CN109258469A

CN109258469A - 一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法

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Publication number: CN109258469A
Application number: CN201811372705.0A
Authority: CN
Inventors: 汪志伟; 舒黄英; 郝园园; 周燕; 成善汉; 朱国鹏
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: CN109258469B

Abstract

本发明公开了一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，包括无菌苗的获取、不定芽的诱导、不定芽的伸长、不定芽的生根和移栽等步骤。灭菌后的种子接种在不添加植物激素的MS培养基上，选取适宜苗龄无菌苗的带柄子叶作为外植体，利用研究得到的诱导不定芽培养基产生不定芽，使得诱导分化率提高；利用研究得到的伸长培养基，使不定芽的伸长诱导率得到了很大的提升；生根培养基有利于不定根的诱导，从而提高了再生植株的成活率。采用中国辣椒带柄子叶作为外植体，结合筛选的诱导不定芽培养基、不定芽伸长培养基和生根培养基，显著提高了诱芽率和生根率，本发明构建的离体再生体系，为中国辣椒遗传转化的研究奠定了基础。

Description

一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法。

背景技术

组织培养是农业生物技术的重要组成部分，在蔬菜作物离体再生过程中发挥重要作用。辣椒为茄科辣椒属植物，是我国主要蔬菜之一，辣椒属共有5个栽培种：一年生辣椒(Capsicum annuum)、中国辣椒(Capsicum chinense)、灌木状辣椒(Capsicumfrutescens)、下垂辣椒(Capsicum baccatum)和柔毛辣椒(Capsicum pubescens)。中国辣椒特点是花冠为白色，每一节位2朵花以上，萼片有缢缩。种内大多数叶片与果皮有皱缩，果实有特殊芳香味，高辣(也存在少量低辣和果面光滑的品种)。在我国栽培的有一年生辣椒、灌木状辣椒和中国辣椒，中国辣椒栽培优势区分布在海南、云南和广西等地。目前辣椒离体再生的研究多集中于一年生辣椒(Capsicum annuum)，其它辣椒栽培种离体再生体系的研究极少。在中国辣椒研究中，基因型、外植体类型及激素配比对再生体系的影响大，使再生体系构建较困难，进一步影响到中国辣椒的遗传转化。本发明针对中国辣椒(Capsicumchinense)离体再生体系的构建进行研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，提高了中国辣椒的不定芽诱导分化率、伸长率和生根率的作用。

本发明采用的技术手段如下：一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，包括以下步骤：

(1)无菌苗的获取：取中国辣椒的种子放置在过滤器上，然后放入培养瓶中，加入无菌水，水浴加热后，进行灭菌处理，最后将灭菌处理后的种子吸干水分，接种至不添加植物激素的MS培养基上，光照培养得到无菌苗。

(2)不定芽的诱导：取培养13～17d生长正常的无菌苗，切取0.5～1cm带柄子叶作为外植体，接种到灭菌后的诱导不定芽培养基中，进行不定芽的诱导培养，带柄子叶周围生成不定芽。

(3)不定芽的伸长：将分化出2～3cm的不定芽切分，转移至伸长培养基中培养。

(4)不定芽的生根：将步骤(3)中培养伸长至3～5cm的不定芽切分，接种至生根培养基中诱导生根。

(5)移栽：待生根苗株高为8～12cm后，去瓶盖培养1～2d，将生根苗株从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入品式泥炭土，置于光照培养箱内培养，保持土壤湿润，幼苗成活后移栽至大田。

进一步地，所述步骤(1)中，置于50～60℃水浴锅中加热20～40min。

进一步地，所述步骤(1)中，灭菌处理先用70％～80％乙醇震荡处理1～3min，然后用无菌水冲洗，再加入3％～5％次氯酸钠溶液进行震荡摇晃10～20min，接着无菌水冲洗3～6次。

进一步地，所述步骤(1)中，光照培养时间为14～18h，光照培养强度为2000～2500lux。

进一步地，所述MS培养基为含琼脂和蔗糖的培养基。

进一步地，所述步骤(2)中，所述诱导不定芽培养基为MS+6-BA 3.0mg/L+IAA0.1mg/L，诱导培养15～25d。

进一步地，所述步骤(2)中，将诱导不定芽培养基置于高压蒸汽灭菌锅内，在115～121℃下灭菌15～30min。

进一步地，所述步骤(3)中，所述伸长培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IAA 1.0mg/L+GA₃4.0mg/L，培养10～20d，所述GA₃置于除菌过滤器内过滤灭菌,待培养基冷却至55～60℃后使用。

