CN108464240A - 白雪公主草莓脱毒快繁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其包括以下步骤：S1、外植体的选取及表面清洗：选取白雪公主草莓葡萄茎的茎尖2～4cm作为外植体，进行表面清洗；S2、灭菌消毒：将经表面清洗过的外植体置于工作台上，进行灭菌消毒；S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，接种于诱导培养基上，诱导培养50～60天，得到白雪公主草莓幼苗；S4、病毒检测并选苗：将白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选达标白雪公主草莓幼苗；S5、继代增殖培养：将达标白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，30天继代一次，继代5～6次；S6、生根培养：将株高3‑5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株。
Description
技术领域
本发明属于农业育苗技术领域，涉及一种白雪公主草莓脱毒快繁的方法。
背景技术
草莓属蔷薇科草莓属多年生草本植物，是一种重要的经济作物。草莓果肉含有大量蛋白质、糖类及果胶等营养物质，其维生素C含量高于苹果、葡萄等水果，口味酸甜，味道鲜美，深受人们喜爱。除鲜食外，草莓可加工成罐头、果酱、果酒和饮料等制品。近几年，我国草莓生产发展迅速，草莓的面积和产量已跃居世界首位，在促进各地农业增效和农民增收中发挥着重要作用。草莓传统的繁殖方法是利用匍匐茎子苗分株繁殖,分苗繁殖虽然简便易行、成本低廉，但繁殖速度慢,由于种植年限较长,加上连作、以结果母株繁苗等,体内病毒积累逐年增加,病毒病发生严重,造成优良种性退化、品质变劣、产量降低等退化现象。主要表现有：生长缓慢、叶皱缩、品种果实变小、畸形、品质差，一般减产30％-80％并逐年加重，复合侵染时损失更大。在我国已造成损失的草莓病毒病主要有草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒、草莓皱缩病毒四种。病毒病已成为草莓主要病害之一,严重阻碍了草莓产业的进一步发展。对于病毒病目前还没有药剂可以治理。因此,培育无病毒母本苗、栽培无病毒苗木是防治草莓病毒病的根本对策。
现有的白雪公主草莓传统的繁殖方法是利用匍匐茎子苗分株繁殖，繁殖速度慢，由于种植年限较长,加上连作、以结果母株繁苗等,体内病毒积累逐年增加,病毒病发生严重,造成优良种性退化、品质变劣、产量降低等退化现象。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种白雪公主草莓脱毒快繁的方法，利用匍匐茎做茎尖剥离组织，通过组织培养技术繁育脱毒草莓种苗，解决当前白雪公主草莓实际生产过程中种苗繁殖慢和种苗带毒的问题，提高白雪公主草莓的产量和品质，培育出的白雪公主草莓脱毒苗具有植株长势强、根系发达、个体生长健壮整齐等优点。
本发明是这样实现的：
一种白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其包括以下步骤：
S1、外植体的选取及表面清洗：选取白雪公主草莓葡萄茎的茎尖2～4cm作为外植体，用清洁剂清洗一次，再用水清洗2～3次，然后用吐温清洗一次，之后用流动的水冲洗20～30min；
S2、灭菌消毒：将经步骤S1表面清洗过的外植体置于工作台上，先用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，然后用0.1％升汞消毒3min，在整个灭菌消毒过程中不断搅动，然后用无菌水冲洗5次，外植体消毒完毕；
S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，将其接种于诱导培养基上，所述诱导培养基为Ms+6-BA 0.3～0.7mg/L+IBA 0.06～0.14mg/L+蔗糖25g/L，置于25±2℃、黑暗条件下暗培养3天后，移至温度25±2℃、光照2000Lx的培养环境中，光照12h/d，诱导培养50～60天，得到白雪公主草莓幼苗；
S4、病毒检测并选苗：将步骤S3得到的白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选达标白雪公主草莓幼苗；
S5、继代增殖培养：将达标白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，所述增殖培养基为Ms+6-BA 0.05～1.0mg/L+IBA 0.01～0.2mg/L+蔗糖25g/L，30天继代一次，继代5～6次；
S6、生根培养：将步骤S5得到的株高3-5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，所述生根培养基为1/2Ms+IBA 0～0.5mg/L+蔗糖20g/L，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株。
优选的，所述诱导培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L。
优选的，所述增殖培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L。
优选的，所述生根培养基为1/2Ms+蔗糖20g/L。
优选的，步骤S2中的搅动速度为100～150r/min。
优选的，步骤S5中继代培养的方法为每30天继代转接一次。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供一种白雪公主草莓脱毒快繁的方法，利用葡萄茎做茎尖剥离组织培养，繁育脱毒白雪公主草莓种苗，繁育的植株长势好、根系发达、个体生长健壮整齐、产量高、品质好。
