CN108064699A - 一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法 - Google Patents
一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108064699A CN108064699A CN201810134506.XA CN201810134506A CN108064699A CN 108064699 A CN108064699 A CN 108064699A CN 201810134506 A CN201810134506 A CN 201810134506A CN 108064699 A CN108064699 A CN 108064699A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- adventitious bud
- pueraria lobata
- callus
- root
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000219781 Pueraria montana var. lobata Species 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 46
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract 3
- 235000010575 Pueraria lobata Nutrition 0.000 claims description 27
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 27
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 27
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 26
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 240000006859 Jasminum officinale Species 0.000 claims description 14
- 235000010254 Jasminum officinale Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 claims description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 6
- 239000004568 cement Substances 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000010451 perlite Substances 0.000 claims description 4
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 claims description 4
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000032696 parturition Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 claims 1
- 241000219780 Pueraria Species 0.000 abstract description 7
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 abstract 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 26
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 13
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 9
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- ZQSIJRDFPHDXIC-UHFFFAOYSA-N Daidzein Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC=C2C1=O ZQSIJRDFPHDXIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 238000004382 potting Methods 0.000 description 3
- RXUWDKBZZLIASQ-UHFFFAOYSA-N Puerarin Natural products OCC1OC(Oc2c(O)cc(O)c3C(=O)C(=COc23)c4ccc(O)cc4)C(O)C(O)C1O RXUWDKBZZLIASQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- HKEAFJYKMMKDOR-VPRICQMDSA-N puerarin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=C(O)C=CC(C2=O)=C1OC=C2C1=CC=C(O)C=C1 HKEAFJYKMMKDOR-VPRICQMDSA-N 0.000 description 2
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- GMTUGPYJRUMVTC-UHFFFAOYSA-N Daidzin Natural products OC(COc1ccc2C(=O)C(=COc2c1)c3ccc(O)cc3)C(O)C(O)C(O)C=O GMTUGPYJRUMVTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KYQZWONCHDNPDP-UHFFFAOYSA-N Daidzoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 KYQZWONCHDNPDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N Hyoscine Natural products C1([C@H](CO)C(=O)OC2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-GAUPFVANSA-N 0.000 description 1
