CN100463600C - 一种高效香蕉离体快繁新方法 - Google Patents
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Abstract
技术领域：本发明涉及利用巴西香蕉未成熟雄花为外植体，离体快速繁殖优质种苗的方法。采取断蕾期新鲜香蕉雄花，剥取未成熟部分切成薄片，进行组织培养，每片外植体繁殖系数达到25-30，大大降低了组培的继代数和生产周期，得到高效优质的组培苗。本技术由于在取材上的创新和组培技术含量的升高，降低了生产周期和继代数，解决了目前香蕉组培技术中生产周期长、生产成本高、继代数高、取材有带病毒几个关键问题。该技术将促进香蕉优良种苗的快速繁殖和生产，加速香蕉良种推广速度，实现香蕉产业的稳步和快速升级。
Description
[技术领域]
本发明涉及利用巴西香蕉未成熟雄花为外植体离体进行快速繁殖优质种苗的方法。
[背景技术]
广义的香蕉包括香蕉(Banana)和大蕉(Plantain)两大类。香蕉和大蕉属于芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)(华南农业大学主编.果树栽培学各论(南方本).农业出版社.1993:104)。几乎所有食用蕉都是由原始野生尖叶蕉(Musa acuminata Colla)和长梗蕉(Musa balbisiana Colla)自交或杂交后代进化而成的。鲜食香蕉大多为三倍体AAA，即它们的染色体都来自尖叶蕉，是尖叶蕉自交或体细胞突变的后代。大蕉也是三倍体，染色体组成为AAB或ABB，即它们的染色体来自尖叶蕉和长梗蕉。除三倍体以外，还有二倍体AA、AB和四倍体AAAA、BBBB，但种类稀少(Samson JA.Tropical Fruits.London:longman，1980:119)。栽培香蕉(Musa spp.)为单性三倍体(AAA、AAB、ABB)，具有高度不育性。
香蕉为多年生常绿大型草本单子叶植物，地下茎为一粗大球茎，根、叶、花及繁殖用的吸芽由此长出。最初由中央圆柱组织上的顶芽萌发，不断抽生叶片，叶柄上伸，叶鞘紧接为假茎，假茎下面形成球茎，每片叶鞘基部潜伏芽能长成吸芽，吸芽和母体球茎组成蕉丛。香蕉植株生长发育到一定阶段，假茎生长点停止抽叶而进行生殖分化，抽出穗状花序。
栽培香蕉多为三倍体，单性结实。一串果穗有果4～18梳，每梳有果指7～35条，梳果由上逐渐变小，蕉果自开花到收获需65～170天，高温季节60～90天可收获，低温季节则需120天以上(农业部发展南亚热带作物办公室主编.中国热带亚热带果树.中国农业出版社.1998:49-50)。
香蕉在世界热带水果和中国热带水果生产中都占有重要的经济地位。据统计，世界香蕉产量在水果中居第3位，仅次于葡萄和柑橘。据FAO统计，2005年全世界120多个国家(地区)种植香蕉，收获面积为443.95万公顷，总产量达7246.46万吨，2004年世界香蕉出口1594万吨，出口值接近50亿美元，是世界贸易量最大的水果。中国2004年全国香蕉种植面积约为28.5万公顷，产量达629万吨，产值为94亿元，2005年全国香蕉种植面积约为27.4万公顷，产量达639万吨，产值超过100亿元，从业人员达110多万，香蕉产业已成为我国南亚热带地区农业支柱性产业，在热区社会和经济发展中占有非常重要的地位。
传统的香蕉繁殖有两种方法，一种是直接利用母株生长的吸芽进行繁殖，但是该方法由于产生的吸芽速度慢，繁殖系数低，影响母株的生长，不适应现代大规模的商品生产已经逐渐淘汰，目前只有少数农户家庭种植还在采用；另一种是利用吸芽球茎人工进行繁芽的组织培养技术，该技术是目前香蕉生产中种苗繁殖的主要手段。该技术是我国科研工作者在上世纪80年代后期由于反季节香蕉栽培技术的开发，市场对优质香蕉种苗需求量增大，为满足市场对优质种苗需要而研发的。该技术的应用对我国香蕉产业的快速发展起到了极大的推进作用，实现了在较短时间内将优良品种大面积推广，使大规模商品化香蕉生产变成现实。但经过近20年的应用，目前已发现该方法在生产中存在一些不足，主要存在的问题有：
