CN102138532A - 太和贡椿组织培养繁殖种苗技术 - Google Patents

Abstract

香椿的组织培养与快繁技术，是从休眠的植株中，剪取当年生芽饱满的枝条，先水培催芽，再经杀菌、消毒，挑取0.2mm茎尖接种到诱导培养基中，进行分化培养；再利用培养出的植株，放入增殖培养基中进行增殖快繁。本发明解决了初代接种污染率高、褐变严重的问题，成苗率高，程序简单实用，有效解决了香椿试管苗的繁殖周期较长的问题。改变了常规繁育方法用香椿种子繁殖后代出现严重分离的现象，确保了种苗纯度。可实现工厂化育苗、高效率生产。试管中加入GA可以幼化试管苗，不使试管苗木质化，可以获得高增殖率的芽丛，便于增殖。采用食用白糖代替昂贵的蔗糖，可以有效降低成本。单株成本0.5元/株，种苗质量优于种子和分株繁殖方法。

Description

太和贡椿组织培养繁殖种苗技术

技术领域

本发明涉及一种植物的组织培养与快繁技术，确切的说是用香椿的茎尖分生组织进行组织培养，叶片组织培养进行快速繁殖，以及组织培养所用的营养物质—培养基组成。

背景技术

香椿 [Toona sinensis (A, Juss.) Rome.]楝科香椿属，多年生落叶大乔木，别名红椿、香椿树、香椿芽等，古时亦称  熏、杶，原产于我国中部。人们通常采其嫩茎叶进食，即俗称的香椿芽。香椿芽是我国传统的木本蔬菜，芽质脆、多汁、无渣、香气浓郁、营养丰富，雄居群蔬之冠（李秀信，2001）。我国对香椿大规模栽培开发较迟，直到 1970 年，山东、安徽等地才相继大面积栽培，从而开始了香椿菜用林的开发利用。80 年代，山东率先实行香椿矮化密植栽培，使它 成为单一的木本蔬菜，大大提高了香椿的产量。随着近年来温室、大棚等保护地 设施的广泛利用，香椿芽周年栽培技术日渐成熟。香椿芽的周年化供应，特别是在春节、元旦前上市， 使栽培的经济效益激增，香椿的生产也由零星栽植发展到大规模集约化生产（吴国良，1999；宋元林，2000）。

太和贡椿系安徽著名特产。产于太和县。该县香椿资源丰富，相传有千余年的栽培历史。产品芽头鲜嫩、色泽油光、肉质肥厚、清脆无渣、香气浓郁，且含有大量的蛋白质、维生素、碳水化合物以及铁、钙、钾等常量元素，是一种极富特色的食用佳品。“太和香椿”计有9个品种，其中以黑油椿、红油椿、青油椿3个品种为优，而黑油椿最佳，为重点发展品种，约占总面积的40%。经腌制后，原头不散，香气如故，食之无渣，经久不变质。产品芽头鲜嫩、色泽油光、肉质肥厚、清脆无渣、香气浓郁，且含有大量的蛋白质、维生素、碳水化合物以及铁、钙、钾等常量元素，经腌制后，原头不散，香气如故，食之无渣，经久不变质。畅销国内，远销东南亚一带。

香椿是我国特产，目前国内出口产地仅安徽省太和一地。我国的香椿市场是面积小，产量低，价格高，人民 喜食，市场紧缺。在传统栽培方法中香椿主要以种子繁殖和分株繁殖，由于香椿的种子常因感病而降低萌发率，种子采集困难，种源较少。种子播种后代分离较大。无法保存优良种性。分株繁殖速率很低。由于资源有限，通过扦插繁殖埋根等方法繁殖系数低很难满足生产上的需要，其发展规模因而受到限制，扦插繁殖方法只适用于少数品种。短期内无法获得大量种苗。分株繁殖只适用于零星栽植，不适用于大面积栽培用苗。因此采用组培技术，快繁名贵优良品种，以适应大棚或温室栽培，实现良种规模化生产，是解决种苗退化，提高产量和品质，加快香椿应用的有效途径。组织培养方法具有繁殖速度快，可周年生产，做到生产周年化和标准化。保持优良的种性，可有效的解决繁殖作物种性退化的问题。加速优良种苗的产业化发展。组培技术在多种作物上成功实现工厂化育苗，如桉树、香蕉苗、甘蔗苗。采用组培方式繁殖香椿是完全可行的。