- 241001126925 Lobata Species 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-scopolamin Natural products C1C(C2C3O2)N(C)C3CC1OC(=O)C(CO)C1=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041591 Spinal osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036319 cervical spondylosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000007240 daidzein Nutrition 0.000 description 1
- KYQZWONCHDNPDP-QNDFHXLGSA-N daidzein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 KYQZWONCHDNPDP-QNDFHXLGSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N scopolamine Chemical compound C1([C@@H](CO)C(=O)O[C@H]2C[C@@H]3N([C@H](C2)[C@@H]2[C@H]3O2)C)=CC=CC=C1 STECJAGHUSJQJN-FWXGHANASA-N 0.000 description 1
- 229960002646 scopolamine Drugs 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 208000005801 spondylosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 description 1
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明涉及一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法，其利用葛根植物茎段的薄切片为外植体，通过愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增殖、生根培养和可选的壮苗培养步骤完成，其利用薄切片为外植体，用较低的植物激素浓度即可容易的诱导出愈伤组织，而且其在不定芽诱导培养基中添加有鲜葛根粗提物，可以促进愈伤组织更好的诱导分化出不定芽，并且有利于不定芽更好的生长发育。
Description
技术领域
本发明属于植物组织离体培养繁殖领域，更具体涉及一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法。
背景技术
葛根通常指植物野葛(Pueraria lobata)的块根，也可用植物粉葛的块根，(Puerariae lobata var.Thomsonii)，这两种植物都是豆科(Leguminosae)葛属(Pueraria)植物，多年生藤本。葛根是药食两用的优质植物材料，其根、茎、叶、花都可入药，葛根块根中的有效成分已发现有：葛根素、大豆苷、大豆苷元、总黄酮。葛根作为中药被用于多种疾病的治疗，例如：急性心肌梗塞、不稳定性心绞痛、高粘血症、急性脑梗塞、颈椎病等疾病，其对东莨菪碱和乙醇引起的记忆障碍具有对抗作用，因此对葛根的需求量很大。葛根传统的繁殖方法为种子播种繁殖和扦插或压条繁殖，但葛根的种子很难得到且发芽率又不高，扦插繁殖繁殖系数不够高。因此也发展了通过组织培养繁殖葛根的方法：现有的组织培养技术主要利用葛根植物的茎、叶来诱导形成愈伤组织，也有利用根、子叶、叶柄等外植体诱导愈伤组织的，之后再诱导愈伤组织分化成芽，经过增殖、生根完成再生苗过程。但不同的外植体，外植体取材时期的不同，适合的激素组合也不同，有很大差异，具体适合的激素浓度差别也较大。而且现有技术中常用的激素是6-BA配合NAA组合使用，模式比较单一。因此本发明提供一种新的葛根植物的组织离体培养快繁方法，以解决优质葛根种苗的需求。
发明内容
本发明目的是提供一种葛根植物的组织离体培养快繁方法，利用植物组织培养技术，提高野葛和粉葛的繁殖系数及成功率，快速繁殖出遗传性状稳定的葛根种苗。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种葛根植物的组织离体培养快繁方法，包括如下步骤：
(1)愈伤组织诱导：以当年生葛根植物茎段的薄切片为外植体，在配方为：MS+2,4-D0.6-0.9mg/L+KT 0.1-0.3mg/L的愈伤组织诱导培养基上培养，培养温度20-22℃，黑暗条件下培养，愈伤组织诱导培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂，pH值5.9-6.2；
(2)将步骤(1)得到的愈伤组织转移到配方为：MS+6-BA 1.2-1.8mg/L+NAA 0.01-0.05mg/L+鲜葛根块根粗提物0.5-3g/L的不定芽诱导培养基上培养，培养温度22-25℃，光照强度1800-2000LX，不定芽诱导培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂，pH值6.0-6.2；
(3)将步骤(2)得到的不定芽转移到配方为：MS+6-BA 1.5-2.5mg/L+NAA 0.5-1.0mg/L的增殖培养基上增殖培养得到许多不定芽，增殖培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂，pH值6.0-6.2；
(4)可选的，将步骤(3)得到的细弱不定芽转移到配方为：MS+GA3 1.0-3.0mg/L的壮苗培养基上培养一段时间，培养的培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，壮苗培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂，pH值6.0-6.2；
