CN108064699A - 一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法,其利用葛根植物茎段的薄切片为外植体,通过愈伤组织诱导、不定芽诱导、不定芽增殖、生根培养和可选的壮苗培养步骤完成,其利用薄切片为外植体,用较低的植物激素浓度即可容易的诱导出愈伤组织,而且其在不定芽诱导培养基中添加有鲜葛根粗提物,可以促进愈伤组织更好的诱导分化出不定芽,并且有利于不定芽更好的生长发育。
Description
技术领域
本发明属于植物组织离体培养繁殖领域,更具体涉及一种葛根植物的组织离体培养繁殖方法。
背景技术
葛根通常指植物野葛(Pueraria lobata)的块根,也可用植物粉葛的块根,(Puerariae lobata var.Thomsonii),这两种植物都是豆科(Leguminosae)葛属(Pueraria)植物,多年生藤本。葛根是药食两用的优质植物材料,其根、茎、叶、花都可入药,葛根块根中的有效成分已发现有:葛根素、大豆苷、大豆苷元、总黄酮。葛根作为中药被用于多种疾病的治疗,例如:急性心肌梗塞、不稳定性心绞痛、高粘血症、急性脑梗塞、颈椎病等疾病,其对东莨菪碱和乙醇引起的记忆障碍具有对抗作用,因此对葛根的需求量很大。葛根传统的繁殖方法为种子播种繁殖和扦插或压条繁殖,但葛根的种子很难得到且发芽率又不高,扦插繁殖繁殖系数不够高。因此也发展了通过组织培养繁殖葛根的方法:现有的组织培养技术主要利用葛根植物的茎、叶来诱导形成愈伤组织,也有利用根、子叶、叶柄等外植体诱导愈伤组织的,之后再诱导愈伤组织分化成芽,经过增殖、生根完成再生苗过程。但不同的外植体,外植体取材时期的不同,适合的激素组合也不同,有很大差异,具体适合的激素浓度差别也较大。而且现有技术中常用的激素是6-BA配合NAA组合使用,模式比较单一。因此本发明提供一种新的葛根植物的组织离体培养快繁方法,以解决优质葛根种苗的需求。
发明内容
本发明目的是提供一种葛根植物的组织离体培养快繁方法,利用植物组织培养技术,提高野葛和粉葛的繁殖系数及成功率,快速繁殖出遗传性状稳定的葛根种苗。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:一种葛根植物的组织离体培养快繁方法,包括如下步骤:
(1)愈伤组织诱导:以当年生葛根植物茎段的薄切片为外植体,在配方为:MS+2,4-D0.6-0.9mg/L+KT 0.1-0.3mg/L的愈伤组织诱导培养基上培养,培养温度20-22℃,黑暗条件下培养,愈伤组织诱导培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂,pH值5.9-6.2;
(2)将步骤(1)得到的愈伤组织转移到配方为:MS+6-BA 1.2-1.8mg/L+NAA 0.01-0.05mg/L+鲜葛根块根粗提物0.5-3g/L的不定芽诱导培养基上培养,培养温度22-25℃,光照强度1800-2000LX,不定芽诱导培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂,pH值6.0-6.2;
(3)将步骤(2)得到的不定芽转移到配方为:MS+6-BA 1.5-2.5mg/L+NAA 0.5-1.0mg/L的增殖培养基上增殖培养得到许多不定芽,增殖培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂,pH值6.0-6.2;
(4)可选的,将步骤(3)得到的细弱不定芽转移到配方为:MS+GA3 1.0-3.0mg/L的壮苗培养基上培养一段时间,培养的培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,壮苗培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂,pH值6.0-6.2;
(5)将步骤(3)或(4)得到的粗壮不定芽切分成单芽,接种到配方为:1/2MS+NAA0.1-1.0mg/L的生根培养基中诱导生根,培养的培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,得到完整的再生苗,生根培养基中包含适量的蔗糖和凝固剂,pH值5.8-6.2。
本发明的方法适用于野葛植物,也适用于植物粉葛。
本发明选用优良的葛根品种,例如淀粉含量高或者葛根素含量高的品种,或者选用野生的、健壮葛根植物,选取其当年生茎段,幼嫩茎段或者成熟茎段均可,优选半木质化茎段。将采集的茎段用自来水冲洗干净后晾干,在超净工作台内用体积分数70%左右的乙醇表面消毒处理10-30秒,无菌水冲洗几次,再用0.1%氯化汞浸泡3-8分钟,无菌水冲洗几次,无菌滤纸吸干表面水分,获得无菌茎段;之后用无菌薄刀片将无菌茎段切成薄片,薄片厚度在1-3mm之间,从而得到用于接种的外植体。
外植体接种在愈伤组织诱导培养基上,黑暗条件下培养3-5天后,薄片膨大产生愈伤组织,10-12天后形成明显的愈伤组织团,颜色嫩绿、质地松脆。