1 继代数高。香蕉传统的繁芽组培技术由于繁殖系数低，目前只能达到2.5—3.0左右，所以获得大量种苗需要多次继代培养，一般都达到继代培养10—12代，如此才能获得较高的经济效益。而组培苗随着继代数的增高，种苗质量逐渐下降且变异率升高，对病虫害抵抗能力降低。但生产中生产者为了追求高的经济利益及降低成本，往往通过继代数量增加来增加种苗产量，因此造成大量劣质种苗进入市场，损害蕉农利益，影响香蕉产业发展。
2 生产周期长。目前的香蕉芽繁的组培方法从采集吸芽到12代的商品苗大概需要10—11个月的时间，生产周期长。
3 易带病毒。现有香蕉种苗生产采用的材料为香蕉球茎芽，球茎生长于地下土壤中，容易感染多种病菌，虽然经过严格筛选消毒，但仍然存在材料带毒的危险。为保证生产种苗质量，每年所生产的种苗要经过病毒检测，增加了种苗生产成本。
4 造成母株伤害。目前市场上商品化的香蕉组培苗主要采样时间集中在每年的3—5月，此时的香蕉母株正处于高速生长期，种苗繁殖材料的采集对香蕉母株会带来一定的损伤，影响母株的产量和果实品质。
5 生产成本高。香蕉组培苗生产是一项劳动力密集的产业，繁殖系数低，生产周期长，工厂劳动力生产成本占到整个生产成本的70％以上，劳动力生产成本过高。一般生产12代组培苗需要10—11月的时间，消耗大量的人力和和占用大量的生产资料，增加了生产成本。
以上香蕉组培生产方式中存在的不足和缺点，已经开始制约香蕉产业快速健康的发展，同时也制约了香蕉产业的进一步升级，具体表现有四个方面：第一：生产周期长，市场反应慢，不能灵活应对市场需求。第二：继代数高引发的种苗品质下降，带来生产上的不良连锁反应。第三：取材方法的缺陷导致了香蕉组培苗不能完全脱毒，而且取材当年对母株可能产生伤害而导致产量下降和果实品质降低。第四：生产成本高。这种组培方式需要消耗大量人力物力，生产成本高，效率低。因此，开发一种新的组培技术来克服以上缺点，保证香蕉产业长久健康发展已成为香蕉生产亟待解决的问题之一。而香蕉未成熟雄花组织培养技术将可弥补球茎组培苗繁殖方法的缺陷，为香蕉生产提供高质量种苗提供保障。
香蕉未成熟雄花组织培养技术有以下六个方面的优势：
1 繁殖系数高，生产周期短。香蕉花蕾为无限花序，其顶端分生组织具有强大的原基系统，我们自主开发的香蕉未成熟雄花组培技术，繁殖系数可以达到25—30的水平。利用香蕉未成熟雄花切片，每株雄花可以切片20—24片，每一个雄花切片经过诱导愈伤分化成芽25—30个芽，繁殖系数高。单个香蕉未成熟雄花通过切片诱导分化一代就可以产生500-720株香蕉苗。因此生产相同数量的组培苗生产周期比芽繁芽方法相比缩短了3—4个月，生产周期大大缩短。
2 继代数低。由于繁殖系数高，所以生产相同数量的组培苗，与传统组培技术相比，香蕉未成熟雄花组织培养技术只需要继代2—4代，大大降低了组培的继代数，因此有效的防止了因为继代数高而出现的芽纤弱，生长势不均匀，幼芽变白，严重缺绿，缺乏生机和活力，生长速度减慢，增殖率降低，变异率高等问题。香蕉未成熟组培苗继代数低，出苗整齐健壮，抗病性强，生长速度快，变异率低，生根快。相对于传统的组培技术有较大的优势。
3 不带病毒。该组织培养技术采用材料是香蕉未成熟雄花的生长点，是高速生长的部位，且被苞片天然严密包被，在自然条件下不带病毒。
4 取材更科学、简单，不伤害取材母株的正常生长。与吸芽相比，花序组织具有取材方便、灭菌容易、节省种源等特点，是减少接种初期污染，提高成功率的良好外植体。
5 取材和提高产量相结合。在实际取材过程中，利用香蕉生产中断蕾所产生的花蕾，不仅可以获得繁殖材料，而且还可提高取样母株的产量和果实品质，实现了取材和高产技术的完美结合。
6 花序携带方便，有利于国际种质交流，对培育和引进早熟、高产、优质名贵的稀有品种，特别是引进外国的优良品种尤其有实际应用价值。
[发明内容]
一种高效香蕉繁殖新方法的发明内容包括，外植体的选取、处理、诱导愈伤组织培养基的配方、诱导愈伤组织的培养方法、诱导分化培养基的配方、诱导分化的培养方法以及组培苗催根、驯化及移栽等内容。
1.外植体的选取
