CN112715358B - 一种粉葛愈伤组织的诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种粉葛愈伤组织的诱导方法，涉及药用植物生物技术领域，包括粉葛外植体的取材与筛选，外植体的消毒灭菌，愈伤的诱导，愈伤的增殖，获得愈伤组织，其中诱导培养基中含有浓度为0.7mg/L的6‑BA以及浓度为0.2mg/L的NAA，其中增殖培养基中含有浓度为0.1‑0.9mg/L的6‑BA，浓度为0‑1mg/L的2,4‑D以及浓度为0.2‑0.8mg/L的IBA。本发明优化调整粉葛增殖培养基的浓度配比，提高粉葛愈伤的诱导率及增殖率，该方法具有培养简单，增殖量多，周期短等优点，通过该方法可成功诱导粉葛愈伤组织，为获得其次生代谢产物提供方法基础。

Description

一种粉葛愈伤组织的诱导方法
技术领域
本发明属于药用植物生物技术领域，具体涉及到的方法是：筛选一种特定培养基及培养条件提高粉葛愈伤诱导率的方法。
背景技术
葛根为豆科(Leguminosae)植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi或甘葛藤Pueraria thom-sonii Benth.的干燥块根，后者习称“粉葛”，主产广西、广东、四川、云南等地，贵州亦多有分布。葛根为常用中药，性辛凉、味甘，归脾、胃经，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻的功效，多用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、麻疹、热痢、头晕等症。粉葛含有丰富的淀粉、膳食纤维、氨基酸、微量元素等对人体有益的成分，是国家卫生部首批批准的药食同源两用植物。葛根是我国传统中药材，始载于《神农本草经》，现代药理学研究表明，其有效成分在维持心血管系统稳定性、保护脑神经、抗氧化、抗肿瘤、保护神经组织、防止肝肾损伤、改善代谢与免疫功能等方面均有一定的作用。
愈伤组织是组织培养最常见的一种培养形式，愈伤组织是原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。愈伤组织培养具有多种用途，一方面可研究植物生长发育及分化的机制进行基因遗传转化，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良、种质保存和有用化合物生产的理想途径。
粉葛的愈伤组织是大规模生产次生代谢物质的重要前提，较高的愈伤组织诱导率对于后期愈伤组织的分化奠定良好的基础，如何获得较高的愈伤组织诱导率与培养基类型、激素的种类和浓度以及培养条件有密切的关系。以往关于粉葛组织培养的研究中，多集中在粉葛诱导丛生芽，诱导生根等方面的较系统全面，但粉葛愈伤诱导还未见文献报道过系统全面的研究。
本发明通过对外植体的筛选、不同激素配比、培养条件、继代周期、继代次数等进行探索，结合粉葛愈伤生长的特点，提出了一种可以让粉葛愈伤诱导率较高的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的技术中愈伤诱导率低的问题，以粉葛健壮的幼嫩茎段为外植体，可在短时间内获得大量的愈伤组织，为粉葛悬浮培养体系的建立及次生代谢产物的生产的前期工作打下基础。
本发明的技术方案：
一种诱导粉葛愈伤组织的方法，包括外植体的获取与筛选、外植体的消毒灭菌、愈伤诱导条件的筛选、愈伤组织增殖条件、继代周期、继代次数的探索，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的获取与筛选：选取长势较好的粉葛植株，取粉葛幼嫩健壮的茎段，幼嫩无病虫害的叶片，及健壮的根，剪下作为外植体，经消毒灭菌后接种于诱导培养基上，分别在第10天、20天、30天统计其诱导率；
(2)外植体的消毒灭菌：将健壮的茎段、幼嫩无病虫害的叶片、健壮的根，放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻刷洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其分类为根、茎、叶分别装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s,然后用无菌水清洗2-3次，再用0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8-10min，最后用无菌水冲洗5-7次，然后取茎段接种于诱导培养基中；
(3)愈伤诱导条件的探索：将灭菌后的粉葛材料根、叶切成合适大小的块状，茎切成1.5cm的茎段，多余部分去除，将切好的根、茎、叶放到诱导培养基中，诱导培养基包括MS培养基，浓度为0.5-0.9mg/L的6-BA，浓度为0.1-0.2mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，分别放在黑暗、遮光、光照的条件下培养7-20天，获得少量愈伤组织；
