CN111202005A - 一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，属于组织培养技术领域，本发明通过以MS为基本培养基，研究添加不同2,4‑D浓度及营养成分对GT42胚性愈伤组织的影响。进而优化GT42胚性愈伤组织的诱导培养基，培养优质的胚性愈伤组织，为甘蔗的遗传转化提供优质材料，并为甘蔗的快速繁殖提供技术保障，以MS为基本培养基，添加3mg/L 2,4‑D为最佳培养基，胚性愈伤诱导率达71.06％。在试验1的基础上，以添加100ml/L椰汁最佳，胚性愈伤诱导率达84.22％。本研究通过设计优化试验，筛选出了诱导胚性愈伤组织的最佳培养基，为甘蔗的快速繁殖及遗传转化提供了一定的研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法。
背景技术
甘蔗是我国最重要的糖料作物，甘蔗糖占全国食糖总产量90％以上，其中广西占全国60％以上，对广西乃至我国的经济发展具有重要意义。由于甘蔗是高度杂合的非整倍性异源多倍体植物，遗传背景相当复杂，甘蔗育种以杂交育种为主，利用传统育种方法从有性杂交到良种育成的周期长、成效低，一般育成一个品种需要10年左右的时间。转基因辅助育种可以有效的提高甘蔗育种效率，缩短育种年限。在甘蔗的遗传转化中主要使用的方法有农杆菌介导法和基因枪轰击法，通过上述两种方法，已获得抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、高糖等转基因甘蔗。不论是农杆菌介导法还是基因枪轰击法，其转化的受体都是胚性愈伤组织。因而获得良好的胚性愈伤组织是遗传转化最基本的保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，解决甘蔗的遗传转化中无法获得缺乏良好胚性愈伤组织的技术问题。
一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1：从田间选取生长健壮的甘蔗植株尾梢，剥掉叶片，留取28-32cm的尾梢带回实验室；
步骤2：用75％乙醇消毒尾梢表面，剥除4-5层外叶鞘后置于超净工作台内，取距顶端生长点9-11cm的幼嫩心叶组织作为外植体，将其切成0.18-0.22mm厚的薄片接种于愈伤组织诱导培养基上；
步骤3：培养皿的数量为6个，每个培养皿接种10块外植体，27℃暗培养15～20d；
步骤4：二十天后观察诱导出的愈伤组织，将愈伤组织转接至新的培养基中继代培养；
步骤5：继代后第二十天观察，统计继代培养后的愈伤组织诱导率、褐化率和污染率，选出适合诱导胚性愈伤组织。
进一步地，所述步骤1中，甘蔗植株选用型号为GT42的甘蔗。
进一步地，所述步骤2中，培养基以MS培养基为基本培养基，加30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH值5.8，培养皿中2,4-D浓度分别为：0mg/L，1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L，每个处理接20块外植体，3次重复。
进一步地，所述步骤3中，接种外植体时，每个处理3个重复，每个重复接20个外植体。
进一步地，所述步骤5中，统计愈伤组织诱导率、褐化率和污染率的具体算式为：
愈伤组织诱导率(％)＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体块数×100；
外植体褐化率(％)＝外植体褐化数/接种外植体块数×100；
外植体污染率(％)＝外植体污染数/接种外植体块数×100；
进一步地，所述步骤3还包括在浓度3mg/L的2,4-D的培养基上分别添加不同的营养成分，第一个为0.5g/L水解酪蛋白，第二个为100ml/L椰汁，第三个为0.5g/L水解酪蛋白和100ml/L椰汁，每个处理接20块外植体，3次重复。
在植物组织的生长过程中添加有机氮源及天然提取物对其生长有着良好的促进作用。MS培养基中唯一的有机氮源是甘氨酸。在植物组织培养中，使用水解酪蛋白(CaseinHydrolysate,CH)作为机氮源附加在M S培养基中，对愈伤组织的诱导有显著影响。前人研究认为0.10～1.00g/L的浓度比较适宜。在玉米幼穗愈伤组织培养中添加了CH，适量的CH具有提高胚性愈伤组织诱导率的作用。本试验中添加CH并未表现出对甘蔗愈伤组织的诱导作用，反而诱导率降低，其原因可能是CH的浓度不合适，抑或其不适宜甘蔗愈伤组织的诱导。其在甘蔗愈伤组织的诱导中的作用还需进一步探讨。
椰汁(Coconut water,CW)作为天然有机物被广泛应用于曼陀罗、文心兰、白及、甘蔗等植物组织培养中。在甘蔗愈伤组织分化阶段添加椰乳提高了愈伤组织的分化率；在幼苗生根阶段添加椰乳可以使苗增粗变壮，但并未对愈伤组织诱导阶段进行研究。对藏红花研究结果表明，添加100mL/L CW有助于愈伤组织的诱导，认为椰乳可能在愈伤组织诱导中增加天然组分营养，与合成成分相比具有保护愈伤组织的作用。本试验在确定了最佳2,4-D浓度的基础上，在原来的培养基中添加CW，结果表明，添加100ml/L CW时，胚性愈伤诱导率达84.22％，比未添加时诱导率提高了13.16％，说明添加CW能够很好的促进愈伤组织的生成。
本发明采用了上述技术方案，本发明具有以下技术效果：
本发明通过以MS为基本培养基，研究添加不同2,4-D浓度及营养成分对GT42胚性愈伤组织的影响。进而优化GT42胚性愈伤组织的诱导培养基，培养优质的胚性愈伤组织，为甘蔗的遗传转化提供优质材料，并为甘蔗的快速繁殖提供技术保障，以MS为基本培养基，添加3mg/L 2,4-D为最佳培养基，胚性愈伤诱导率达71.06％。在试验1的基础上，以添加100ml/L椰汁最佳，胚性愈伤诱导率达84.22％。本研究通过设计优化试验，筛选出了诱导胚性愈伤组织的最佳培养基，为甘蔗的快速繁殖及遗传转化提供了一定的研究基础。
附图说明
