CN109937875B - 一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法。本发明采用兜兰的侧芽为外植体，采用独特的外植体切割处理和培养基进行叶丛芽的诱导、增殖和分化成正常不定芽，然后进行生根壮苗培养从而获得大量均一的组培苗。本发明的通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，能成功地进行叶丛芽诱导、增殖和恢复为正常的不定芽，每团叶丛芽在半年时间内获得89‑122个不定芽，获得的不定芽经过6‑8个月的生根壮苗培养即可移栽，从而实现兜兰组培苗规模化、商品化生产。本发明的培养方法和使用的培养基成分独特且简单实惠，培养体系稳定，技术切实可行，应用价值高，为提高兜兰繁殖效率，满足兜兰市场需求提供一条有效的途径。
Description
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
兜兰是珍稀兰花，观赏价值高，市场潜力大，种苗昂贵。兜兰杂交种的杂交后代在无菌播种后往往会出现性状分离而影响其商业化生产，采用兜兰优良株系进行组织培养无性繁殖是获得性状稳定一致的兜兰种苗的有效方法。然而通过常见的通过不定芽增殖进行组织培养来繁殖兜兰种苗时因其生长慢、继代周期较长、增殖倍数不高等原因而影响它的规模化生产。通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养能高效地进行兜兰的无性繁殖。目前，国内外还没有通过叶丛芽途径进行兜兰组织培养快速繁殖的论文报道，也没有通过叶丛芽途径的专利申请。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，从而高效进行兜兰优良株系的无性克隆获得性状统一的种苗。
本发明的通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
a、无菌不定芽的获得：切取兜兰的侧芽作为外植体，经消毒后，接种到不定芽诱导培养基中，然后加入头孢呋辛钠溶液覆盖培养基表面，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，获得不定芽，所述的不定芽诱导培养基为：每升含有椰子乳20-50mL、BA 5-10mg、蔗糖15-20g、NaH2PO4 0.17-0.34g和琼脂4.5-5.0g，其余为1/4-1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；
b、叶丛芽诱导与增殖：纵切不定芽的生长点，接种至叶丛芽诱导培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，直至不定芽增殖分化成叶丛芽；将叶丛芽切下来，纵切其生长点，接种至叶丛芽增殖培养基中进行叶丛芽增殖培养，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，叶丛芽增殖培养继代周期为60天，每次培养均将上一次培养获得的叶丛芽切割，同时纵切叶丛芽的生长点；所述的叶丛芽诱导培养基为：每升含有椰子乳150-200mL、TDZ 0.75-1.5mg、蔗糖20-30g、NaH2PO4 0.17-0.34g和琼脂4.5-5.0g，其余为1/2-1MS培养基，pH 5.8-6.0；所述的叶丛芽增殖培养基为：每升含有椰子乳150-200mL、TDZ 0.25-0.7mg、蔗糖20-30g、NaH2PO4 0.17-0.34g和琼脂4.5-5.0g，其余为1/2-1MS培养基，pH 5.8-6.0；
c、叶丛芽恢复成正常的不定芽：将叶丛芽增殖培养获得的叶丛芽切割，同时纵切叶丛芽的生长点，接种至叶丛芽恢复常芽培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，叶丛芽增殖分化出不定芽；所述的叶丛芽恢复常芽培养基为：每升含有椰子乳25-50mL、蔗糖10-20g、NaH2PO4 0.17-0.34g、蛋白胨2-4g和琼脂4.5-5.0g，其余为1/4-1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；