选取香蕉断蕾期的新鲜香蕉雄花
2.外植体的处理
逐步剥除香蕉雄花苞片，至到雄花长度为9—10厘米时转人超净工作台，在超净工作台中继续剥除香蕉雄花苞片，至到雄花长度为2.0-2.5厘米，此部位的香蕉雄花由于还没有发育成熟，因此称未成熟香蕉雄花。将此部位的未成熟香蕉雄花纵向平均切为两半，再横切厚度为1.2毫米的薄片。
3.香蕉未成熟雄花切片诱导愈伤组织培养
将未成熟雄花切片接种于MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.3的固体培养基上，25-26℃，黑暗培养。视切片的褐化程度，每5—10天更换一次培养基，连续培养20—30天，至产生愈伤组织。
4.愈伤组织的分化培养
将产生愈伤组织的香蕉未成熟雄花切片接种于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.8的固体培养基上。在26—28℃，光强度为1500lx条件下培养，每天光培养12小时，再黑暗培养12小时。每10天更换一次培养基，连续培养20—40天，至分化产生香蕉小苗。
5.壮苗培养
将分化的小苗转到MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.8的固体培养基上。在26—28℃，光强度为1500-1700lx的条件下进行光培养，每15天更换一次培养基。
6.生根培养
经壮苗培养后，将香蕉苗接种于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼5.5g/L，pH＝5.8的培养基上，在28℃条件下，每天光照培养12小时，强度为1500lx，连续培养30-40天至诱导出较高质量的根系，成为生根苗。
7.生根苗驯化及移栽
生根苗经2-3天的自然光炼苗后，洗净根部培养基，移栽于营养袋中，在大棚育苗2—3个月，再移栽入大田定植。
结果分析：
1 香蕉未成熟雄花在自然生长的状态下不带细菌和病毒，在超净工作台小心剥除雄花苞片，至未成熟雄花长度为2.0厘米时切片，由于外殖体没有经过消毒的步骤，减少了伤害，极大提高了外殖体的出愈和分化率。
2 选取香蕉断蕾期的新鲜香蕉未成熟雄花切片，得到的切片褐化少，出愈快，出愈多，分化顺利。一定要选取新鲜的香蕉雄花，否则切片严重褐化，出愈少和分化困难，极大地影响香蕉组培苗的获得。
3 切片厚度对出愈和分化也有很重要的影响，太薄的切片褐化后生长缓慢，容易死亡，出愈率低；切片太厚，厚度超过2毫米时，切片膨大速度快，快速增大为一团，也不易出愈分化，试验中切片厚度在1.2毫米时出愈和分化达到最佳。
4 利用香蕉未成熟雄花切片，每株雄花可以切片20—24片,每一个雄花切片通过诱导愈伤分化成芽25—30个，繁殖系数高。单个香蕉未成熟雄花通过切片诱导分化一代就可以产生500-720株香蕉苗，这大大高于香蕉芽繁芽组培技术的繁殖系数。
5 由于繁殖系数高，所以生产相同数量的组培苗，与目前芽繁芽组培技术相比，香蕉未成熟雄花组织培养技术只需要继代2—4代就可以了，大大降低了组培的继代数。由于继代数很低，因此有效的防止了因为继代数高而出现的芽纤弱和参差不齐，幼芽变白，严重缺绿，缺乏生机活力，生长速度减慢，增殖率降低，变异率高等问题。香蕉未成熟组培苗继代数低，出苗整齐健壮，抗病性强，生长速度快，变异率低，生根快。相对于芽繁芽的组培技术有极大的优势。
[具体实施方式]
1 材料
中国热带农业科学院热带生物技术研究所试验基地采集的巴西香蕉新鲜断蕾雄花。
2 方法
2.1 材料的处理
将新鲜采集的香蕉雄花逐步剥除苞片，至到雄花长度为9—10厘米时转人超净工作台。在超净工作台中继续剥除香蕉雄花苞片，至到雄花长度为2.0厘米，纵向平均切为两半，再横切厚度为1.2毫米薄片。
2.2 愈伤组织培养
将切片接种于MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.3的固体培养基上，25-26℃，黑暗培养，视切片的褐化程度，每5—10天更换一次培养基，连续培养时间20—30天，产生愈伤组织。