(2)本发明的草莓茎尖培养技术不仅可以实现草莓优良品种的快速繁殖,对严重感染病毒的品种进行提纯复壮,而且可以使草莓苗的质量大大提高,还可结合辐射诱变等处理进行品种的改良及种质资源的保存。
(3)本发明继代培养过程中增值系数高达8.00，大大提高了白雪公主草莓种苗继代培养过程中的增殖速率，并且利用本发明提供的培养基配方，大大缩短了白雪公主草莓繁苗阶段的周期，使白雪公主草莓种苗能够快速繁殖。
(4)本发明将培养环境由自然环境培养移至培养室，利用培养室可控的温度、湿度和光照组织培养繁殖草莓种苗，摆脱了自然大环境由于季节限制导致草莓不能繁殖的局限。
附图说明
图1为本发明的白雪公主草莓脱毒快繁的方法的流程图。
具体实施方式
以下将参考附图详细说明本发明的示例性实施例、特征和方面。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。
如图1所示，一种白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其包括以下步骤：
S1、外植体的选取及表面清洗：选取无病虫的白雪公主草莓葡萄茎的茎尖2～4cm作为外植体，用清洁剂清洗一次，再用自来水清洗2～3次，然后用吐温清洗一次，之后用流动的水冲洗20～30min；
S2、灭菌消毒：将经步骤S1表面清洗过的外植体置于超净工作台上，先用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，然后用0.1％升汞消毒3min，在整个灭菌消毒过程中不断搅动，搅动速度为100～150r/min，然后用无菌水冲洗5次，外植体消毒完毕；
S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，将其接种于诱导培养基上，诱导培养基为Ms+6-BA0.3～0.7mg/L+IBA 0.06～0.14mg/L+蔗糖25g/L，置于25±2℃、黑暗条件下暗培养3天后，移至温度25±2℃、光照2000Lx的培养环境中，光照12h/d，诱导培养50～60天，得到白雪公主草莓幼苗；
S4、病毒检测并选苗：将步骤S3得到的白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选未携带病毒的白雪公主草莓幼苗为达标白雪公主草莓幼苗；
S5、继代增殖培养：将达标白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，增殖培养基为Ms+6-BA 0.05～1.0mg/L+IBA 0.01～0.2mg/L+蔗糖25g/L，30天继代一次，继代5～6次；
S6、生根培养：将步骤S5得到的株高3-5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，生根培养基为1/2Ms+IBA 0～0.5mg/L+蔗糖20g/L，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株。
本发明的白雪公主草莓是由北京市农林科学院培育的外表呈白色、有红色籽粒的草莓，果肉为纯白色。
优选地，工作台为超净工作台。
实施例1
S1、外植体的选取及表面清洗：选取无病虫、品种纯正的健壮的白雪公主草莓葡萄茎茎尖2～4cm作为外植体，用清洁剂清洗一次，再用自来水清洗2～3次，然后用吐温清洗一次，之后用流动的自来水冲洗20～30min；
S2、灭菌消毒：将经步骤S1表面清洗过的外植体置于超净工作台上，先用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，然后用0.1％升汞消毒3min，在整个灭菌消毒过程中不断搅动，搅动速度为150r/min，然后用无菌水冲洗5次，外植体消毒完毕；
S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，接种于诱导培养基上，诱导培养基为Ms+6-BA 0.4mg/L+IBA 0.08mg/L+蔗糖25g/L，置于25±2℃、黑暗条件下暗培养3天后，移至温度25±2℃、光照2000Lx的培养环境中，光照12h/d，诱导培养50～60天，得到草莓幼苗，草莓幼苗株高较大，长势较均匀；
S4、病毒检测并选苗：将步骤S3得到的白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选未携带病毒的白雪公主草莓幼苗；
S5、继代增殖培养：将未携带病毒的白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，增殖培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，30天继代一次，继代5～6次，增殖系数为8.00；
S6、生根培养：将步骤S5得到的株高3-5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，生根培养基为1/2Ms+蔗糖20g/L，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株，植株全部生根。
实施例2
S1、外植体的选取及表面清洗：选取无病虫、品种纯正的健壮的白雪公主草莓葡萄茎茎尖2～4cm作为外植体，用清洁剂清洗一次，再用自来水清洗2～3次，然后用吐温清洗一次，之后用流动的自来水冲洗20～30min；
S2、灭菌消毒：将经步骤S1表面清洗过的外植体置于超净工作台上，先用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，然后用0.1％升汞消毒3min，在整个灭菌消毒过程中不断搅动，搅动速度为150r/min，然后用无菌水冲洗5次，外植体消毒完毕；
S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，接种于诱导培养基上，诱导培养基为Ms+6-BA0.4mg/L+IBA 0.08mg/L+蔗糖25g/L，置于25±2℃、黑暗条件下暗培养3天后，移至温度25±2℃、光照2000Lx的培养环境中，光照12h/d，诱导培养50～60天，得到白雪公主草莓幼苗，白雪公主草莓幼苗株体较大，长势较均匀；