d、不定芽的生根壮苗培养：将不定芽从成团不定芽中分离出来接种至生根壮苗培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，获得生根的组培苗；所述的生根壮苗培养基为：每升含有椰子乳50-75mL、蔗糖15-25g、NaH2PO4 0.17-0.34g、NAA0.5-1mg、活性炭0.3-0.5g和琼脂4.5-5.0g，其余为改良MS培养基，pH 5.8-6.0；所述的改良MS培养基是将MS培养基中的NH4NO3和KNO3改变为原来的1.5-2倍，其余成份不变；
e、组培苗的移栽：将组培苗移入栽培基质中培养获得兜兰种苗。
叶丛芽诱导培养需要纵切不定芽的生长点，使用含有TDZ的培养基；叶丛芽增殖每次培养也需要纵切叶丛芽的生长点，使用含有TDZ的培养基；叶丛芽分化成多个不定芽使用不含TDZ的培养基，第二次培养叶丛芽增殖分化长成正常的不定芽，第三次培养不定芽依然能保持很高的增殖系数；叶丛芽分化成多个不定芽至少需要2次培养才能增殖分化长成正常的不定芽，否则就是成团叶原基和叶片，很容易被认为是异常芽而丢弃。生根壮苗阶段改良MS培养基中的NH4NO3、KNO3，使得出瓶的种苗叶片较宽(1.5-2.2cm)、较长(4-6cm)且较绿。
所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看书籍(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社,1991.)。1/4-1/2MS培养基是将MS培养基中的大量元素减为原来的1/4-1/2，其余成份不变。1/2-1MS培养基是将MS培养基中的大量元素减为原来的1/2-1，其余成份不变。例如：1/2MS培养基是将MS培养基中的大量元素减为原来的1/2，其余成份不变；1/4MS培养基是将MS培养基中的大量元素减为原来的1/4，其余成份不变。
所述的切取兜兰的侧芽作为外植体，经消毒后，接种到不定芽诱导培养基中具体为：在取外植体前14d用80-100mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，间隔7天后再用80-100mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，切取侧芽，然后在超净工作台上将切下的侧芽先用体积分数75％-80％的酒精水溶液浸泡30-60秒，切掉叶片，再用体积分数75％-80％的酒精水溶液浸泡30-60秒，无菌水冲洗3-5次，再用质量分数0.1％-0.2％的升汞水溶液消毒5-10分钟，无菌水冲洗4-5次，接种到不定芽诱导培养基中。
所述的头孢呋辛钠溶液优选为质量分数为11％-20％的头孢呋辛钠溶液。
所述的栽培基质优选为植金石、树皮和椰壳按体积比为1-3:1-3:1混合的混合基质。
本发明的兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，先将侧芽通过特殊的切割方式和培养基的改变诱导出表现异常形态的叶丛芽(即叶片密生，每个叶腋中有2－3个不定芽)，然后通过该叶丛芽继续以叶丛芽的状态进行高效快速的增殖获得叶丛芽无性繁殖系材料，接着将叶丛芽培养于能将其恢复为正常不定芽的培养基中，叶丛芽获得长大并恢复为正常的不定芽，同时可增殖一定数量的正常不定芽，最后将正常的不定芽培养于生根壮苗培养基中一段时间后可获得大量的兜兰组培苗，组培苗在温室中栽培长大后性状一致，变异率在5％以下。本发明的兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法的繁殖效率是常见的不定芽增殖方法的繁殖效率的10倍以上，在短时间内获得大量的兜兰组培苗，从而实现兜兰组培种苗规模化、商品化生产。
本发明诱导出的叶丛芽可以克服不同大小的不定芽增殖系数不一样的缺点，叶丛芽呈块状，没有单个芽的伸长生长，像是大量的芽整合在一块形成很大的复合茎。在没有TDZ的培养基中，每团叶丛芽180天便能增殖分化出89-122个正常的不定芽。叶丛芽增殖的繁殖效率比常见的不定芽增殖的繁殖效率高10倍以上。至今为止，本领域的其他研究工作者没有利用不定芽诱导出叶丛芽并进行叶丛芽状态增殖并最后形成正常的不定芽高效快繁殖的报道。本发明采用温室栽培兜兰母株萌生的侧芽为外植体，采用独特的外植体切割处理和培养基进行叶丛芽的诱导、增殖进而分化成正常不定芽，获得大量的不定芽，然后进行生根壮苗培养从而获得大量均一的组培苗，本发明的培养方法和使用的培养基成分独特且简单实惠，培养体系稳定，技术切实可行，应用价值高，为提高兜兰繁殖效率，满足兜兰市场需求提供一条有效的途径。