上述步骤(2)中的鲜野葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根,去皮切成小块,加适量水研磨成泥糊状,加水量为约10ml/100g块根。
本发明的培养基中蔗糖含量为20-30g/L,凝固剂选自琼脂、植物凝胶等,用量为5-8g/L,可根据培养基的硬度调整。
本发明发现葛根组织培养物在发育成不定芽以后,在pH值偏高的培养基长势更好,而且各培养基优选的pH值范围在5.9-6.2,尤其是发育成不定芽以后,更优选的pH值为6.1。
本发明的方法还包括后续的炼苗移栽步骤。待苗高4cm以上时,打开瓶盖,置于半阴处3-5天,之后取出组培苗洗净根部培养基,移栽到基质中,基质可由蛭石、珍珠岩配制而成,移栽初期要常浇水,保持湿度和水分。蛭石、珍珠岩比例约为1:3。
本发明选用茎段薄切片作为诱导愈伤组织的外植体,意外的发现其更容易诱导出愈伤组织,而且筛选出了适合该外植体的培养基配方,发现使用较低浓度的2,4-D和KT即能很好的诱导愈伤组织的产生,提高了培养效率。
本发明的不定芽诱导培养基中添加有鲜葛根粗提物,由于葛根粗提物中含有丰富的有机活性物质,因此有利于愈伤组织更好的诱导分化出不定芽,而且由于营养更丰富,不定芽的长势也比在未添加粗提物的培养基上好。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明;
实施实例1
选取盆栽的优良健壮野葛,在温室大棚栽培,待其藤蔓长至1m以上时取材,取正常成熟的葛藤,剪去叶片、叶柄,切成3-5cm长的茎段,将采集的茎段用自来水冲洗干净后晾干,在超净工作台内用体积分数70%的乙醇表面消毒处理30秒,无菌水冲洗2-3次,再用0.1%氯化汞浸泡8分钟,无菌水冲洗4-5次,无菌滤纸吸干表面水分,获得无菌茎段;之后用消毒后的手术刀将无菌茎段切成约1mm厚的薄片。
薄片切成后即接种在配方为:MS+2,4-D 0.9mg/L+KT 0.3mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为5.9的愈伤组织诱导培养基上培养,培养温度20-22℃,黑暗条件下培养。
培养4-5天后,薄片膨大产生愈伤组织,12-14天后形成明显的愈伤组织团,颜色嫩绿、质地松脆。将该愈伤组织接种到配方为:MS+6-BA 1.8mg/L+NAA 0.05mg/L+鲜野葛块根粗提物3g/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0的不定芽诱导培养基上培养,培养温度22-25℃,光照强度1800-2000LX,鲜野葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根,去皮切成小块,取100g块根加10ml水研磨成泥糊状得到的。
愈伤组织培养约2周后有绿色芽点出现,继续培养1-2周,形成多个不定芽,将得到的不定芽转移到配方为:MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0的增殖培养基上,培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,隔2周左右继代一次,及时剔除被污染的苗,继代3-5次得到足够量的无根不定芽。
将得到的较粗壮的不定芽,接种到配方为:1/2MS+NAA 1.0mg/L蔗糖20g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0的生根培养基中诱导生根,得到完整的再生苗,生根培养的培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX。
实施例2
选取盆栽的优良健壮野葛,在温室大棚栽培,待其藤蔓长至1m以上时取材,取生长旺盛的半木质化葛藤,剪去叶片、叶柄,切成2-3cm长的茎段,将采集的茎段用自来水冲洗干净后晾干,在超净工作台内用体积分数70%的乙醇表面消毒处理20秒,无菌水冲洗1-2次,再用0.1%氯化汞浸泡5分钟,无菌水冲洗3-4次,无菌滤纸吸干表面水分,获得无菌茎段;之后用消毒后的手术刀将无菌茎段切成约2mm厚的薄片。
薄片切成后即接种在配方为:MS+2,4-D 0.6mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为5.9的愈伤组织诱导培养基上培养,培养温度20-22℃,黑暗条件下培养。
培养3-5天后,薄片膨大产生愈伤组织,10-12天后形成明显的愈伤组织团,颜色嫩绿、质地松脆。将该愈伤组织接种到配方为:MS+6-BA 1.2mg/L+NAA 0.01mg/L+鲜野葛块根粗提物0.5g/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0的不定芽诱导培养基上培养,培养温度22-25℃,光照强度1800-2000LX,鲜野葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根,去皮切成小块,取100g块根加10ml水研磨成泥糊状得到的。
