CN109984039B - 一种香石蒜组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种香石蒜组织培养方法，属于植物组织培养快速繁殖技术领域。本发明提供的香石蒜组织培养方法包括以下步骤：(1)将灭菌处理后的香石蒜鳞茎接种到丛生芽诱导培养基中进行诱导培养，得到第一小鳞茎；(2)将第一小鳞茎接种到愈伤诱导培养基上进行诱导愈伤培养，得到愈伤团块；(3)将愈伤团块接种到愈伤分化培养基上进行分化培养，得到第二小鳞茎；(4)将第二小鳞茎接种到壮芽生根培养基上进行壮芽生根培养。本发明提供的培养方法安全性高，分化能力强，能够实现香石蒜的高效繁殖。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养快速繁殖技术领域，具体涉及一种香石蒜组织培养方法。
背景技术
石蒜属植物共有20多种，其中15种分布在中国，有‘花叶不相见’的特殊观赏性状，也被誉为“中国郁金香”，在全世界都是非常受欢迎的球根花卉。石蒜通常用分球、鳞茎基底切割和组织培养等方法繁殖，分球和鳞茎基底切割方法简单易行，但繁殖系数不高、速度慢，很难满足近年来对石蒜种球的大量需求，因此，通过组织培养快速繁殖是获得大量石蒜种球的有效途径。
目前对石蒜属植物的组织培养研究已有较多报道，但由于种间差异大，在愈伤诱导和分化阶段所用植物激素种类和浓度会直接影响到组织培养的成败和繁殖系数，因此，建立完善的不同种的组织培养快繁体系对高效获得大量石蒜属植物非常重要。据报道，目前已建立起组织培养快繁体系的种类有：石蒜、乳白石蒜、长筒石蒜、红蓝石蒜、中国石蒜、忽地笑和安徽石蒜，其他种也有相关研究进展，但并未见成熟、高效的繁殖体系。
香石蒜是石蒜属中稀有的一种自然杂交后代，其特征在于花蕾有红色条纹，盛开后花瓣腹面有粉红色中线、背面有一条红色的条纹，并且是石蒜属植物中少有的具香气的种，有很高的观赏价值。但由于其分布区局限，种球数量少且不能通过种子繁殖，导致对这一优良品种的园林应用较为滞后。
发明内容
本发明的目的在于提供一种香石蒜组织培养方法。本发明提供的培养方法安全性高，分化能力强，能够实现香石蒜的高效繁殖。
本发明提供了一种香石蒜组织培养方法，包括以下步骤：
(1)将灭菌处理后的香石蒜鳞茎接种到丛生芽诱导培养基中进行诱导培养30d以上，得到第一小鳞茎；所述丛生芽诱导培养基以MS培养基为基础，还包括3.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA，所述丛生芽诱导培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9；所述灭菌处理包括用质量分数为4％的次氯酸钠消毒15min；
(2)将步骤(1)得到的第一小鳞茎接种到愈伤诱导培养基上进行诱导愈伤培养30～40d，得到愈伤团块；所述愈伤诱导培养基以MS培养基为基础，还包括1.5mg/L的2,4-D和0.2mg/L的6-BA，所述愈伤诱导培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9；
(3)将步骤(2)得到的愈伤团块接种到愈伤分化培养基上进行分化培养20d以上，得到第二小鳞茎；所述愈伤分化培养基以MS培养基为基础，还包括2.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA，所述愈伤分化培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9；
(4)将步骤(3)得到的第二小鳞茎接种到壮芽生根培养基上进行壮芽生根培养25～35d；所述壮芽生根培养基以MS培养基为基础，还包括0.4mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA，所述壮芽生根培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9。