(5)将步骤(3)或(4)得到的粗壮不定芽切分成单芽，接种到配方为：1/2MS+NAA0.1-1.0mg/L的生根培养基中诱导生根，培养的培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，得到完整的再生苗，生根培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂，pH值5.8-6.2。
本发明的方法适用于野葛植物，也适用于植物粉葛。
本发明选用优良的葛根品种，例如淀粉含量高或者葛根素含量高的品种，或者选用野生的、健壮葛根植物，选取其当年生茎段，幼嫩茎段或者成熟茎段均可，优选半木质化茎段。将采集的茎段用自来水冲洗干净后晾干，在超净工作台内用体积分数70％左右的乙醇表面消毒处理10-30秒，无菌水冲洗几次，再用0.1％氯化汞浸泡3-8分钟，无菌水冲洗几次，无菌滤纸吸干表面水分，获得无菌茎段；之后用无菌薄刀片将无菌茎段切成薄片，薄片厚度在1-3mm之间，从而得到用于接种的外植体。
外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，黑暗条件下培养3-5天后，薄片膨大产生愈伤组织，10-12天后形成明显的愈伤组织团，颜色嫩绿、质地松脆。
上述步骤(2)中的鲜野葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根，去皮切成小块，加适量水研磨成泥糊状，加水量为约10ml/100g块根。
本发明的培养基中蔗糖含量为20-30g/L，凝固剂选自琼脂、植物凝胶等，用量为5-8g/L，可根据培养基的硬度调整。
本发明发现葛根组织培养物在发育成不定芽以后，在pH值偏高的培养基长势更好，而且各培养基优选的pH值范围在5.9-6.2，尤其是发育成不定芽以后，更优选的pH值为6.1。
本发明的方法还包括后续的炼苗移栽步骤。待苗高4cm以上时，打开瓶盖，置于半阴处3-5天，之后取出组培苗洗净根部培养基，移栽到基质中，基质可由蛭石、珍珠岩配制而成，移栽初期要常浇水，保持湿度和水分。蛭石、珍珠岩比例约为1:3。
本发明选用茎段薄切片作为诱导愈伤组织的外植体，意外的发现其更容易诱导出愈伤组织，而且筛选出了适合该外植体的培养基配方，发现使用较低浓度的2,4-D和KT即能很好的诱导愈伤组织的产生，提高了培养效率。
本发明的不定芽诱导培养基中添加有鲜葛根粗提物，由于葛根粗提物中含有丰富的有机活性物质，因此有利于愈伤组织更好的诱导分化出不定芽，而且由于营养更丰富，不定芽的长势也比在未添加粗提物的培养基上好。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明；
实施实例1
选取盆栽的优良健壮野葛，在温室大棚栽培，待其藤蔓长至1m以上时取材，取正常成熟的葛藤，剪去叶片、叶柄，切成3-5cm长的茎段，将采集的茎段用自来水冲洗干净后晾干，在超净工作台内用体积分数70％的乙醇表面消毒处理30秒，无菌水冲洗2-3次，再用0.1％氯化汞浸泡8分钟，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸干表面水分，获得无菌茎段；之后用消毒后的手术刀将无菌茎段切成约1mm厚的薄片。
薄片切成后即接种在配方为：MS+2,4-D 0.9mg/L+KT 0.3mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为5.9的愈伤组织诱导培养基上培养，培养温度20-22℃，黑暗条件下培养。
培养4-5天后，薄片膨大产生愈伤组织，12-14天后形成明显的愈伤组织团，颜色嫩绿、质地松脆。将该愈伤组织接种到配方为：MS+6-BA 1.8mg/L+NAA 0.05mg/L+鲜野葛块根粗提物3g/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0的不定芽诱导培养基上培养，培养温度22-25℃，光照强度1800-2000LX，鲜野葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根，去皮切成小块，取100g块根加10ml水研磨成泥糊状得到的。
愈伤组织培养约2周后有绿色芽点出现，继续培养1-2周，形成多个不定芽，将得到的不定芽转移到配方为：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0的增殖培养基上，培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，隔2周左右继代一次，及时剔除被污染的苗，继代3-5次得到足够量的无根不定芽。
将得到的较粗壮的不定芽，接种到配方为：1/2MS+NAA 1.0mg/L蔗糖20g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0的生根培养基中诱导生根，得到完整的再生苗，生根培养的培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX。
实施例2
选取盆栽的优良健壮野葛，在温室大棚栽培，待其藤蔓长至1m以上时取材，取生长旺盛的半木质化葛藤，剪去叶片、叶柄，切成2-3cm长的茎段，将采集的茎段用自来水冲洗干净后晾干，在超净工作台内用体积分数70％的乙醇表面消毒处理20秒，无菌水冲洗1-2次，再用0.1％氯化汞浸泡5分钟，无菌水冲洗3-4次，无菌滤纸吸干表面水分，获得无菌茎段；之后用消毒后的手术刀将无菌茎段切成约2mm厚的薄片。
薄片切成后即接种在配方为：MS+2,4-D 0.6mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为5.9的愈伤组织诱导培养基上培养，培养温度20-22℃，黑暗条件下培养。
培养3-5天后，薄片膨大产生愈伤组织，10-12天后形成明显的愈伤组织团，颜色嫩绿、质地松脆。将该愈伤组织接种到配方为：MS+6-BA 1.2mg/L+NAA 0.01mg/L+鲜野葛块根粗提物0.5g/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0的不定芽诱导培养基上培养，培养温度22-25℃，光照强度1800-2000LX，鲜野葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根，去皮切成小块，取100g块根加10ml水研磨成泥糊状得到的。
愈伤组织培养约2周后有绿色芽点出现，继续培养1-2周，形成多个不定芽，将得到的不定芽转移到配方为：MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0的增殖培养基上，培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，隔2周左右继代一次，及时剔除被污染的苗，继代3-5次。