进一步地，所述步骤(4)中，所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.2mg/L，培养两周后长出8～12条粗壮的根系。

进一步地，所述步骤(5)中，所述培养箱内温度为24～26℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、灭菌后的种子接种在不添加植物激素的MS培养基上，选取适宜苗龄无菌苗的带柄子叶作为外植体，产生不定芽，使得诱导分化率升高；因中国辣椒基因型依赖性较强，研究得到的诱导不定芽培养基和伸长培养基，使得诱导率和不定芽的伸长诱导率得到了很大的提升；生根培养基有利于不定根的诱导，从而提高了再生植株的成活率。

2、本发明建立了经过愈伤组织诱导获得一种中国辣椒诱导再生植株的高效再生体系，采用带柄子叶作为外植体，先提高芽分化率，再改善芽的质量，从而获得了再生率高的植株，为中国辣椒的遗传转化进行基因功能验证提供了前提条件。

3、本发明能快速获得无菌苗且污染率低，在不定芽的生根培养基中两周能长出粗壮的根系，幼苗移栽到配好的基质中，放入人工温室培养，可达98％的成活率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的优选实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的过程示意图。

其中：a为中国辣椒灭菌后的种子，b为带柄子叶的外植体，c为中国辣椒带柄子叶愈伤组织及芽诱导情况，d为愈伤组织进行诱导分化形成不定芽和芽伸长情况，e为生根培养后的完整的再生植株生长情况，f为生根培养后的再生植株的生根情况。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，包括以下步骤：

(1)无菌苗的获取：取中国辣椒的种子放置在不锈钢过滤器上，然后放入培养瓶中，加入无菌水，将带有无菌水的培养瓶置于50℃水浴锅中加热20min后，进行灭菌处理先用70％乙醇震荡2min，然后用无菌水冲洗，再用3％次氯酸钠溶液进行震荡摇晃10min，接着无菌水冲洗3次，最后将灭菌处理后的种子置于无菌滤纸上吸干水分，接种至不添加植物激素的MS培养基上，所述MS培养基为含琼脂和蔗糖的培养基，光照培养得到无菌苗，光照培养时间为14h，光照培养强度为2000lux。

(2)不定芽的诱导：取培养13d生长正常的无菌苗，切取0.5cm带柄子叶作为外植体，接种到灭菌后的诱导不定芽培养基中，将诱导不定芽培养基置于高压蒸汽灭菌锅内，在115℃下灭菌15min，所述诱导不定芽培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IAA 0.1mg/L，进行不定芽的诱导和培养15d，带柄子叶周围生成不定芽。

(3)不定芽的伸长：将分化出2cm的不定芽切分，转移至伸长培养基中培养，培养10d，所述伸长培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IAA1.0mg/L+GA₃ 4.0mg/L，所述GA₃置于除菌过滤器内过滤灭菌，待培养基冷却至55℃后使用。

(4)不定芽的生根：将步骤(3)中培养伸长至3cm的不定芽切分，接种至生根培养基中诱导生根，所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.2mg/L，两周长出8条粗壮的根系；

(5)移栽：待生根苗株高为8cm后，去瓶盖培养1d，将生根苗株从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入品氏泥炭土，置于光照培养箱内培养，培养温度为24℃，保持土壤湿润，幼苗成活后移栽至大田。

实施例2

(1)无菌苗的获取：取中国辣椒的种子放置在不锈钢过滤器上，然后放入培养瓶中，加入无菌水，将带有无菌水的培养瓶置于60℃水浴锅中加热40min后，进行灭菌处理，先用80％乙醇震荡3min，然后用无菌水冲洗，再用5％次氯酸钠溶液进行震荡摇晃20min，接着无菌水冲洗6次，最后将灭菌处理后的种子置于无菌滤纸上吸干水分，接种至不添加植物激素的MS培养基上，所述MS培养基为含琼脂和蔗糖的培养基，光照培养得到无菌苗，光照培养时间为14～18h，光照培养强度为2500lux。