优选的是，步骤(1)所述灭菌处理包括以下步骤：
1)去除香石蒜鳞茎的根系和外层包皮，切除鳞茎上部，保留鳞茎盘基部，剔除鳞茎盘基部外部2～3层鳞片，沿鳞茎盘中间切开，得到两个小块；
2)将步骤1)得到的两个小块用流水冲洗，在含质量分数为0.1％Tween20的水溶液中浸泡30min，清水冲洗2～3遍后用体积分数为75％的酒精消毒30s，用质量分数为4％的次氯酸钠消毒15min，用无菌水清洗4～5次，5min/次。
优选的是，步骤1)所述鳞茎上部占所述石蒜鳞茎体积的2/3～3/4。
优选的是，步骤(1)所述接种的方法包括：
a)将灭菌处理后的香石蒜鳞茎纵向切割，得到切割后的香石蒜；
b)将切割后的香石蒜的带鳞茎盘的一端插入到丛生芽诱导培养基中。
优选的是，所述切割后的香石蒜的宽度为0.5～1cm，高度为1～1.5cm。
优选的是，所述培养方法的培养温度为24～26℃。
优选的是，所述培养方法的光照时间为12～14h/d，光照强度为1800～2500lx。
本发明提供了一种香石蒜组织培养方法。本发明所述培养方法选择质量分数为4％的次氯酸钠对香石蒜进行灭菌处理，低毒、无毒化，极大程度地保护了实验员的安全；在愈伤组织诱导阶段采用的激素组合使得愈伤诱导率大幅提高，每个鳞茎的愈伤诱导率可达100％，且愈伤组织质量好，在本发明提供的愈伤诱导分化培养基上分化能力强，一个愈伤组织团块能分化出上百个芽点，并长成小鳞茎，具有快速、高效的特点，从根本上解决了香石蒜组织培养高效繁殖的技术问题，为解决园林应用中的鳞茎短缺问题提供了技术保障。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的香石蒜愈伤诱导和分化效率图。
具体实施方式
本发明提供了一种香石蒜组织培养方法，包括以下步骤：
(1)将灭菌处理后的香石蒜鳞茎接种到丛生芽诱导培养基中进行诱导培养30d以上，得到第一小鳞茎；所述丛生芽诱导培养基以MS培养基为基础，还包括3.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA，所述丛生芽诱导培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9；所述灭菌处理包括用质量分数为4％的次氯酸钠消毒15min；
(2)将步骤(1)得到的第一小鳞茎接种到愈伤诱导培养基上进行诱导愈伤培养30～40d，得到愈伤团块；所述愈伤诱导培养基以MS培养基为基础，还包括1.5mg/L的2,4-D和0.2mg/L的6-BA，所述愈伤诱导培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9；
(3)将步骤(2)得到的愈伤团块接种到愈伤分化培养基上进行分化培养20d以上，得到第二小鳞茎；所述愈伤分化培养基以MS培养基为基础，还包括2.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA，所述愈伤分化培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9；
(4)将步骤(3)得到的第二小鳞茎接种到壮芽生根培养基上进行壮芽生根培养25～35d；所述壮芽生根培养基以MS培养基为基础，还包括0.4mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA，所述壮芽生根培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9。
本发明将灭菌处理后的香石蒜鳞茎接种到丛生芽诱导培养基中进行诱导培养30d以上，得到第一小鳞茎；所述丛生芽诱导培养基以MS培养基为基础，还包括3.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA，所述丛生芽诱导培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9；所述灭菌处理包括用质量分数为4％的次氯酸钠消毒15min。在本发明中，所述灭菌处理包括以下步骤：1)去除香石蒜鳞茎的根系和外层包皮，切除鳞茎上部，保留基部鳞茎盘，剔除鳞茎盘外部2～3层鳞片，沿鳞茎盘中间切开，得到两个小块；2)将步骤1)得到的两个小块用流水冲洗，在含质量分数为0.1％Tween 20的水溶液中浸泡30min，清水冲洗2～3遍后用体积分数为75％的酒精消毒30s，用质量分数为4％的次氯酸钠消毒15min，用无菌水清洗4～5次，5min/次。在本发明中，所述清水冲洗2～3遍后优选在无菌环境下操作，具体如超净工作台。在本发明中，所述鳞茎上部占所述石蒜鳞茎体积的2/3～3/4，更优选为2/3。在本发明中，所述切割后的香石蒜的宽度优选为0.5～1cm，高度优选为1～1.5cm。在本发明中，所述接种的方法包括：a)将灭菌处理后的香石蒜鳞茎纵向切割，得到切割后的香石蒜；b)将切割后的香石蒜的带鳞茎盘的一端插入到丛生芽诱导培养基中。在本发明中，所述诱导培养的时间优选为30d以上，更优选为30～45d，在鳞片之间可见第一小鳞茎产生，小鳞茎数量与切割后的香石蒜的大小有关。本发明在鳞片间产生第一小鳞茎后，优选剥开鳞片，切下第一小鳞茎，切割时第一小鳞茎基部需保留鳞茎盘组织，切下的第一小鳞茎转移至愈伤诱导培养基上。在本发明中，所述诱导培养的培养温度为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述诱导培养的光照时间为12～14h/d，更优选为13h/d，光照强度1800～2500lx，更优选为2200lx。
得到小鳞茎后，本发明将第一小鳞茎接种到愈伤诱导培养基上进行诱导愈伤培养30～40d，得到愈伤团块；所述愈伤诱导培养基以MS培养基为基础，还包括1.5mg/L的2,4-D和0.2mg/L的6-BA，所述愈伤诱导培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9。在本发明中，所述愈伤诱导培养的时间优选为30～40d，更优选为35d。愈伤诱导培养后，在鳞茎盘基部会形成1～2cm左右直径的愈伤团块，本发明优选用镊子和手术刀将愈伤组织从小鳞茎基部剥离，将愈伤团块转接到愈伤分化培养基上，切下的小鳞茎优选继续生长在愈伤诱导培养基上，继续诱导愈伤团块产生。在本发明中，所述诱导愈伤培养的培养温度为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述诱导培养的光照时间为12～14h/d，更优选为13h/d，光照强度1800～2500lx，更优选为2200lx。
得到愈伤团块后，本发明将愈伤团块接种到愈伤分化培养基上进行分化培养20d以上，得到第二小鳞茎；所述愈伤分化培养基以MS培养基为基础，还包括2.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的NAA，所述愈伤分化培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9。在本发明中，所述分化培养的时间优选为20d以上，更优选为25d以上，所述分化培养25～30d后，在愈伤组织的表面就可见紧密生长的小芽点，继续培养15～20d，芽点便可长成0.5cm左右大小的再生小鳞茎，本发明所述的一个愈伤团块可以分化出上百个第二小鳞茎。在本发明中，所述分化培养的培养温度为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述诱导培养的光照时间为12～14h/d，更优选为13h/d，光照强度1800～2500lx，更优选为2200lx。
得到第二小鳞茎后，本发明将第二小鳞茎接种到壮芽生根培养基上进行壮芽生根培养25～35d；所述壮芽生根培养基以MS培养基为基础，还包括0.4mg/L的6-BA和0.2mg/L的NAA，所述壮芽生根培养基中蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为7.5g/L，pH值为5.9。本发明优选将愈伤团块上再生的小鳞茎逐一切割开后，转移到壮芽生根培养基上培养。在本发明中，所述切割优选为纵向切割，切割后保留完整小鳞茎和鳞茎盘。在本发明中，所述壮芽生根培养的培养温度为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述诱导培养的光照时间为12～14h/d，更优选为13h/d，光照强度1800～2500lx，更优选为2200lx。
本发明通过上述植物激素不同浓度的组合使用，可以在单个小鳞茎基部诱导大量高质量愈伤团块组织，并快速分化出再生植株，实现上百倍至千倍的繁殖系数增速。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种香石蒜组织培养方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
本发明提供的香石蒜高效组织培养方法采取了多激素组合技术：
(1)以香石蒜的鳞茎为材料培养出丛生芽
取生长健壮的香石蒜鳞茎2个，清洗干净后用刀剔除根部组织和外部褐色皮层，切掉上部的2/3鳞茎组织，保留鳞茎盘基部的1/3。再小心剔除鳞茎外的2～3层鳞片，之后将鳞茎沿中间切开，分为2个小块。将处理干净的小块放在流水下冲洗30min，0.1％Tween 20的水溶液中浸泡30min，清水冲洗2～3遍后转移至超净工作台，进行如下灭菌流程：75％酒精，30s；4％次氯酸钠，15min；无菌水，4～5次，5min/次。在整个灭菌和清洗过程中，应不停地摇动瓶子，使材料充分与消毒液和清洗液接触。消毒完成后用镊子取出鳞茎盘，放在滤纸上，吸干表面水分后用手术刀剔除外层植物组织，再将每个鳞茎小块均匀切割为2～3小块，宽度为0.5cm左右，高度为1cm左右，然后将有鳞茎盘的一端插入到丛生芽诱导培养基中。
(2)通过丛生芽诱导愈伤组织
丛生芽诱导培养基上的外植体生长30～40d后，在两个鳞片之间可见小鳞茎产生，小鳞茎数量根据外植体切割大小有所差异，本实施例所述的每个鳞茎小块能长出鳞茎数量为4～5个。小鳞茎长出后，在手术刀和镊子的配合下小心剥开鳞片，取下小鳞茎，切割时小鳞茎基部需保留鳞茎盘组织，切下的小鳞茎随即转移到愈伤诱导培养基上。
(3)愈伤组织进行不定芽诱导培养
小鳞茎在愈伤诱导培养基上生长35d左右，鳞茎盘基部会形成1-2cm左右的愈伤组织团块，这时的愈伤组织呈浅黄色，半疏松状态，分化效率很高。用镊子和手术刀将愈伤组织和小鳞茎剥离，将愈伤组织转接到愈伤分化培养基上，小鳞茎则可以继续转移到新的愈伤诱导培养基上，继续诱导产生愈伤。愈伤组织在分化培养基上培养20～30d后，在愈伤组织的表面就可见紧密生长的小芽点，继续培养10～15d，即可获得0.5cm左右大小的再生小鳞茎。香石蒜愈伤组织团块在该愈伤分化培养基上的分化效率极高，一个愈伤团块就可以分化出上百个小芽点，并长成小鳞茎。
(4)不定芽进行壮苗和生根培养
将愈伤组织上0.5cm左右的再生小鳞茎切下，转移到壮苗和生根培养基上培养。由于愈伤组织分化效率高，小鳞茎生长密集，可以2～3个小鳞茎为一个单位进行切割和转接种，待小鳞茎生长健壮，并长出4～5条根后，即可进行练苗、移栽。
表1四种培养基具体组分
在表1所述的4种培养基中，丛生芽诱导、愈伤分化和壮苗生根培养基中都采用6-BA和NAA两种植物激素，但不同的激素浓度配比对诱导、分化和生长有不同的功能，因此需要选择恰当的激素浓度实现不同阶段的生长要求，而愈伤诱导培养基则选择2,4-D和6-BA两种激素的适合配比，在试验中发现，1.5mg/L 2,4-D和0.2mg/L 6-BA的激素浓度比对香石蒜鳞茎盘的愈伤诱导效果最好。
图1为香石蒜愈伤诱导和分化效率图片。经过愈伤诱导和分化培养基培养后，小鳞茎基部能诱导出1cm左右大小的愈伤团块(见图1a)，将愈伤团块接种到分化培养基上之后，愈伤膨大并分化出上百个小芽点，并长出小鳞茎(见图1b)。
培养条件都为：光照时间12h/d，光照强度2500lx左右，培养室温度25±1℃。
对繁殖系数低，种子繁殖速度慢或不能用种子繁殖的植物品种来说，植物组织培养是快速、高效繁殖这些植物的首选方法。石蒜属植物是一类无性繁殖速度慢，部分种类不能用种子繁殖的观赏兼药用的球根花卉，为满足日益增长的种球需求量，利用组织培养是高效获得大量种球的有效方法。但由于种间组织培养条件差异大，为获得最高效的繁殖系数，在愈伤诱导和分化阶段，不同种对激素种类和浓度的要求精度高，因此，建立石蒜属不同种的高效组织培养体系是实现种球快速繁殖的关键技术。通过本发明中的多种激素组合使用，建立了香石蒜的高效组织培养体系，能在短时间内培养出大量种球，为香石蒜的种球生产和科学研究都提供了切实可行的技术支撑。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种香石蒜组织培养方法，包括以下步骤：
（1）将灭菌处理后的香石蒜鳞茎接种到丛生芽诱导培养基中进行诱导培养30d以上，得到第一小鳞茎；所述丛生芽诱导培养基以MS培养基为基础，添加3.0 mg/L的6-BA和0.5 mg/L的NAA，所述丛生芽诱导培养基中蔗糖的浓度为30 g/L，琼脂的浓度为7.5 g/L，pH值为5.9；所述灭菌处理包括用质量分数为4%的次氯酸钠消毒15 min；
所述接种的方法包括：
a）将灭菌处理后的香石蒜鳞茎纵向切割，得到切割后的香石蒜；所述切割后的香石蒜的宽度为0.5~1 cm，高度为1~1.5 cm；
b）将切割后的香石蒜的带鳞茎盘的一端插入到丛生芽诱导培养基中；
（2）将步骤（1）得到的第一小鳞茎接种到愈伤诱导培养基上进行诱导愈伤培养30~40d，得到愈伤团块；所述愈伤诱导培养基以MS培养基为基础，添加1.5 mg/L的2,4-D和0.2 mg/L的6-BA，所述愈伤诱导培养基中蔗糖的浓度为30 g/L，琼脂的浓度为7.5 g/L，pH值为5.9；
（3）将步骤（2）得到的愈伤团块接种到愈伤分化培养基上进行分化培养20d以上，得到第二小鳞茎；所述愈伤分化培养基以MS培养基为基础，添加2.0 mg/L的6-BA和0.5 mg/L的NAA，所述愈伤分化培养基中蔗糖的浓度为30 g/L，琼脂的浓度为7.5 g/L，pH值为5.9；
（4）将步骤（3）得到的第二小鳞茎接种到壮芽生根培养基上进行壮芽生根培养25~35d；所述壮芽生根培养基以MS培养基为基础，添加0.4 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的NAA，所述壮芽生根培养基中蔗糖的浓度为30 g/L，琼脂的浓度为7.5 g/L，pH值为5.9。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）所述灭菌处理包括以下步骤：
1）去除香石蒜鳞茎的根系和外层包皮，切除鳞茎上部，保留鳞茎盘基部，剔除鳞茎盘基部外部2~3层鳞片，沿鳞茎盘中间切开，得到两个小块；
2）将步骤1）得到的两个小块用流水冲洗，在含质量分数为0.1% Tween 20的水溶液中浸泡30 min，清水冲洗2~3遍后用体积分数为75％的酒精消毒30 s，用质量分数为4%的次氯酸钠消毒15 min，用无菌水清洗4~5次，5 min/次。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤1）所述鳞茎上部占所述石蒜鳞茎体积的2/3~3/4。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法的培养温度为24~26℃。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法的光照时间为12~14 h/d，光照强度为1800~2500 lx。
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| 香石蒜的组培快繁技术研究;单卓等;《园林科技》;20121231(第3期);第9页左栏第2段及表1 * |
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