2.3 分化培养
将生长愈伤组织的香蕉未成熟雄花切片接种于MS+4.0mg/L BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.8的固体培养基上，26—28℃，光培养，强度为1500lx，每10天更换一次培养基，连续培养时间20—40天，分化香蕉小苗。
2.4 壮苗培养
将分化的小苗转到MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.8的固体培养基上，26—28℃，光培养，光强度为1500-1700lx，每15天更换一次培养基。
2.5 催根培养
经壮苗培养后，将香蕉苗接种于MS+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼5.5g/L，pH＝5.8，28℃，每日光照培养12小时，光强度为1500lx。连续培养30-40天则诱导出较高质量的根系，成为生根苗。
2.6 生根苗驯化及移栽
生根苗经2-3天的自然光温炼苗后，洗净根部培养基，移栽于营养袋中，在大棚育苗2—3个月，再移栽入大田定植。
Claims (1)
1.一种高效香蕉离体快繁新方法，其特征在于：其步骤如下：
1)、外植体的选取
选取香蕉断蕾期的新鲜香蕉雄花；
2)、外植体的处理
逐步剥除香蕉雄花苞片，直到雄花长度为9—10厘米时转入超净工作台，在超净工作台中继续剥除香蕉花苞片，直到雄花长度为2.0—2.5厘米；将此部位的雄花纵向平均切为两半，再横切成厚度为1.2毫米的薄片；
3)、诱导愈伤组织的培养
将步骤2)获得的薄片接种于MS+1.0mg/L生物素+100mg/L谷氨酰胺+0.2mg/L TDZ+0.2mg/L Zeatin+40g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的固体培养基上，黑暗培养，至产生愈伤组织；
4)、愈伤组织的分化培养
将步骤3)获得的生长了愈伤组织的薄片接种于MS+4.0mg/LBA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的固体培养基上；光强度为1500Ix条件下进行培养，至分化产生香蕉小苗；
5)、壮苗培养
将分化的小苗转到MS+BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的固体培养基上，光强度为1500—1700 Ix的条件下进行培养；
6)、生根培养
经壮苗培养后，将香蕉苗接种于MS+NAA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂的培养基上，光强度为1500 Ix的条件下进行培养，得到生根苗；
7)、生根苗驯化及移栽
生根苗经2—3天的自然光炼苗后，洗净根部培养基，移栽于营养袋中，在大棚育苗2—3个月，再移栽入大田定植。
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Assignee: SEEDLINGS CULTIVATION CENTER, CHINESE ACADEMY OF TROPICAL AGRICULTURAL SCIENCES Assignor: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences Contract record no.: 2011990000574 Denomination of invention: Efficient banana in vitro quick-breeding method Granted publication date: 20090225 License type: Exclusive License Open date: 20070328 Record date: 20110708 |
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