(2)不定芽的诱导：取培养17d生长正常的无菌苗，切取1cm带柄子叶作为外植体，接种到灭菌后的诱导不定芽培养基中，将诱导不定芽培养基置于高压蒸汽灭菌锅内，在121℃下灭菌30min，所述诱导不定芽培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IAA 0.1mg/L，进行不定芽的诱导和培养25d，带柄子叶周围生成不定芽。

(3)不定芽的伸长：将分化出3cm的不定芽切分，转移至伸长培养基中培养，培养20d，所述伸长培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IAA 1.0mg/L+GA₃ 4.0mg/L，所述GA₃置于除菌过滤器内过滤灭菌，待培养基冷却至60℃后使用。

(4)不定芽的生根：将步骤(3)中培养伸长至5cm的不定芽切分，接种至生根培养基中诱导生根，所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.2mg/L，两周长出12条粗壮的根系；

(5)移栽：待生根苗株高为12cm后，去瓶盖培养2d，将生根苗株从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入品氏泥炭土，置于光照培养箱内培养，培养温度为26℃，保持土壤湿润，幼苗成活后移栽至大田。

实施例3

(1)无菌苗的获取：取中国辣椒的种子放置在不锈钢过滤器上，然后放入培养瓶中，加入无菌水，将带有无菌水的培养瓶置于55℃水浴锅中加热30min后，进行灭菌处理，先用75％乙醇震荡1min，然后用无菌水冲洗，再用4％次氯酸钠溶液进行震荡摇晃15min，接着无菌水冲洗5次，最后将灭菌处理后的种子置于无菌滤纸上吸干水分，接种至不添加植物激素的MS培养基上，所述MS培养基为含琼脂和蔗糖的培养基，

光照培养得到无菌苗，光照培养时间为16h，光照培养强度为2200lux。

(2)不定芽的诱导：取培养15d生长正常的无菌苗，切取0.8cm带柄子叶作为外植体，接种到灭菌后的诱导不定芽培养基中，将诱导不定芽培养基置于高压蒸汽灭菌锅内，在118℃下灭菌23min，所述诱导不定芽培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IAA 0.1mg/L，进行不定芽的诱导和培养20d，带柄子叶周围生成不定芽。

(3)不定芽的伸长：将分化出2cm的不定芽切分，转移至伸长培养基中培养，培养15d，伸长至4～5cm，所述伸长培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IAA1.0mg/L+GA₃ 4.0mg/L，所述GA₃置于除菌过滤器内过滤灭菌，待培养基冷却至58℃后使用。

(4)不定芽的生根：将步骤(3)中培养伸长至4cm的不定芽切分，接种至生根培养基中诱导生根，所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.2mg/L，两周长出10条粗壮的根系；

(5)移栽：待生根苗株高为10cm后，去瓶盖培养1d，将生根苗株从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入品氏泥炭土，置于光照培养箱内培养，培养温度为25℃，保持土壤湿润，幼苗成活后移栽至大田。

为了进一步验证本发明的有益效果，做了以下对比性验证试验：

一、不同苗龄对不定芽诱导分化的影响

表1

进一步选择13～17天苗龄的无菌苗，不定芽诱导率较高，可达到50％以上，无菌苗的苗越大诱导率越低，但是无菌苗的苗龄过小也不利于愈伤组织和不定芽的形成。

二、不同外植体对不定芽诱导的影响

表2

外植体类型	接种数/个	不定芽数/个	不定芽分化率/％
				子叶	50	5	10
带柄子叶	50	25	50
				下胚轴	50	3	6
节间	50	8	16

通过实验发现，如果将子叶作为外植体，褐化较为严重，能产生少量的愈伤组织，且不定芽诱导率为10％；如果将下胚轴作为外植体，同样存在褐化的问题，能产生大量的愈伤组织，但不定芽诱导率为6％；节间作为外植体诱导分化率也不高。本发明将带柄子叶作为外植体，产生不定芽，不定芽诱导率显著提升，因此带柄子叶作为外植体是中国辣椒诱导不定芽的最佳外植体。