将继代得到的不定芽中细弱的小苗转移到配方为：MS+GA3 1.0mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.1的壮苗培养基上培养1-2周，培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，得到较粗壮的不定芽。
将得到的较粗壮的不定芽，接种到配方为：1/2MS+NAA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0的生根培养基中诱导生根，得到完整的再生苗，生根培养的培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX。
实施例3
野外选取生长健壮的野葛，在其当年生藤蔓上截取半木质化葛藤，剪去叶片、叶柄，切成2-3cm长的茎段，自来水冲洗后用添加了洗洁精的溶液彻底浸泡清洗，之后再用自来水冲洗干净、晾干，在超净工作台内，用体积分数70％的乙醇表面消毒处理30秒，无菌水冲洗1-2次，再用0.1％氯化汞浸泡6分钟，无菌水冲洗3-4次，无菌滤纸吸干表面水分，获得无菌茎段；之后用消毒后的手术刀将无菌茎段切成约3mm厚的薄片。
薄片切成后即接种在配方为：MS+2,4-D 0.8mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为5.9的愈伤组织诱导培养基上培养，培养温度20-22℃，黑暗条件下培养。
培养3-5天后，薄片膨大产生愈伤组织，10-12天后形成明显的愈伤组织团，颜色嫩绿、质地松脆。将该愈伤组织接种到配方为：MS+6-BA 1.6mg/L+NAA 0.03mg/L+鲜野葛块根粗提物2.0g/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0的不定芽诱导培养基上培养，培养温度22-25℃，光照强度1800-2000LX，鲜野葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根，去皮切成小块，取100g加10ml水研磨成泥糊状得到的。
愈伤组织培养约2周后有绿色芽点出现，继续培养1-2周，形成多个不定芽，将得到的不定芽转移到配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.7mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.1的增殖培养基上，培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，隔2周左右继代一次，及时剔除被污染的苗，继代3-5次。
将继代得到的不定芽中，细弱的小苗转移到配方为：MS+GA3 2.0mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.1的壮苗培养基上培养1-2周，培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，得到较粗壮的不定芽。
将得到的较粗壮的不定芽，接种到配方为：1/2MS+NAA 0.8mg/L+蔗糖20g/L+6g/L琼脂，pH值为6.1的生根培养基中诱导生根，得到完整的再生苗，生根培养的培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX。
实施实例4
选取盆栽的优良健壮粉葛，在温室大棚栽培，待其藤蔓长至1m以上时取材，取正常成熟的葛藤，剪去叶片、叶柄，切成3-5cm长的茎段，将采集的茎段用自来水冲洗干净后晾干，在超净工作台内用体积分数70％的乙醇表面消毒处理30秒，无菌水冲洗2-3次，再用0.1％氯化汞浸泡8分钟，无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸干表面水分，获得无菌茎段；之后用消毒后的手术刀将无菌茎段切成约2mm厚的薄片。
薄片切成后即接种在配方为：MS+2,4-D 0.8mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为5.9的愈伤组织诱导培养基上培养，培养温度20-22℃，黑暗条件下培养。
培养4-5天后，薄片膨大产生愈伤组织，12-14天后形成明显的愈伤组织团，颜色嫩绿、质地松脆。将该愈伤组织接种到配方为：MS+6-BA 1.6mg/L+NAA 0.03mg/L+鲜粉葛块根粗提物2g/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0的不定芽诱导培养基上培养，培养温度22-25℃，光照强度1800-2000LX，鲜粉葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根，去皮切成小块，取100g块根加10ml水研磨成泥糊状得到的。
愈伤组织培养约2周后有绿色芽点出现，继续培养1-2周，形成多个不定芽，将得到的不定芽转移到配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.7mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.1的增殖培养基上，培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，隔2周左右继代一次，及时剔除被污染的苗，继代3次。
将继代得到的不定芽中，细弱的小苗转移到配方为：MS+GA3 3.0mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.1的壮苗培养基上培养1-2周，培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，得到较为粗壮的不定芽。
将得到的较粗壮的不定芽，接种到配方为：1/2MS+NAA 1.0mg/L+蔗糖20g/L+6g/L琼脂，pH值为6.1的生根培养基中诱导生根，得到完整的再生苗，生根培养的培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX。
对比例1