(4)愈伤增殖条件探索：将诱导得到的愈伤组织转接到愈伤增殖培养基中，愈伤增殖培养基包括1/2MS培养基，浓度为0.1-0.9mg/L的6-BA，浓度为0-1mg/L的2,4-D以及浓度为0.2-0.8mg/L的IBA，200mg/L的酸水解酪蛋白，15g/L的蔗糖以及7g/L的琼脂，继代周期分别为7天、10天、15天，并分别在继代的第一次、第二次、第三次、第四次、第五次称其愈伤鲜重，经过28-90天的增殖培养获得大量的愈伤组织。
进一步地，所述步骤(1)中，粉葛为1-2年生来源于广西藤县的葛藤，最佳诱导愈伤外植体为粉葛茎段。
进一步地，所述步骤(2)中，消毒灭菌条件为：用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s，用无菌水冲洗2次后，再用浓度为0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8分钟，用无菌水清洗5次。
进一步地，所述步骤(3)中，培养基组成是MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g糖+7g琼脂，PH值为5.8，最佳培养条件为温度25℃及遮光。
进一步地，所述步骤(4)中，培养基组成是1/2MS+0.7mg/L6-BA+0.4mg/LNAA+200mg/L酸水解酪蛋白+15g糖+7g琼脂，PH值为5.8，最佳继代周期为7天，最佳继代次数为4次。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明以粉葛茎段作为外植体材料，通过启动培养基培养10天后，得到少量的愈伤组织，将得到的少量愈伤组织转接到筛选出来的增殖培养基里，以周期为7天，继代4次，即培养28天就可以得到大量的愈伤组织。
(2)本发明操作简单，周期短，通过该方法可成功获得粉葛愈伤组织，为其悬浮培养及次生代谢产物的获得提供基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果清晰的呈现，本发明提供如下附图进行说明：
图1为根、茎、叶外植体诱导愈伤20天时的长势。
图2为不同条件下愈伤组织的长势。
图3为愈伤组织在1-9号增殖培养基中以周期为7天，继代4次的长势。
图4为继代周期为7天时粉葛第一次继代—第六次继代愈伤增殖的图片。
图5为继代周期为10天时粉葛第一次继代—第六次继代愈伤增殖的图片。
图6为继代周期为15天时粉葛第一次继代—第六次继代愈伤增殖的图片。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明实例进行详细的描述。
实施例1
外植体的获取与筛选
晴天上午，选取长势较好的粉葛植株，取粉葛幼嫩健壮的茎段，幼嫩无病虫害的叶片，及健壮的根，剪下作为外植体。将健壮的茎段、幼嫩无病虫害的叶片、健壮的根，放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻清洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其分类为根、茎、叶分别装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s，然后用无菌水清洗2-3次，再用0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8-10min，用无菌水冲洗5-7次，然后取根、茎段、叶接种于诱导培养基中。每种处理10瓶，重复三次，分别在第10、20、30天时统计愈伤诱导率，结果如表1和图1所示。
表1不同外植体愈伤组织诱导的结果
Figure BDA0002867578690000041
由表1和图1所示的结果可以看出，粉葛茎段作为外植体时愈伤诱导率最高，即茎段为粉葛愈伤诱导的最适外植体。
实施例2
外植体的消毒灭菌
将健壮的茎段、幼嫩无病虫害的叶片、健壮的根，放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻清洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其分类为根、茎、叶分别装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s，然后用无菌水清洗2次，再用0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8min，最后用无菌水冲洗5次，然后取茎段接种于诱导培养基中。
实施例3
愈伤诱导条件的筛选
1)外植体灭菌
将健壮的茎段放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻清洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s，然后用无菌水清洗2次，再用0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8min，最后用无菌水冲洗5次，然后取茎段接种于诱导培养基中。
2)粉葛愈伤组织的诱导及培养条件的选择