根据大量资料统计 ，关于微繁香椿菜用良种或优良类型的研究最早开始1989 年，杨其光用香椿一年生休眠条，在 WPM 培养基上培养 2-3 个月，芽长仅2-3cm。同年，覃兰英以幼年的香椿实生苗茎段为外植体，在  MS 培养基上诱导成功，丛生芽多，生长高度可达 4-4.5cm。但香椿的组织培养研究象其它一些木本植物一样，如甜柿（孔祥生，1998）、核桃（韩碧文等，1986）、欧洲栗（Chevre A.M,1983）、葡萄(Dalal M.A.et al,1992)、龙眼（陈菁瑛等，1997），在进行组织培养时，其固有的易污染，褐化严重是研究中的障碍，使得其研究进展比较缓慢，远不如草本植物的组织培养研究快。康明（1991，1993）也有类似的研究。 芽培养方式是迄今为止应用最普遍的培养方法，采用香椿速生期的腋芽茎段为外植体在 MS 培养基上萌芽率为 53%（张小红，1999）。王春林（1994）比较了剥取的茎尖生长点、带 1 个小叶的新生枝茎尖和休眠顶芽生长点的成苗率，结果得出休眠顶芽生长点的成苗率最高，在 67%以上。陈彦生则以种芽、半木质化的腋芽茎段为外植体在 MS 培养基上成苗率达 73%，移栽成活率为 70%，并提出GA₃ 不仅能使腋芽增殖，而且能有效降低并防止玻璃化苗产生（陈彦生等，1999）。 陈彦生等（1999）用常规方法对种子进行消毒，即可获得无菌苗，继代培养中，子叶分化出芽，而下胚轴没有分化。据报道，目前只有王春林（1994）的研究中愈伤组织分化出了芽，其分化培养基为 BA2.5 mg/kg +NAA2.5mg/kg，但再生率极低，每块愈伤组织一般只能产生一个芽。纵观以上组织培养方面的研究，其所选的外植体多样化，接种的时间也各异，且大都是在单一的培养基上进行的试验。目前为止香椿组培仍处于实验室阶段，产业化应用仍需要进一步努力。

发明内容

1、分化诱导培养

从香椿休眠的植株中，选择生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，剪取主芽、腋芽饱满的20-30cm长枝条，在温室内进行水培催芽。待芽长到3-4cm时，取下，在实验室内进行清洗处理。去除多余叶片叶柄，剪成2cm长带芽小段。在无菌室内的超净工作台上，用升汞消毒10min，，再用无菌水冲洗5-6遍，然后剪成1.0cm长含有1个腋芽的茎段，在解剖镜下挑取0.2mm大小茎尖接种到诱导培养基中，封口后作好标记，在培养室内进行诱导培养。培养温度25℃，湿度65-75%，光照强度 1000-2000LX，光照时间12-14h/d。经过25-28天的分化培养，茎尖逐渐长大，茎尖基部略带愈伤组织，此时可以转入增殖培养基。

2、增殖培养

将长大的茎尖转入增殖培养基中，转入增殖培养基中进行增殖培养，在培养室内通过20天的增殖培养，茎尖逐渐分化成丛生芽，每个茎尖可以分化出2-3个小芽，此时可进行继代繁殖，将芽丛从基部切开，重新接种到继代增殖培养基中。经过一个周期后，又形成2-3个小芽丛。如此反复进行。芽丛逐渐增多，繁殖体系基本建立起来。培养温度25士℃，湿度65-75%，光照强度1800-2200LX，光照时间12-14h/d。

3、切段繁殖

在培养芽丛的过程中，有的芽丛逐渐脱离丛生状态，转向高生长，如果延长培养时间，不转接，少量可以形成根系，此时应将这种苗分离出来，单独生根、切段繁殖培养。将高4cm以上的小苗，用剪刀剪切成单茎节茎段，转入切段繁殖培养基中进行培养。25天后，又萌发成一株小苗。这样反复进行，可以大量获得这样的小苗。切段繁殖体系建立起来。将已获得的组培苗切成带一个腋芽的小段，大约0.5-1cm。接种在切段繁殖培养基中，一周后腋芽萌发，一个月后苗高7-8cm。香椿腋芽的数量直接取决于芽数量的多少，而香椿分枝性差，特别是一年生的幼苗，只有一个主茎没有侧枝发育。通过摘心抑制顶端优势，促进侧芽发育，对于香椿分枝有一定的促进作用，通过摘心处理主茎数增加了5% 左右，有的增加到5-6个芽。

3、生根培养

选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有1个节间的小段长1.0cm转入生根培养基中，25天左右，有95%以上的植株长出0.3-3cm长的根，展开叶3-5片，待苗长至30-35天时，即可炼苗移栽。培养温度25℃，湿度65-75%，光照强度1800-220OLx，光照时间12-14h/d。试管苗易根型材料的筛选，易根型材料 10天生根；中间型45天生根；难生根型材料，常久不形成根，生根阶段，将快繁获得的新苗，茎部切除，转入生根培养基中15d便有根长出，根数在5-10个左右。观察表明，在生根过程中，茎的生长并不显著，这是因为，在生根培养基中。根系的吸收主要供自身的生长。