愈伤组织培养约2周后有绿色芽点出现,继续培养1-2周,形成多个不定芽,将得到的不定芽转移到配方为:MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0的增殖培养基上,培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,隔2周左右继代一次,及时剔除被污染的苗,继代3-5次。
将继代得到的不定芽中细弱的小苗转移到配方为:MS+GA3 1.0mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.1的壮苗培养基上培养1-2周,培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,得到较粗壮的不定芽。
将得到的较粗壮的不定芽,接种到配方为:1/2MS+NAA 0.1mg/L+蔗糖20g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0的生根培养基中诱导生根,得到完整的再生苗,生根培养的培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX。
实施例3
野外选取生长健壮的野葛,在其当年生藤蔓上截取半木质化葛藤,剪去叶片、叶柄,切成2-3cm长的茎段,自来水冲洗后用添加了洗洁精的溶液彻底浸泡清洗,之后再用自来水冲洗干净、晾干,在超净工作台内,用体积分数70%的乙醇表面消毒处理30秒,无菌水冲洗1-2次,再用0.1%氯化汞浸泡6分钟,无菌水冲洗3-4次,无菌滤纸吸干表面水分,获得无菌茎段;之后用消毒后的手术刀将无菌茎段切成约3mm厚的薄片。
薄片切成后即接种在配方为:MS+2,4-D 0.8mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为5.9的愈伤组织诱导培养基上培养,培养温度20-22℃,黑暗条件下培养。
培养3-5天后,薄片膨大产生愈伤组织,10-12天后形成明显的愈伤组织团,颜色嫩绿、质地松脆。将该愈伤组织接种到配方为:MS+6-BA 1.6mg/L+NAA 0.03mg/L+鲜野葛块根粗提物2.0g/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0的不定芽诱导培养基上培养,培养温度22-25℃,光照强度1800-2000LX,鲜野葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根,去皮切成小块,取100g加10ml水研磨成泥糊状得到的。
愈伤组织培养约2周后有绿色芽点出现,继续培养1-2周,形成多个不定芽,将得到的不定芽转移到配方为:MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.7mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.1的增殖培养基上,培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,隔2周左右继代一次,及时剔除被污染的苗,继代3-5次。
将继代得到的不定芽中,细弱的小苗转移到配方为:MS+GA3 2.0mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.1的壮苗培养基上培养1-2周,培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,得到较粗壮的不定芽。
将得到的较粗壮的不定芽,接种到配方为:1/2MS+NAA 0.8mg/L+蔗糖20g/L+6g/L琼脂,pH值为6.1的生根培养基中诱导生根,得到完整的再生苗,生根培养的培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX。
实施实例4
选取盆栽的优良健壮粉葛,在温室大棚栽培,待其藤蔓长至1m以上时取材,取正常成熟的葛藤,剪去叶片、叶柄,切成3-5cm长的茎段,将采集的茎段用自来水冲洗干净后晾干,在超净工作台内用体积分数70%的乙醇表面消毒处理30秒,无菌水冲洗2-3次,再用0.1%氯化汞浸泡8分钟,无菌水冲洗4-5次,无菌滤纸吸干表面水分,获得无菌茎段;之后用消毒后的手术刀将无菌茎段切成约2mm厚的薄片。
薄片切成后即接种在配方为:MS+2,4-D 0.8mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为5.9的愈伤组织诱导培养基上培养,培养温度20-22℃,黑暗条件下培养。
培养4-5天后,薄片膨大产生愈伤组织,12-14天后形成明显的愈伤组织团,颜色嫩绿、质地松脆。将该愈伤组织接种到配方为:MS+6-BA 1.6mg/L+NAA 0.03mg/L+鲜粉葛块根粗提物2g/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0的不定芽诱导培养基上培养,培养温度22-25℃,光照强度1800-2000LX,鲜粉葛块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根,去皮切成小块,取100g块根加10ml水研磨成泥糊状得到的。