将灭菌后的粉葛材料茎切成1.5cm的茎段，多余部分去除，将切好的茎放到诱导培养基中，所述的诱导培养基组成是MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g糖+7g琼脂，PH值为5.8，分别放在黑暗、遮光、光照的条件下培养7-20天，每个处理10瓶，重复3次，在培养后的第20天时观察愈伤长势。
由图2可以看出，在光照条件下，愈伤褐化较多，在黑暗条件下，愈伤诱导的量较少，在遮光条件下，愈伤诱导的量较多，褐化也较少，所以遮光条件为最适合粉葛愈伤组织的诱导。
实施例4
愈伤组织增殖条件的探索
1)外植体灭菌
将健壮的茎段放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻刷洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s，然后用无菌水清洗2次，再用0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8min，最后用无菌水冲洗5次，然后取茎段接种于诱导培养基中。
2)粉葛愈伤的诱导
将灭菌后的粉葛材料茎切成1.5cm的茎段，多余部分去除，将切好的茎段放到诱导培养基中，所述的诱导培养基组成是MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g糖+7g琼脂，PH值为5.8，放在遮光条件下培养培养7-20天。
3)粉葛愈伤的增殖
将诱导得到的愈伤组织转接到增殖培养基中，通过对激素配比的考察，确定愈伤增殖的培养条件，以1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7g/L+酸水解酪蛋白200mg/L为基础培养基，PH值为5.8，按照表2中的激素浓度进行实验，每个处理10瓶，重复三次，分别于增殖后的第28d拍照观察其长势，结果如图3所示。
表2愈伤增殖培养基L9(33)正交设计表
Figure BDA0002867578690000061
由图3的实验结果可看到，2号培养基最适合粉葛愈伤的增殖与生长，所以最适合粉葛愈伤增殖的激素条件为0mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA+0.4mg/LIBA。
实施例5
粉葛继代周期的筛选
1)外植体灭菌
将健壮的茎段放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻刷洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s，然后用无菌水清洗2次，再用0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8min，最后用无菌水清洗5次，然后取茎段接种于诱导培养基中。
2)粉葛愈伤的诱导
将灭菌后的粉葛材料茎切成1.5cm的茎段，多余部分去除，将切好的茎段放到诱导培养基中，所述的诱导培养基组成是MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g糖+7g琼脂，PH值为5.8，放在遮光条件下培养培养7-20天。
3)粉葛继代周期的筛选
将诱导得到的愈伤组织转接到增殖培养基中，培养基组成为1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.4mg/LIBA+15g糖+7g琼脂+200mg/LCH，PH值为5.8，分别在愈伤接进增殖培养基中的第7天，第10天，第15天进行愈伤继代。每个处理10瓶，重复3次，分别在不同周期继代的时候观察愈伤长势，结果见图4-6。
由图4-6可以看出，继代周期为7天时，其褐化最少，增殖的量也较多，周期为10天时，其增殖的量虽然也多，但是其褐化也较高，周期为15天时，其褐化最严重。所以继代周期为7天较适合粉葛愈伤的增殖，即粉葛最佳继代周期为7天。
实施例6
粉葛最佳继代次数的筛选
1)外植体灭菌
将健壮的茎段放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻刷洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75％的酒精消毒灭菌30s，然后用无菌水清洗2次，再用0.1％的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8min，最后用无菌水冲洗5次，然后取茎段接种于诱导培养基中。
2)粉葛愈伤的诱导
将灭菌后的粉葛材料茎切成1.5cm的茎段，多余部分去除，将切好的茎段放到诱导培养基中，所述的诱导培养基组成是MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g糖+7g琼脂，PH值为5.8，放在遮光条件下培养培养7-20天。
3)粉葛最佳继代次数的筛选
将诱导得到的愈伤组织转接到增殖培养基中，培养基组成为1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.4mg/LIBA+15g糖+7g琼脂+200mg/LCH，PH值为5.8，以继代周期为7天，分别在第一次继代、第二次继代、第三次继代、第四次继代、第五次继代时称其愈伤组织鲜重。每次处理5瓶，重复三次。统计结果如表3和图4所示。