S4、病毒检测并选苗：将步骤S3得到的白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选未携带病毒的白雪公主草莓幼苗；
S5、继代增殖培养：将未携带病毒的白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，增殖培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，30天继代一次，继代5～6次，增殖系数为8.00；
S6、生根培养：将步骤S5得到的株高3-5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，生根培养基为1/2Ms+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株，植株全部生根。
实施例3
S1、外植体的选取及表面清洗：选取无病虫、品种纯正的健壮的白雪公主草莓葡萄茎茎尖2～4cm作为外植体，用清洁剂清洗一次，再用自来水清洗2～3次，然后用吐温清洗一次，之后用流动的自来水冲洗20～30min；
S2、灭菌消毒：将经步骤S1表面清洗过的外植体置于超净工作台上，先用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，然后用0.1％升汞消毒3min，在整个灭菌消毒过程中不断搅动，搅动速度为150r/min，然后用无菌水冲洗5次，外植体消毒完毕；
S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，接种于诱导培养基上，诱导培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，置于25±2℃、黑暗条件下暗培养3天后，移至温度25±2℃、光照2000Lx的培养环境中，光照12h/d，诱导培养50～60天，得到草莓幼苗，草莓幼苗株高较大，长势优于实施例1和实施例2；
S4、病毒检测并选苗：将步骤S3得到的白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选未携带病毒的白雪公主草莓幼苗；
S5、继代增殖培养：将未携带病毒的白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，增殖培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，30天继代一次，继代5～6次，增殖系数为8.00；
S6、生根培养：将步骤S5得到的株高3-5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，生根培养基为1/2Ms+IBA 0.5mg/L+蔗糖20g/L，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株，植株全部生根。
实施例4
S1、外植体的选取及表面清洗：选取无病虫、品种纯正的健壮的白雪公主草莓葡萄茎茎尖2～4cm作为外植体，用清洁剂清洗一次，再用自来水清洗2～3次，然后用吐温清洗一次，之后用流动的自来水冲洗20～30min；
S2、灭菌消毒：将经步骤S1表面清洗过的外植体置于超净工作台上，先用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒3min，在整个灭菌消毒过程中不断搅动，搅动速度为150r/min，然后用无菌水冲洗5次，外植体消毒完毕；
S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，接种于诱导培养基上，诱导培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，置于25±2℃、黑暗条件下暗培养3天后，移至温度25±2℃、光照2000Lx的培养环境中，光照12h/d，诱导培养50～60天，得到草莓幼苗，草莓幼苗株高较大，长势优于实施例1和实施例2；
S4、病毒检测并选苗：将步骤S3得到的白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选未携带病毒的白雪公主草莓幼苗；
S5、继代增殖培养：将未携带病毒的白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，增殖培养基为Ms+6-BA0.4mg/L+IBA 0.08mg/L+蔗糖25g/L，30天继代一次，继代5～6次；
S6、生根培养：将步骤S5得到的株高3-5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，生根培养基为1/2Ms+蔗糖20g/L，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株，植株全部生根，生根快，须根较多。
实施例5
S1、外植体的选取及表面清洗：选取无病虫、品种纯正的健壮的白雪公主草莓葡萄茎茎尖2～4cm作为外植体，用清洁剂清洗一次，再用自来水清洗2～3次，然后用吐温清洗一次，之后用流动的自来水冲洗20～30min；
S2、灭菌消毒：将经步骤S1表面清洗过的外植体置于超净工作台上，先用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，然后用0.1％升汞消毒3min，在整个灭菌消毒过程中不断搅动，搅动速度为150r/min，然后用无菌水冲洗5次，外植体消毒完毕；
S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，接种于诱导培养基上，诱导培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，置于25±2℃、黑暗条件下暗培养3天后，移至温度25±2℃、光照2000Lx的培养环境中，光照12h/d，诱导培养50～60天，得到草莓幼苗，草莓幼苗株高较大，长势优于实施例1和实施例2；