用常见的不定芽增殖来组培繁殖兜兰的方法繁殖效率较低。本发明的兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，能成功地进行叶丛芽诱导、增殖和恢复为正常的不定芽，每团叶丛芽在半年时间内获得上百个不定芽，获得的不定芽经过6-8个月的生根壮苗培养即可移栽，从而实现兜兰组培苗规模化、商品化生产。本发明的方法具有低成本，高效率的特点，是利用植物组织细胞的全能性和植物组织培养等技术进行珍稀植物种苗的规模化生产的高新生物技术。实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。
本发明采用温室栽培兜兰母株萌生的侧芽为外植体，采用独特的外植体切割处理和培养基进行叶丛芽的诱导、增殖进而分化成正常不定芽，获得大量的不定芽，然后进行生根壮苗培养从而获得大量均一的组培苗，本发明的培养方法和使用的培养基成分独特且简单实惠，培养体系稳定，技术切实可行，应用价值高，为提高兜兰繁殖效率，满足兜兰市场需求提供一条有效的途径。
附图说明：
图1是常见的不定芽增殖；A.不定芽(长0.8-2cm)增殖，标尺为0.25cm；B.不定芽(长2.5-5cm)增殖，标尺为1cm。
图2是叶丛芽的诱导、增殖和分化成多个不定芽；A.叶丛芽的诱导；B.叶丛芽的增殖；C.叶丛芽于叶丛芽恢复常芽培养基中第一次培养；D.叶丛芽于叶丛芽恢复常芽培养基中第二次培养；A的标尺为0.25cm，B、C、D的标尺均为0.5cm。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：绿摩帝纯洁兜兰(Paphiopedilum SCBG Purity)的组织培养
1.无菌不定芽的获得
以温室栽培绿摩帝纯洁兜兰(Paphiopedilum SCBG Purity)母株萌生的侧芽为外植体，在取外植体前两星期用80mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，间隔7天后再用80mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，切取侧芽，然后在超净工作台上将切下的侧芽先用体积分数75％的酒精水溶液浸泡30秒，切掉叶片，再用体积分数75％的酒精水溶液浸泡60秒，无菌水冲洗3次，再用质量分数0.1％的升汞水溶液消毒5分钟，无菌水冲洗4次，接种到不定芽诱导培养基中，然后加入用3毫升无菌水溶解的0.75g注射用头孢呋辛钠覆盖不定芽诱导培养基表面，培养温度25℃，光照度1500lx，光照12小时/天，培养90天，每个侧芽增殖分化出2-3个不定芽，消毒成功率50％。不定芽诱导培养基为：每升含有椰子乳25mL、BA5mg、蔗糖15g、NaH2PO4 0.17g和琼脂4.5g，其余为1/4MS培养基，pH 5.8，将上述各成份混合均匀后，分装于200mL组培瓶中，30mL/瓶，灭菌备用。
2.叶丛芽诱导与增殖
纵切不定芽的生长点，接种至叶丛芽诱导培养基中，培养温度25℃，光照度1500lx，光照12小时/天，培养90天后接种至相同的叶丛芽诱导培养基进行继代培养，每次继代培养均纵切不定芽的生长点，直至不定芽增殖分化成叶丛芽(图2A)。第二次继代培养后每个不定芽能增殖分化成1.5个叶丛芽，将叶丛芽切下来，纵切其生长点，接种至叶丛芽增殖培养基中进行叶丛芽增殖培养，培养温度25℃，光照度1500lx，光照12小时/天，叶丛芽增殖培养继代周期为60天，每次培养均将上一次培养获得的每团叶丛芽切割成2-4小团叶丛芽，同时纵切叶丛芽的生长点(图2B)。叶丛芽第一次增殖培养增殖系数为2.5，第二次及以后的增殖培养增殖系数均在3.3-3.5。经过三次及以上的增殖培养建立叶丛芽无性繁殖系。叶丛芽诱导培养基为：每升含有椰子乳150mL、TDZ 0.75mg、蔗糖20g、NaH2PO4 0.17g和琼脂4.5g，其余为1/2MS培养基，pH 5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。叶丛芽增殖培养基为：每升含有椰子乳150mL、TDZ 0.25mg、蔗糖20g、NaH2PO4 0.17g和琼脂4.5g，其余为1/2MS培养基，pH 5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
3.叶丛芽分化成正常的不定芽
将叶丛芽增殖培养获得的每团叶丛芽切割成2-4小团叶丛芽，同时纵切叶丛芽的生长点，接种至叶丛芽恢复常芽培养基中进行恢复常芽培养，培养温度25℃，光照度1500lx，光照12小时/天，恢复常芽培养继代周期为60天，60天后叶丛芽获得了初步的恢复同时继续进行叶丛芽增殖，增殖系数为3.3(图2C)。再将初步恢复的叶丛芽相同条件下第二次培养于新的叶丛芽恢复常芽培养基中，平均每团叶丛芽能增殖分化长成9个正常的不定芽(图2D)。将第二次恢复常芽培养获得的每团不定芽分切成2-4小团不定芽，接种至新的叶丛芽恢复常芽培养基相同条件下进行第三次恢复与增殖培养，不定芽增殖系数为3。在叶丛芽于恢复常芽培养基中进行3次培养(180天)，平均每团叶丛芽能增殖分化出89个正常的不定芽。叶丛芽恢复常芽培养基为：每升含有椰子乳25mL、蔗糖10g、NaH2PO4 0.17g、蛋白胨2g和琼脂4.5g，其余为1/4MS培养基，pH 5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
4.不定芽的生根壮苗培养
将大于或等于1.5cm高的不定芽从成团不定芽中分离出来接种在生根壮苗培养基中，培养温度25℃，光照度1500lx，光照12小时/天，培养8个月后有95％以上的小苗(组培苗)达到移栽标准，生根率为100％，每株苗有4-5条根，叶片宽1.5-2.2cm，叶片长4-6cm，且叶色翠绿。生根壮苗培养基为：每升含有椰子乳50mL、蔗糖15g、NaH2PO4 0.17g、NAA 0.5mg、活性炭0.3g和琼脂4.5g，其余为改良MS培养基(改良MS培养基是将MS培养基中的NH4NO3和KNO3改变为原来的1.5倍，其余成份不变)，pH 5.8，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
5.组培苗的移栽
将生根壮苗培养获得的组培苗移入植金石(日本进口)：树皮：椰壳按体积比为1:1:1混合的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％以上。采用常规管理，种植30个月时开花，变异率5％以下。
实施例2：红摩帝礼物兜兰(Paphiopedilum SCBG Souvenir)的组织培养
1.无菌不定芽的获得
以温室栽培红摩帝礼物兜兰(Paphiopedilum SCBG Souvenir)的组织培养母株萌生的侧芽为外植体，在取外植体前两星期用90mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，间隔7天后再用90mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，切取侧芽，然后在超净工作台上将切下的侧芽先用体积分数75％的酒精水溶液浸泡30秒，切掉叶片，再用体积分数75％的酒精水溶液浸泡60秒，无菌水冲洗3次，再用质量分数0.1％的升汞水溶液消毒8分钟，无菌水冲洗4次，接种到不定芽诱导培养基中，然后加入用5毫升无菌水溶解的0.75g注射用头孢呋辛钠覆盖不定芽诱导培养基表面，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，培养90天，每个侧芽增殖分化出2-3个不定芽，消毒成功率60％。不定芽诱导培养基为：每升含有椰子乳35mL、BA 8mg、蔗糖18g、NaH2PO4 0.20g和琼脂5.0g，其余为1/2MS培养基，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后，分装于200mL组培瓶中，30mL/瓶，灭菌备用。
2.叶丛芽诱导与增殖
纵切不定芽的生长点，接种至叶丛芽诱导培养基中，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，培养90天后接种至相同的叶丛芽诱导培养基进行继代培养，每次继代培养均纵切不定芽的生长点，直至不定芽增殖分化成叶丛芽。第二次继代培养后每个不定芽能增殖分化成1.7个叶丛芽，将叶丛芽切下来，纵切其生长点，接种至叶丛芽增殖培养基中进行叶丛芽增殖培养，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，叶丛芽增殖培养继代周期为60天，每次培养均将上一次培养获得的每团叶丛芽切割成2-4小团叶丛芽，同时纵切叶丛芽的生长点。叶丛芽第一次增殖培养增殖系数为2.7，第二次及以后的增殖培养增殖系数均在3.3-3.5。经过三次及以上的增殖培养建立叶丛芽无性繁殖系。叶丛芽诱导培养基为：每升含有椰子乳180mL、TDZ 1.0mg、蔗糖25g、NaH2PO4 0.20g和琼脂5.0g，其余为MS培养基，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。叶丛芽增殖培养基为：每升含有椰子乳180mL、TDZ 0.50mg、蔗糖25g、NaH2PO4 0.20g和琼脂5.0g，其余为MS培养基，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
3.叶丛芽分化成正常的不定芽
将叶丛芽增殖培养获得的每团叶丛芽切割成2-4小团叶丛芽，同时纵切叶丛芽的生长点，接种至叶丛芽恢复常芽培养基中进行恢复常芽培养，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，恢复常芽培养继代周期为60天，60天后叶丛芽获得了初步的恢复同时继续进行叶丛芽增殖，增殖系数为3.5。再将初步恢复的叶丛芽相同条件下第二次培养于新的叶丛芽恢复常芽培养基中，平均每团叶丛芽能增殖分化长成10个正常的不定芽。将第二次恢复常芽培养获得的每团不定芽分切成2-4小团不定芽，接种至新的叶丛芽恢复常芽培养基相同条件下进行第三次恢复与增殖培养，不定芽增殖系数为3.5。在叶丛芽于恢复常芽培养基中进行3次培养(180天)，平均每团叶丛芽能增殖分化出122个正常的不定芽。叶丛芽恢复常芽培养基为：每升含有椰子乳30mL、蔗糖15g、NaH2PO4 0.20g、蛋白胨2g和琼脂5.0g，其余为1/2MS培养基，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
4.不定芽的生根壮苗培养
将大于或等于1.5cm高的不定芽从成团不定芽中分离出来接种在生根壮苗培养基中，培养温度26℃，光照度1800lx，光照14小时/天，培养6个月后有95％以上的小苗(组培苗)达到移栽标准，生根率为100％，每株苗有4-5条根，叶片宽1.5-2.2cm，叶片长4-6cm，且叶色翠绿。生根壮苗培养基为：每升含有椰子乳60mL、蔗糖20g、NaH2PO4 0.20g、NAA 0.8mg、活性炭0.3g和琼脂5.0g，其余为改良MS培养基(改良MS培养基是将MS培养基中的NH4NO3和KNO3改变为原来的1.8倍，其余成份不变)，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
5.组培苗的移栽
将生根壮苗培养获得的组培苗移入植金石(日本进口)：树皮：椰壳按体积比为2:2:1混合的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％以上。采用常规管理，种植30个月时开花，变异率5％以下。
实施例3：红摩帝回归兜兰(Paphiopedilum SCBG Returnee)的组织培养
1.无菌不定芽的获得
以温室栽培红摩帝回归兜兰(Paphiopedilum SCBG Returnee)母株萌生的侧芽为外植体，在取外植体前两星期用100mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，间隔7天后再用100mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，切取侧芽，然后在超净工作台上将切下的侧芽先用体积分数80％的酒精水溶液浸泡60秒，切掉叶片，再用体积分数80％的酒精水溶液浸泡30秒，无菌水冲洗5次，再用质量分数0.2％的升汞水溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5次，接种到不定芽诱导培养基中，然后加入用6毫升无菌水溶解的0.75g注射用头孢呋辛钠覆盖不定芽诱导培养基表面，培养温度29℃，光照度2000lx，光照16小时/天，培养90天，每个侧芽增殖分化出2-3个不定芽，消毒成功率53％。不定芽诱导培养基为：每升含有椰子乳50mL、BA10mg、蔗糖20g、NaH2PO4 0.34g和琼脂5.0g，其余为1/2MS培养基，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后，分装于200mL组培瓶中，30mL/瓶，灭菌备用。
2.叶丛芽诱导与增殖
纵切不定芽的生长点，接种至叶丛芽诱导培养基中，培养温度29℃，光照度2000lx，光照16小时/天，培养90天后接种至相同的叶丛芽诱导培养基进行继代培养，每次继代培养均纵切不定芽的生长点，直至不定芽增殖分化成叶丛芽。第二次继代培养后每个不定芽能增殖分化成1.5个叶丛芽，将叶丛芽切下来，纵切其生长点，接种至叶丛芽增殖培养基中进行叶丛芽增殖培养，培养温度29℃，光照度2000lx，光照16小时/天，叶丛芽增殖培养继代周期为60天，每次培养均将上一次培养获得的每团叶丛芽切割成2-4小团叶丛芽，同时纵切叶丛芽的生长点。叶丛芽第一次增殖培养增殖系数为2.6，第二次及以后的增殖培养增殖系数均在3.3-3.5。经过三次及以上的增殖培养建立叶丛芽无性繁殖系。叶丛芽诱导培养基为：每升含有椰子乳200mL、TDZ 1.5mg、蔗糖30g、NaH2PO4 0.34g和琼脂5.0g，其余为MS培养基，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。叶丛芽增殖培养基为：每升含有椰子乳200mL、TDZ 0.70mg、蔗糖30g、NaH2PO4 0.34g和琼脂5.0g，其余为MS培养基，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
3.叶丛芽分化成正常的不定芽
将叶丛芽增殖培养获得的每团叶丛芽切割成2-4小团叶丛芽，同时纵切叶丛芽的生长点，接种至叶丛芽恢复常芽培养基中进行恢复常芽培养，培养温度29℃，光照度2000lx，光照16小时/天，恢复常芽培养继代周期为60天，60天后叶丛芽获得了初步的恢复同时继续进行叶丛芽增殖，增殖系数为3.4。再将初步恢复的叶丛芽相同条件下第二次培养于新的叶丛芽恢复常芽培养基中，平均每团叶丛芽能增殖分化长成9个正常的不定芽。将第二次恢复常芽培养获得的每团不定芽分切成2-4小团不定芽，接种至新的叶丛芽恢复常芽培养基相同条件下进行第三次恢复与增殖培养，不定芽增殖系数为3.2。在叶丛芽于恢复常芽培养基中进行3次培养(180天)，平均每团叶丛芽能增殖分化出106个正常的不定芽。叶丛芽恢复常芽培养基为：每升含有椰子乳50mL、蔗糖20g、NaH2PO4 0.34g、蛋白胨4g和琼脂5.0g，其余为1/2MS培养基，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
4.不定芽的生根壮苗培养
将大于或等于1.5cm高的不定芽从成团不定芽中分离出来接种在生根壮苗培养基中，培养温度29℃，光照度2000lx，光照16小时/天，培养8个月后有95％以上的小苗(组培苗)达到移栽标准，生根率为100％，每株苗有4-5条根，叶片宽1.5-2.2cm，叶片长4-6cm，且叶色翠绿。生根壮苗培养基为：每升含有椰子乳75mL、蔗糖25g、NaH2PO4 0.34g、NAA 1mg、活性炭0.5g和琼脂5.0g，其余为改良MS培养基(改良MS培养基是将MS培养基中的NH4NO3和KNO3改变为原来的2.0倍，其余成份不变)，pH 6.0，将上述各成份混合均匀后灭菌备用。
5.组培苗的移栽
将生根壮苗培养获得的组培苗移入植金石(日本进口)：树皮：椰壳按体积比为3:3:1混合的混合基质中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％以上。采用常规管理，种植30个月时开花，变异率5％以下。
Claims (3)
1.一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、无菌不定芽的获得：切取兜兰的侧芽作为外植体，经消毒后，接种到不定芽诱导培养基中，然后加入头孢呋辛钠溶液覆盖培养基表面，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，获得不定芽，所述的不定芽诱导培养基为：每升含有椰子乳20-50mL、BA 5-10 mg、蔗糖15-20 g、NaH2PO4 0.17-0.34 g和琼脂4.5-5.0 g，其余为1/4-1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；
b、叶丛芽诱导与增殖：纵切不定芽的生长点，接种至叶丛芽诱导培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000 lx，光照12-16小时/天，直至不定芽增殖分化成叶丛芽；将叶丛芽切下来，纵切其生长点，接种至叶丛芽增殖培养基中进行叶丛芽增殖培养，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000 lx，光照12-16小时/天，叶丛芽增殖培养继代周期为60天，每次培养均将上一次培养获得的叶丛芽切割，同时纵切叶丛芽的生长点；所述的叶丛芽诱导培养基为：每升含有椰子乳150-200 mL、TDZ 0.75-1.5 mg、蔗糖20-30 g、NaH2PO4 0.17-0.34g和琼脂4.5-5.0 g，其余为1/2-1MS培养基，pH 5.8-6.0；所述的叶丛芽增殖培养基为：每升含有椰子乳150-200 mL、TDZ 0.25-0.7 mg、蔗糖20-30 g、NaH2PO4 0.17-0.34 g和琼脂4.5-5.0 g，其余为1/2-1MS培养基，pH 5.8-6.0；
c、叶丛芽恢复成正常的不定芽：将叶丛芽增殖培养获得的叶丛芽切割，同时纵切叶丛芽的生长点，接种至叶丛芽恢复常芽培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000 lx，光照12-16小时/天，叶丛芽增殖分化出不定芽；所述的叶丛芽恢复常芽培养基为：每升含有椰子乳25-50 mL、蔗糖10-20 g、NaH2PO4 0.17-0.34 g、蛋白胨2-4 g和琼脂4.5-5.0 g，其余为1/4-1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；
d、不定芽的生根壮苗培养：将不定芽从成团不定芽中分离出来接种至生根壮苗培养基中，培养温度25℃-29℃，光照度1500-2000 lx，光照12-16小时/天，获得生根的组培苗；所述的生根壮苗培养基为：每升含有椰子乳50-75 mL、蔗糖15-25 g、NaH2PO4 0.17-0.34 g、NAA 0.5-1 mg、活性炭0.3-0.5 g和琼脂4.5-5.0 g，其余为改良MS培养基，pH 5.8-6.0；所述的改良MS培养基是将MS培养基中的NH4NO3和KNO3改变为原来的1.5-2倍，其余成份不变；
e、组培苗的移栽：将组培苗移入栽培基质中培养获得兜兰种苗，所述的栽培基质为植金石、树皮和椰壳按体积比为1-3:1-3:1混合的混合基质。
2.根据权利要求1所述的通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的切取兜兰的侧芽作为外植体，经消毒后，接种到不定芽诱导培养基中具体为：在切取外植体前14 d用80-100 mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，间隔7天后再用80-100 mg/L的硫酸链霉素溶液浇灌根部一次，切取侧芽，然后在超净工作台上将切下的侧芽先用体积分数75%-80%的酒精水溶液浸泡30-60秒，切掉叶片，再用体积分数75%-80%的酒精水溶液浸泡30-60秒，无菌水冲洗3-5次，再用质量分数0.1%-0.2%的升汞水溶液消毒5-10分钟，无菌水冲洗4-5次，接种到不定芽诱导培养基中。
3.根据权利要求1所述的通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的头孢呋辛钠溶液为质量分数为11%-20%的头孢呋辛钠溶液。
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