表3粉葛最佳继代次数的筛选
Figure BDA0002867578690000081
由表3和图4可以看出，从第三次到第四次继代时，粉葛愈伤鲜重增长较多，褐化也较少，从第四次到第五次愈伤鲜重虽然也在增加，但其褐化同时也在增加，所以确定第四次继代为粉葛最佳的继代次数。
以上实施例中，培养条件为：温度条件为23—25℃，湿度为50％—60％的培养室中。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案并非限制，尽管上述实例已详细描述了本发明方法，但本领域技术人员应当理解，可以在形式和细节上对其作出不同的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的内容。

Claims (5)

1.一种粉葛愈伤组织的诱导方法，包括外植体的取材与筛选，外植体的消毒灭菌，确定愈伤诱导培养条件和愈伤增殖条件，其特征在于：包括以下步骤：
（1）外植体的获取与筛选：选取长势较好的粉葛植株，取粉葛幼嫩健壮的茎段，剪下作为外植体，经消毒灭菌后接种于诱导培养基上；
（2）外植体的消毒灭菌：将幼嫩健壮的茎段放在自来水下流水冲洗半小时，然后放进有洗洁精的水里用毛刷轻轻刷洗，用自来水清洗3-5次，再用纯水清洗1-2次，将其装进灭好菌的组培瓶里，然后放进超净工作台，用浓度为75%的酒精消毒灭菌30s，然后用无菌水清洗2-3次，再用0.1%的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8-10min，最后用无菌水冲洗5-7次；
（3）愈伤诱导条件的探索：将灭菌后的粉葛材料茎切成1.5cm的茎段，多余部分去除，将切好的茎放到诱导培养基中，所述的诱导培养基包括MS培养基，浓度为0.5-0.9mg/L的6-BA，浓度为0.1-0.2mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和7g/L的琼脂，放在黑暗、遮光、光照的条件下培养7-20天，获得少量愈伤组织；
（4）愈伤增殖条件探索：将诱导得到的愈伤组织转接到愈伤增殖培养基中，所述的愈伤增殖培养基包括1/2MS培养基，浓度为0.1-0.9mg/L的6-BA，浓度为0-1mg/L的2,4-D以及浓度为0.2-0.8mg/L的IBA ，200mg/L的酸水解酪蛋白，15g/L的蔗糖以及7g/L的琼脂，继代周期为7天，继代次数为4次，经过28天的增殖培养获得大量的愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的一种粉葛愈伤组织的诱导方法，其特征在于：所述步骤（1）中，粉葛为1-2年生来源于广西藤县的葛藤。
3.根据权利要求1所述的一种粉葛愈伤组织的诱导方法，其特征在于：所述步骤（2）中，消毒灭菌条件为：用浓度为75%的酒精消毒灭菌30s，无菌水冲洗2次后，再用浓度为0.1%的氯化汞溶液加2滴吐温80消毒灭菌8分钟，无菌水清洗5次。
4.根据权利要求1所述的一种粉葛愈伤组织的诱导方法，其特征在于：所述步骤（3）中，培养基组成是MS+0.7mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g糖+7g琼脂，PH值为5.8，培养条件为温度25℃及遮光。
5.根据权利要求1所述的一种粉葛愈伤组织的诱导方法，其特征在于：所述步骤（4）中，培养基组成是1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+200mg/L酸水解酪蛋白+15g糖+7g琼脂，PH值为5.8。
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Nitric oxide mediates the fungal elicitor-induced puerarin biosynthesis in Pueraria thomsonii Benth. suspension cells through a salicylic acid (SA)-dependent and a jasmonic acid (JA)-dependent signal pathway;XU Maojun等;《Science in China Series C: Life Sciences》;20060831;第49卷(第4期);379-389 *
粉葛种苗离体繁殖技术初步研究;马崇坚等;《广东农业科学》;20130810(第15期);28-30,35-36 *
粉葛组织培养及同源四倍体诱导;周堂英等;《中草药》;20050812;第36卷(第8期);1230-1233 *
野葛叶片和茎段高频再生体系的建立;洪森荣等;《植物研究》;20080715;第28卷(第4期);458-464,508 *

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