三、不同植物激素及浓度对中国辣椒不定芽诱导的影响

表3不同植物激素对中国辣椒不定芽诱导的影响

表4不同浓度的植物激素对中国辣椒不定芽诱导的影响

通过实验发现，将中国辣椒的子叶、带柄子叶、下胚轴或节间作为外植体，接种在现有技术研究的不同培养基配方中，其褐化严重，不定芽诱导率低(表3)，现有的诱导不定芽培养基配方并不能适用本发明的材料，即现有的配方对中国辣椒的诱导差。

本发明发现6-BA+IAA配方优于6-BA+NAA，6-BA+TDZ以及6-BA+2,4-D。然后通过不同浓度梯度配方的试验，得出最优的培养基配方为；MS+6-BA3.0mg/L+IAA 0.1mg/L，与其它组配比例相比，提升了中国辣椒不定芽诱导率。

四、不同GA₃浓度对不定芽伸长的影响

表5

通过实验发现，不定芽的伸长深刻影响中国辣椒的离体再生，本发明通过实验发现GA₃(赤霉素)有利于中国辣椒不定芽的伸长，通过降低6-BA的浓度，然后添加不同浓度的GA₃，开发出最优配方是MS+6-BA3.0mg/L+IAA1.0mg/L+GA₃ 4.0mg/L，该配方使不定芽的伸长诱导率得到了很大的提升。

五、不同IAA和IBA浓度对诱导根的影响

表6

通过实验发现，生长激素有利于不定根的诱导，常用的诱导生根的激素有IAA，NAA和IBA，通过不同激素的试验发现IAA和IBA生根诱导率更高，然后根据不同浓度的激素梯度IAA的诱导率优于IBA，本发明通过实验发现最佳诱导生根培养基配方为：1/2MS+IAA0.2mg/L。

综上，本发明提供一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，包括无菌苗的获取、不定芽的诱导、不定芽的伸长、不定芽的生根和移栽等步骤。灭菌后的种子接种在不添加植物激素的MS培养基上，选取适宜苗龄无菌苗的带柄子叶作为外植体，带柄子叶在靠近叶柄端出现膨胀，产生不定芽，使得诱导分化率高；研究得到的诱导不定芽培养基和伸长培养基，使中国辣椒不定芽的诱导率和伸长诱导率得到了很大的提升，生根培养基有利于不定根的诱导。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)无菌苗的获取：取中国辣椒的种子放置在过滤器上，然后放入培养瓶中，加入无菌水，水浴加热后，进行灭菌处理，最后将灭菌处理后的种子吸干水分，接种至不添加植物激素的MS培养基上，光照培养得到无菌苗；

(2)不定芽的诱导：取培养13～17d生长正常的无菌苗，切取0.5～1cm带柄子叶作为外植体，接种到灭菌后的诱导不定芽培养基中，进行不定芽的诱导培养，带柄子叶周围生成不定芽；

(3)不定芽的伸长：将分化出2～3cm的不定芽切分，转移至伸长培养基中培养；

(4)不定芽的生根：将步骤(3)中培养伸长至3～5cm的不定芽切分，接种至生根培养基中诱导生根；

2.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，置于50～60℃水浴锅中加热20～40min。

3.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，灭菌处理先用70％～80％乙醇震荡处理1～3min，然后用无菌水冲洗，再加入3％～5％次氯酸钠溶液进行震荡摇晃10～20min，接着无菌水冲洗3～6次。

4.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，光照培养时间为14～18h，光照培养强度为2000～2500lux。

5.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述MS培养基为含琼脂和蔗糖的培养基。

6.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述诱导不定芽培养基为MS+6-BA 3.0mg/L+IAA 0.1mg/L，诱导培养15～25d。

7.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将诱导不定芽培养基置于高压蒸汽灭菌锅内，在115～121℃下灭菌15～30min。

8.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述伸长培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IAA 1.0mg/L+GA₃ 4.0mg/L，培养10～20d，所述GA₃置于除菌过滤器内过滤灭菌,待培养基冷却至55～60℃后使用。

9.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.2mg/L，培养两周后长出8～12条粗壮的根系。

10.根据权利要求1所述的一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述培养箱内温度为24～26℃。