在实施例2的基础上，用如下培养基配方：MS+6-BA 1.2mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂，pH值为6.0替换其不定芽诱导培养基配方，其它条件相同，比较其不定芽诱导效果。实施例2和对比例1分别接种10个培养皿，每个培养皿接种10块大小基本一致的愈伤组织，相同的培养条件下培养一个月后，记录两种不同培养基每个培养皿上诱导出不定芽的愈伤块数量，以及不定芽高度，最终简单统计出整体的出芽率和平均出芽高度，结果如下：
表1：鲜葛根粗提物对愈伤组织诱导不定芽的影响
| 接种愈伤数 | 出芽愈伤数 | 不定芽出芽率 | 不定芽平均高度(cm) | |
| 实施例2 | 100 | 96 | 96％ | 1.5 |
| 对比例1 | 100 | 89 | 89％ | 1.2 |
结果表明，添加了鲜葛根粗提物的不定芽诱导培养基能更好的诱导愈伤组织分化出不定芽，而且不定芽的长势略高。
Claims (7)
1.一种葛根植物的组织离体培养快繁方法，包括以下步骤：
(1)愈伤组织诱导：以当年生葛根植物茎段的薄切片为外植体，在配方为：MS+2,4-D0.6-0.9mg/L+KT 0.1-0.3mg/L的愈伤组织诱导培养基上培养，培养温度20-22℃，黑暗条件下培养，该培养基pH值5.9-6.2；
(2)不定芽分化：将步骤(1)得到的愈伤组织转移到配方为：MS+6-BA 1.2-1.8mg/L+NAA0.01-0.05mg/L+鲜葛根块根粗提物0.5-3g/L的不定芽诱导培养基上培养，培养温度22-25℃，光照强度1800-2000LX，该培养基pH值6.0-6.2；
(3)不定芽增殖：将步骤(2)得到的不定芽转移到配方为：MS+6-BA 1.5-2.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L的增殖培养基上增殖培养得到许多不定芽，培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，该培养基pH值6.0-6.2；
(4)壮苗培养：可选的，将步骤(3)得到的细弱不定芽转移到配方为：MS+GA3 1.0-3.0mg/L的壮苗培养基上培养一段时间，培养的培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，该培养基pH值6.0-6.2；
(5)生根：将步骤(3)或(4)得到的粗壮不定芽切分成单芽，接种到配方为：1/2MS+NAA0.1-1.0mg/L的生根培养基中诱导生根，培养的培养温度23-25℃，光照强度2000-2200LX，得到完整的再生苗，该培养基pH值5.8-6.2；
上述各培养基都含有适量的蔗糖和凝固剂。
2.根据权利要求1的方法，所述薄切片厚度为1‐3mm。
3.根据权利要求1的方法，所述薄切片厚度为约2mm。
4.根据权利要求1的方法，所述葛根植物是野葛或粉葛。
5.根据权利要求1的方法，所述鲜葛根块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根，去皮切成小块，加适量水研磨成泥糊状得到的，加水量为约10ml/100g块根。
6.根据权利要求1的方法，其还包括炼苗移栽步骤：待苗高4cm以上时，打开瓶盖，置于半阴处3‐5天，之后取出组培苗洗净根部培养基，移栽到基质中，基质蛭石、珍珠岩配制而成，蛭石、珍珠岩比例约为1:3。
7.根据权利要求1‐6任一项所述的方法，所述愈伤组织诱导培养基配方为：MS+2,4‐D0.8mg/L+KT 0.2mg/L；不定芽诱导培养基配方为：MS+6‐BA 1.6mg/L+NAA 0.03mg/L+鲜葛根块根粗提物2.0g/L；增殖培养基配方为：MS+6‐BA 2.0mg/L+NAA 0.7mg/L；壮苗培养基配方为：MS+GA3 2.0mg/L；生根培养基配方为：1/2MS+NAA 0.8mg/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810134506.XA CN108064699B (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810134506.XA CN108064699B (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108064699A true CN108064699A (zh) | 2018-05-25 |
| CN108064699B CN108064699B (zh) | 2021-06-08 |
Family
ID=62155235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810134506.XA Active CN108064699B (zh) | 2018-02-09 | 2018-02-09 | 一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108064699B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111990255A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-11-27 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种葛根组培苗叶片愈伤组织诱导及再生方法 |
| CN112715358A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-30 | 贵州大学 | 一种粉葛愈伤组织的诱导方法 |
| WO2021179527A1 (zh) * | 2020-03-13 | 2021-09-16 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种粉葛单芽茎段增殖及一步成苗培养方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1403572A (zh) * | 2002-10-17 | 2003-03-19 | 华南师范大学 | 采用植物细胞工程生产葛根素的方法 |
-
2018
- 2018-02-09 CN CN201810134506.XA patent/CN108064699B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1403572A (zh) * | 2002-10-17 | 2003-03-19 | 华南师范大学 | 采用植物细胞工程生产葛根素的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| BINDU T.K. ET AL.: "In vitro propagation of Pueraria tuberosa (Roxb. ex Willd.) DC.", 《TROPICAL PLANT RESEARCH》 * |