S4、病毒检测并选苗：将步骤S3得到的白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选未携带病毒的白雪公主草莓幼苗；
S5、继代增殖培养：将未携带病毒的白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，增殖培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，30天继代一次，继代5～6次，增殖系数为8.00；
S6、生根培养：将步骤S5得到的株高3-5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，生根培养基为1/2Ms+蔗糖20g/L，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株，植株全部生根，生根快，须根最多。
优选的，本实施例的继代培养的方法为每30天进行继代转接一次。
在诱导培养基上进行诱导培养时，诱导培养5天左右草莓茎尖陆续略有膨大，有少部分变褐死亡，未死亡的逐渐继续膨大，露出芽体，45天后，分化出幼苗，并没有出现丛芽和愈伤组织，但不同激素浓度的培养基上的小苗的大小与生长状态不同，总体长势均匀，但诱导培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L时，得到的白雪公主草莓幼苗株高最高，长势最整齐均匀。
增殖培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L时，增殖系数最大为8.00，得到的有效苗最多，长势健壮，叶片成浓绿色，生根培养基为1/2Ms+蔗糖20g/L时，白雪公主草莓植株在25天左右能生根达到100％，且长势强壮，生根快，须根较多。
使用本发明提供的白雪公主草莓脱毒快繁的方法培育的育苗成活率能达到90％以上，并且每个梯度上都基本一致，而且移栽成活率为100％，且繁育周期短。
综上，培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，增殖培养基为Ms+6-BA0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L，生根培养基为1/2Ms+蔗糖20g/L，为本申请的最优选方案。
本发明繁育的白雪公主草莓植株长势好、根系发达、个体生长健壮整齐、比常规苗产量高、品质好。而且，本发明的草莓茎尖培养技术不仅可以实现草莓优良品种的快速繁殖，对严重感染病毒的品种进行提纯复壮,而且可以使草莓苗的质量大大提高,还可结合辐射诱变等处理进行品种的改良及种质资源的保存。
最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (6)
1.一种白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
S1、外植体的选取及表面清洗：选取白雪公主草莓葡萄茎的茎尖2～4cm作为外植体，用清洁剂清洗一次，再用水清洗2～3次，然后用吐温清洗一次，之后用流动的水冲洗20～30min；
S2、灭菌消毒：将经步骤S1表面清洗过的外植体置于工作台上，先用无菌水清洗2次，再用75％酒精消毒30s，然后用0.1％升汞消毒3min，在整个灭菌消毒过程中不断搅动，然后用无菌水冲洗5次，外植体消毒完毕；
S3、诱导培养：在解剖镜下用解剖针挑取外植体的茎尖0.5mm，将其接种于诱导培养基上，所述诱导培养基为Ms+6-BA 0.3～0.7mg/L+IBA 0.06～0.14mg/L+蔗糖25g/L，置于25±2℃、黑暗条件下暗培养3天后，移至温度25±2℃、光照2000Lx的培养环境中，光照12h/d，诱导培养50～60天，得到白雪公主草莓幼苗；
S4、病毒检测并选苗：将步骤S3得到的白雪公主草莓幼苗用病毒试剂盒进行病毒检测，并挑选达标白雪公主草莓幼苗；
S5、继代增殖培养：将达标白雪公主草莓幼苗移至增殖培养基中，所述增殖培养基为Ms+6-BA 0.05～1.0mg/L+IBA 0.01～0.2mg/L+蔗糖25g/L，30天继代一次，继代5～6次；
S6、生根培养：将步骤S5得到的株高3-5cm的白雪公主草莓小苗移至生根培养基中，所述生根培养基为1/2Ms+IBA 0～0.5mg/L+蔗糖20g/L，培养20～30天，得到白雪公主草莓植株。
2.根据权利要求1所述的白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其特征在于：所述诱导培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L。
3.根据权利要求2所述的白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其特征在于：所述增殖培养基为Ms+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖25g/L。
4.根据权利要求3所述的白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其特征在于：所述生根培养基为1/2Ms+蔗糖20g/L。
5.根据权利要求1所述的白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其特征在于：步骤S2中的搅动速度为100～150r/min。
6.根据权利要求1所述的白雪公主草莓脱毒快繁的方法，其特征在于：步骤S5中继代培养的方法为每30天继代转接1次。
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