愈伤组织培养约2周后有绿色芽点出现,继续培养1-2周,形成多个不定芽,将得到的不定芽转移到配方为:MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.7mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.1的增殖培养基上,培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,隔2周左右继代一次,及时剔除被污染的苗,继代3次。
将继代得到的不定芽中,细弱的小苗转移到配方为:MS+GA3 3.0mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.1的壮苗培养基上培养1-2周,培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,得到较为粗壮的不定芽。
将得到的较粗壮的不定芽,接种到配方为:1/2MS+NAA 1.0mg/L+蔗糖20g/L+6g/L琼脂,pH值为6.1的生根培养基中诱导生根,得到完整的再生苗,生根培养的培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX。
对比例1
在实施例2的基础上,用如下培养基配方:MS+6-BA 1.2mg/L+NAA 0.01mg/L+蔗糖30g/L+6g/L琼脂,pH值为6.0替换其不定芽诱导培养基配方,其它条件相同,比较其不定芽诱导效果。实施例2和对比例1分别接种10个培养皿,每个培养皿接种10块大小基本一致的愈伤组织,相同的培养条件下培养一个月后,记录两种不同培养基每个培养皿上诱导出不定芽的愈伤块数量,以及不定芽高度,最终简单统计出整体的出芽率和平均出芽高度,结果如下:
表1:鲜葛根粗提物对愈伤组织诱导不定芽的影响
接种愈伤数 | 出芽愈伤数 | 不定芽出芽率 | 不定芽平均高度(cm) | |
实施例2 | 100 | 96 | 96% | 1.5 |
对比例1 | 100 | 89 | 89% | 1.2 |
结果表明,添加了鲜葛根粗提物的不定芽诱导培养基能更好的诱导愈伤组织分化出不定芽,而且不定芽的长势略高。
Claims (7)
1.一种葛根植物的组织离体培养快繁方法,包括以下步骤:
(1)愈伤组织诱导:以当年生葛根植物茎段的薄切片为外植体,在配方为:MS+2,4-D0.6-0.9mg/L+KT 0.1-0.3mg/L的愈伤组织诱导培养基上培养,培养温度20-22℃,黑暗条件下培养,该培养基pH值5.9-6.2;
(2)不定芽分化:将步骤(1)得到的愈伤组织转移到配方为:MS+6-BA 1.2-1.8mg/L+NAA0.01-0.05mg/L+鲜葛根块根粗提物0.5-3g/L的不定芽诱导培养基上培养,培养温度22-25℃,光照强度1800-2000LX,该培养基pH值6.0-6.2;
(3)不定芽增殖:将步骤(2)得到的不定芽转移到配方为:MS+6-BA 1.5-2.5mg/L+NAA0.5-1.0mg/L的增殖培养基上增殖培养得到许多不定芽,培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,该培养基pH值6.0-6.2;
(4)壮苗培养:可选的,将步骤(3)得到的细弱不定芽转移到配方为:MS+GA3 1.0-3.0mg/L的壮苗培养基上培养一段时间,培养的培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,该培养基pH值6.0-6.2;
(5)生根:将步骤(3)或(4)得到的粗壮不定芽切分成单芽,接种到配方为:1/2MS+NAA0.1-1.0mg/L的生根培养基中诱导生根,培养的培养温度23-25℃,光照强度2000-2200LX,得到完整的再生苗,该培养基pH值5.8-6.2;
上述各培养基都含有适量的蔗糖和凝固剂。
2.根据权利要求1的方法,所述薄切片厚度为1‐3mm。
3.根据权利要求1的方法,所述薄切片厚度为约2mm。
4.根据权利要求1的方法,所述葛根植物是野葛或粉葛。
5.根据权利要求1的方法,所述鲜葛根块根粗提物是用葛根的新鲜、幼嫩块根,去皮切成小块,加适量水研磨成泥糊状得到的,加水量为约10ml/100g块根。
6.根据权利要求1的方法,其还包括炼苗移栽步骤:待苗高4cm以上时,打开瓶盖,置于半阴处3‐5天,之后取出组培苗洗净根部培养基,移栽到基质中,基质蛭石、珍珠岩配制而成,蛭石、珍珠岩比例约为1:3。
7.根据权利要求1‐6任一项所述的方法,所述愈伤组织诱导培养基配方为:MS+2,4‐D0.8mg/L+KT 0.2mg/L;不定芽诱导培养基配方为:MS+6‐BA 1.6mg/L+NAA 0.03mg/L+鲜葛根块根粗提物2.0g/L;增殖培养基配方为:MS+6‐BA 2.0mg/L+NAA 0.7mg/L;壮苗培养基配方为:MS+GA3 2.0mg/L;生根培养基配方为:1/2MS+NAA 0.8mg/L。
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