| 洪森荣等: "野葛叶片和茎段高频再生体系的建立", 《植物研究》 * |
| 洪森荣等: "野葛愈伤组织诱导及分化的研究", 《安徽农业科学》 * |
| 王义强等: "野葛愈伤组织诱导与不定芽分化", 《经济林研究》 * |
| 王胜利等: "葛根的组织培养研究", 《江苏农业科学》 * |
| 马崇坚等: "粉葛种苗离体繁殖技术初步研究", 《广东农业科学》 * |
| 魏世清等: "野葛(Pueraria lobata)愈伤组织诱导及组织培养", 《西南农业大学学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021179527A1 (zh) * | 2020-03-13 | 2021-09-16 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种粉葛单芽茎段增殖及一步成苗培养方法 |
| CN111990255A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-11-27 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种葛根组培苗叶片愈伤组织诱导及再生方法 |
| CN111990255B (zh) * | 2020-08-31 | 2021-11-02 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种葛根组培苗叶片愈伤组织诱导及再生方法 |
| CN112715358A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-04-30 | 贵州大学 | 一种粉葛愈伤组织的诱导方法 |
| CN112715358B (zh) * | 2020-12-29 | 2022-11-01 | 贵州大学 | 一种粉葛愈伤组织的诱导方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108064699B (zh) | 2021-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103444552B (zh) | 一种诱导茄子花药再生单倍体植株的方法 | |
| CN113661924B (zh) | 保亭花的组培快速繁殖方法 | |
| CN115316273B (zh) | 一种安吉白茶组织培养快速繁殖的方法 | |
| CN102907318A (zh) | 一种利用生物反应器培养体细胞胚快繁三七再生植株的方法 | |
| CN108064699A (zh) | 一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法 | |
| CN111727884B (zh) | 一种圆锥绣球的离体芽培养方法 | |
| CN109258469A (zh) | 一种中国辣椒带柄子叶诱导再生植株的方法 | |
| CN108770692A (zh) | 椰子胚诱导培养基和基于椰子合子胚细胞薄层培养获得离体再生植株的方法 | |
| CN110800609B (zh) | 一种利用胚性愈伤组织进行钻喙兰人工快繁的方法 | |
| CN110972938B (zh) | 一种快速繁殖黄精试管苗的方法 | |
| CN108575746A (zh) | 一种芍药离体再生体系建立方法 | |
| CN110402818B (zh) | 一种优种板栗成熟胚组织培养快繁育苗的方法 | |
| CN104429940B (zh) | 一种获得草莓脱毒苗的方法 | |
| CN114600772B (zh) | 一种深山含笑的组培方法和快速繁殖方法 | |
| CN103416302A (zh) | 桂花体细胞胚再生植株的方法 | |
| CN115885855A (zh) | 一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法 | |
| CN101828525B (zh) | 一种通过胚抢救获得植物嫁接嵌合体后代的方法 | |
| CN114424749A (zh) | 一种山麦冬离体快繁方法 | |
| CN109548655B (zh) | 苦郎树的组织培养方法 | |
| Roy et al. | In vitro propagation and establishment of a new cultivar of jackfruit (Artocarpus heterophyllus) bearing fruits twice yearly | |
| CN108782244B (zh) | 一种龙珠果组织培养方法 | |
| KR101971978B1 (ko) | 체세포배 발생 및 식물의 재분화 기술을 이용한 모과나무의 무성번식 방법 | |
| CN107125135B (zh) | 一种利用花序轴高效诱导大蒜胚性愈伤组织的方法 | |
| CN104542302A (zh) | 一种通关藤的快速繁殖方法 | |
| CN102812903A (zh) | 一种通过茎尖细胞层重排对嵌合体彩叶植物进行种质创新的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20210524 Address after: 221200 No.6, Lanshan street, Lanshan Town, Suining County, Xuzhou City, Jiangsu Province Applicant after: Jiangsu Yulin Agricultural Science and Technology Development Co.,Ltd. Address before: 242000 No.7, Yinhe lane, Shijie Town, Guangde County, Xuancheng City, Anhui Province Applicant before: Zhou Changsheng |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |