割开，接种于分化培养基中诱导类原球茎分化成再生植株。
分化培养基为：花宝1号3.5g/L+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭2g/L；蝴蝶兰原球茎分化率可以达到96.67％。培养条件为：光照时间16小时/天，温度为25.0±2℃，光照强度为2000lx，。
(5)壮苗培养
分化出的蝴蝶兰幼苗培养在壮苗培养基，即花宝1号3.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2.0g/L，pH为5.4-5.8的壮苗培养基中培养60天后，将小苗转移到温室继续培养，直至成为完整的成品花。
温室条件为：光照时间16小时/天，温度为25.0±2℃，光照强度为2000lx，空气湿度为65％-75％。
实施例2铁皮石斛自交后代的选择
(1)铁皮石斛实生种子萌发
在铁皮石斛盛花期取同株不同花的花粉自交授粉，得到果荚。
取发育成熟尚未开裂的果荚，在超净工作台中用0.1％的HgCl2溶液中处理8-10分钟，用无菌水冲洗5-8次。在超净台上用解剖刀将果荚纵剖，将果荚中的种子接种于花宝1号3.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭2g/L中培养室中进行培养。培养条件为：温度25.0±2℃，光照强度为2000lx。在此条件下，铁皮石斛的种子萌发率达到80％，见图4中A。
(2)类原球茎诱导
种子播种后60天左右，将诱导出的原球茎转入类原球茎诱导培养基上诱导产生类原球茎并进行类原球茎增殖培养。培养条件同上。
铁皮石斛类原球茎诱导的最佳培养基为：花宝1号3.5g/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2.0g/L，pH为5.4-5.8。类原球茎诱导率达93％，平均增殖系数为4.93，最大增殖系数可达23见图4中B。
(3)类原球茎基因型鉴定(过氧化物酶同工酶鉴定)
采用与上述实施例1中蝴蝶兰相同的POD同工酶鉴定方法对自交后代进行鉴定，结果如图5所示。从图中可以看出2，3，7，8的带型与亲本1完全一致，表明2，3，7，8具有与亲本相同的基因型，为本实验入选的材料。
(4)类原球茎分化及生根培养
将入选的类原球茎细胞块，在超净工作台中小心切割开，接种于花宝1号3.5g/L+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭2g/L，pH为5.4-5.8的分化培养基中，诱导类原球茎分化出芽苗。接种后30天芽苗开始分化，45天时分化率达到95％，生根率达85％。
(5)壮苗培养
将分化出的铁皮石斛幼苗培养于花宝1号3.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭2.0g/L，pH为5.4-5.8的壮苗培养基中。培养条件为：温度25.0±2℃，光照强度为2000lx。经过70天壮苗培养后，将小苗转移到网室中生长。见图4中C。

Claims (5)

1.一种兰科植物的育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)根据育种目标选取兰科植物亲本材料进行栽植培养，在盛花期进行人工授粉，授粉后100-150天采收果荚；
果荚经消毒后，在无菌条件下播种于种子萌发培养基上，置于25±2℃下培养，光照时间16小时/天，光照强度2000±100lx；50天后，诱导出原球茎；
2)将诱导出的原球茎转入类原球茎诱导培养基上诱导产生类原球茎及增殖培养；培养条件：25±2℃，光照时间16小时/天，光照强度2000±100lx；
3)类原球茎基因型鉴定：利用过氧化物酶(POD)同工酶对类原球茎的后代进行鉴定；根据POD同工酶条带的位置和颜色深浅确定其与亲本的关系，对获得的类原球茎个体进行筛选；
4)将入选的类原球茎，无菌条件下，接种于分化培养基中培养；培养条件：温度为25.0±2℃，光照时间16小时/天，光照强度2000±100lx；培养30天后分化出芽和根；
5)将分化出的兰科植物幼苗培养于壮苗培养基中生长至幼苗长出3-5片叶，移入温室生长至开花；培养条件：温度为25.0±2℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000±100lx，空气湿度为65％-80％。
2.如权利要求1所述的一种兰科植物的育种方法，其特征在于，所述的萌发培养基为：花宝1号2-4g/L+6-BA1-5mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭1-2g/L。
3.如权利要求1所述的一种兰科植物的育种方法，其特征在于，所述的类原球茎诱导培养基为：花宝1号2-4g/L+6-BA 1.0-6.0mg/L+NAA0.1-0.8mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭1-2g/L。
4.如权利要求1所述的一种兰科植物的育种方法，其特征在于，所述的分化培养基为：花宝1号2-4g/L+6-BA 1.0-4.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+活性炭1-2g/L，pH为5.4-5.8。
5.如权利要求1所述的一种兰科植物的育种方法，其特征在于，所述的壮苗培养基为：花宝1号2-4g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L+活性炭1-2.0g/L，pH为5.4-5.8。
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CN108243944A (zh) * 2018-01-24 2018-07-06 青州市亚泰农业科技有限公司 一种蝴蝶兰快速育种方法及优质品种组织培养繁殖方法
CN109122301A (zh) * 2018-10-19 2019-01-04 中国科学院华南植物园 一种五唇兰与火焰兰属间杂交培育兰花新品种的方法

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