4、炼苗与移栽

香椿组培苗在长出根以后，就可以出瓶炼苗，待苗高5-7cm时较易成活，练苗前首先揭开培养瓶的封口膜，然后小心取出小苗，用自来水冲洗净苗基部的培养基，然后移栽到已灭过菌的蛭石基质中，前期适当遮阴并保持湿度在85-95%，逐步降至70%，15天后去掉薄膜，定期用75%百菌清喷洒杀菌，每7天一次。成活率在95%以上。冬季炼苗时，为防止休眠，除提高培养温度外，需要在叶片上喷洒GA₃20ppm一到两次。

本发明的培养基组成:

由基本培养基、生长调节剂附加食用白糖和琼脂组成分化诱导培养基、增值培养基和生根培养基，基本培养基为Ms，基本培养基Ms的配制方法为公知技术，生长调节剂分别由6-苄氨基腺漂吟(6-BA)、a-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA₃)组合而成。

1、茎尖诱导培养基的配比是:

MS+6-BA3.5mg/l+NAA0.15mg/l+GA₃0.1mg/l+琼脂6.5g+市售白糖30g

以上表达式所表示的意思是：在每升培养基中加入6-苄基腺嘌呤（6-BA）3.5mg、ａ-萘乙酸（NAA）0.15mg、赤霉素（GA₃）0.1mg、琼脂6.5g、白糖30g。本发明所列表达式均按此解释。

2、增殖培养基的组成是:

ＭＳ+BA1.5ｍｇ/l+NAA0.08mg/l+GA₃0.01mg/l+琼脂6.5g+市售白糖30g

3生根培养基组成：

MS+6-IBA0.1mg/l+琼脂6.5g+市售白糖30g

本发明的积极效果是:

利用香椿的茎尖进组织培养繁殖改变了常规繁育方法用香椿种子繁殖后代出现严重分离的多样化现象，保持了原品种的优良种性，确保了种苗纯度。香椿芽产量提高30%以上，且香味浓郁，无病虫害发生。克服了传统的用种子和扦插繁殖速度慢的弊端，可实现工厂化育苗、高效率生产;可人为的控制培养生长条件，不受自然条件的影响，取材量小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，管理方便，利于自动化生产和产业化生产。同时本发明解决了香椿初代接种时，污染率高、褐变严重的问题。初代接种污染率低于4%。茎尖培养成苗率高，程序简单实用，有效解决了香椿试管苗的繁殖周期较慢，生长缓慢的问题。繁殖系数达到5.6倍，快繁生产周期25天。试管中加入GA（赤霉素）可以幼化试管苗，不使试管苗木质化，可以获得高增殖率的芽丛，便于增殖。同时解决了规模化生产成本偏高的问题，采用食用白糖代替昂贵的蔗糖，可以有效降低成本。单株成本0.5元/株，种苗质量优于种子和分株繁殖方法。

具体实施方式

本实施例是用太和贡椿中的黑油椿，进行组培快繁的实例。

1、分化诱导培养

从香椿休眠的植株中，选择生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，剪取主芽、腋芽饱满的20-30cm长枝条，在温室内进行水培催芽。待芽长到3-4cm时，取下，在实验室内进行清洗处理。去除多余叶片叶柄，剪成2cm长带芽小段。在无菌室内的超净工作台上，用升汞消毒10min，，再用无菌水冲洗5-6遍，然后剪成1.0cm长含有1个腋芽的茎段，在解剖镜下挑取0.2mm大小茎尖接种到诱导培养基中，在培养室内进行诱导培养。培养温度25℃，湿度65-75%，光照强度 1000-2000LX，光照时间12-14h/d。经过25-28天的分化培养，茎尖逐渐长大，茎尖基部略带愈伤组织，此时可以转入增殖培养基。

2、增殖培养

将长大的茎尖转入增殖培养基中，转入增殖培养基中进行增殖培养，在培养室内通过20天的增殖培养，茎尖逐渐分化成丛生芽，每个茎尖可以分化出2-3个小芽，此时可进行继代繁殖，将芽丛从基部切开，重新接种到继代培养基中。经过一个周期后，又形成2-3个小芽丛。如此反复进行。芽丛逐渐增多，繁殖体系基本建立起来。培养温度25士℃，湿度65-75%，光照强度1800-2200LX，光照时间12-14h/d。

3、切段繁殖

在培养芽丛的过程中，有的芽丛逐渐脱离丛生状态，转向高生长，如果延长培养时间，不转接，少量可以形成根系，此时应将这种苗分离出来，单独生根、切段繁殖培养。将高4cm以上的小苗，用剪刀剪切成单茎节茎段，转入切段繁殖培养基中进行培养。25天后，又萌发成一株小苗。这样反复进行，可以大量获得这样的小苗。切段繁殖体系建立起来。将已获得的组培苗切成带一个腋芽的小段，大约0.5-1cm。接种在切段繁殖培养基中，一周后腋芽萌发，一个月后苗高7-8cm。香椿腋芽的数量直接取决于芽数量的多少，而香椿分枝性差，特别是一年生的幼苗，只有一个主茎没有侧枝发育。通过摘心抑制顶端优势，促进侧芽发育，对于香椿分枝有一定的促进作用，通过摘心处理主茎数增加了5% 左右，有的增加到5-6个芽。

3、生根培养

选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有1个节间的小段长1.0cm转入生根培养基中，25天左右，有95%以上的植株长出0.3-3cm长的根，展开叶3-5片，待苗长至30-35天时，即可炼苗移栽。培养温度25℃，湿度65-75%，光照强度1800-220OLx，光照时间12-14h/d。试管苗易根型材料的筛选，易根型材料 10天生根；中间型45天生根；难生根型材料，常久不形成根，生根阶段，将快繁获得的新苗，茎部切除，转入生根培养基中15d便有根长出，根数在5-10个左右。观察表明，在生根过程中，茎的生长并不显著，这是因为，在生根培养基中。根系的吸收主要供自身的生长。

4、炼苗与移栽

香椿组培苗在长出根以后，就可以出瓶炼苗，待苗高5-7cm时较易成活，练苗前首先揭开培养瓶的封口膜，然后小心取出小苗，用自来水冲洗净苗基部的培养基，然后移栽到已灭过菌的蛭石基质中，前期适当遮阴并保持湿度在85-95%，逐步降至70%，15天后去掉薄膜，定期用75%百菌清喷洒杀菌，每7天一次。成活率在95%以上。冬季炼苗时，为防止休眠，除提高培养温度外，需要在叶片上喷洒GA₃20ppm一到两次。

Claims (15)

1.太和贡椿组织培养繁殖种苗技术

（1）从香椿休眠的植株中，剪取长20-30cm，主芽、腋芽饱满的枝条，在温室内进行水培催芽。

2.待芽长到3-4cm时，用升汞消毒10min，，再用无菌水冲洗5-6遍，然后剪成1.0cm长含有1个腋芽的茎段，在解剖镜下挑取0.2mm大小茎尖接种到诱导培养基中，在培养室内进行诱导培养。

3.培养温度25℃，湿度65-75%，光照强度 1000-2000LX，光照时间12-14h/d。

4.（2）  将高4cm以上的小苗，用剪刀剪切成单茎节茎段，转入切段繁殖培养基中进行培养。

5.25天后，又萌发成一株小苗。

6.通过剪去茎端，摘心抑制顶端优势，促进侧芽发育。

7.（3）选取无菌芽苗切成含有1个节间的长1.0cm小段转入生根培养基中，培养温度25℃，湿度65-75%，光照强度1800-2200Lx，光照时间12-14h/d。

8.（4）苗高5-7cm时炼苗，炼苗前首先揭开培养瓶的封口膜，然后小心取出小苗，用自来水冲洗净苗基部的培养基，然后移栽到已灭过菌的蛭石基质中，前期适当遮阴并保持湿度在85-95%，逐步降至70%，15天后去掉薄膜，定期用75%百菌清喷洒杀菌，每7天一次。

9.成活率在95%以上。

10.冬季炼苗时，为防止休眠，除提高培养温度外，需要在叶片上喷洒GA₃20ppm一到两次。

11.由基本培养基、生长调节剂附加食用白糖和琼脂组成分化诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。

12.基本培养基为Ms，基本培养基Ms的配制方法为公知技术，生长调节剂分别由6-苄氨基腺漂吟(6-BA)、a-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA₃)组合而成。

13.1、茎尖诱导培养基的配比是:

MS+6-BA3.5mg/l+NAA0.15mg/l+GA₃0.1mg/l+琼脂6.5g+市售白糖30g

以上表达式所表示的意思是：在每升培养基中加入6-苄基腺嘌呤（6-BA）3.5mg、ａ-萘乙酸（NAA）0.15mg、赤霉素（GA₃）0.1mg、琼脂6.5g、白糖30g。

14.本发明所列表达式均按此解释。

15.2、增殖培养基的组成是:

ＭＳ+BA1.5ｍｇ/l+NAA0.08mg/l+GA₃0.01mg/l+琼脂6.5g+市售白糖30g

3生根培养基组成：

MS+6-IBA0.1mg/l+琼脂6.5g+市售白糖30g。