图1是本发明不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响结果图。
图2是本发明的不同激素浓度对继代后胚性愈伤组织的影响结果图。
图3是本发明的不同营养成分对愈伤组织诱导的影响结果图。
图4是本发明的不同营养成分对胚性愈伤组织诱导的影响结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
如图1所示，根据本发明的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，以广西自育品种桂糖42号(GT42)的心叶为外植体，以MS为基本培养基，研究不同激素(2,4-D)浓度及营养成分(水解酪蛋白、椰汁)对胚性愈伤组织诱导的影响，进而优化GT42胚性愈伤组织诱导的培养基，培养优质的胚性愈伤组织，为甘蔗的遗传转化提供材料。结果表明：(1)以MS为基本培养基，添加3mg/L 2,4-D为最佳培养基，胚性愈伤诱导率达71.06％。(2)在试验1的基础上，以添加100ml/L椰汁最佳，胚性愈伤诱导率达84.22％。本研究通过设计优化试验，筛选出了诱导胚性愈伤组织的最佳培养基，为甘蔗的快速繁殖及遗传转化提供了一定的研究基础。
本研究以广西自育品种GT42为试验材料，以MS为基本培养基，研究添加不同2,4-D浓度及营养成分对GT42胚性愈伤组织的影响。进而优化GT42胚性愈伤组织的诱导培养基，培养优质的胚性愈伤组织，为甘蔗的遗传转化提供优质材料，并为甘蔗的快速繁殖提供技术保障。
1.1试验材料
供试材料为广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所自育品种GT42，由广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所提供，种植于广西甘蔗壮族自治区农业科学院甘蔗研究所试验基地。
1.2试验方法
1.2.1甘蔗愈伤组织的诱导从田间选取生长健壮的甘蔗植株尾梢，剥掉叶片，留取30cm左右的尾梢带回实验室，用75％乙醇消毒表面，剥除4-5层外叶鞘后置于超净工作台内，取距顶端生长点约10cm左右的幼嫩心叶组织作为外植体，将其切成0.2mm左右厚的薄片接种于愈伤组织诱导培养基上，每个培养皿接种10块外植体，每个处理3个重复，每个重复接20个外植体，27℃暗培养15～20d。
1.2.2不同激素浓度对GT42愈伤组织诱导的影响以MS培养基为基本培养基，加30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH值5.8。2,4-D浓度分别为：0mg/L，1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L。每个处理接20块外植体，3次重复。
愈伤组织诱导率(％)＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体块数×100
外植体褐化率(％)＝外植体褐化数/接种外植体块数×100
外植体污染率(％)＝外植体污染数/接种外植体块数×100
1.2.3不同培养基对GT42愈伤组织诱导的影响以MS培养基为基本培养基，加30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH值5.8。处理1：添加0.5g/L水解酪蛋白(Casein Hydrolysate,CH)；处理2：添加100ml/L椰汁(CoconutWater,CW)；处理3：添加100ml/LCW和0.5g/LCH。每个处理接20块外植体，3次重复。
2结果
2.1不同激素浓度对GT42愈伤组织诱导的影响
实验结果表明，在MS基本培养基中添加不同浓度的2,4-D，第二十天观察，每个处理都有部分外植体膨大，能诱导出水渍状愈伤组织，但效果差异很大。当2,4-D浓度为0mg/L时，愈伤组织诱导率为6.66％，褐化率高达93.33％。当2,4-D浓度为1mg/L和2mg/L时，愈伤组织诱导率达到78.33％，但是褐化率有所区别，1mg/L时褐化率为18.33％明显高于2mg/L时的3.33％。当2,4-D浓度为3mg/L、4mg/L时，愈伤组织诱导率达到90％以上(表1)。第一次诱导出的愈伤组织属于水渍状的愈伤(图1)，不符合转化用愈伤组织的要求，因而转接至新的培养基中继代培养，以期培养出符合转化用的具有细胞全能性的胚性愈伤组织。继代后第二十天观察(图2)，当2,4-D浓度0mg/L时，胚性愈伤诱导率为0，褐化率和污染率高。当2,4-D浓度为1mg/L和2mg/L时，胚性愈伤诱导率分别为60.93％和61.20％，褐化率和污染率都较低，且这两个浓度对愈伤的影响差别不大。当2,4-D浓度为3mg/L时，胚性愈伤组织诱导率达到71.06％，褐化率低，无污染。当2,4-D浓度为4mg/L时，胚性愈伤组织诱导率为66.35％，褐化率，污染率低。从表2结果可以看出，当2,4-D浓度为3mg/L时，最适合诱导胚性愈伤组织。
表1不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响
表2不同激素浓度对继代后胚性愈伤组织的影响
2.2不同营养成分对愈伤组织诱导的影响
以MS为基本培养基，按表2的结果添加3mg/L的2,4-D浓度，在此基础上，分别添加不同的营养成分：处理1：添加0.5g/LCH；处理2：添加100ml/LCW；处理3：添加0.5g/LCH+100ml/LCW。第二十天观察(图3)，结果如表3显示：处理1和处理3愈伤诱导率低于60％，污染率和褐化率相对较高。处理2的愈伤诱导率达到88.89％，显著高于另外两个处理，污染率及褐化率相对较低。挑选诱导出的愈伤组织进行继代培养，经过二十天培养观察(图4)，结果如表4所示：处理2诱导出胚性愈伤组织的效率最高达84.22％，愈伤组织状态干燥、致密、淡黄色的，是转化所需的最好胚性愈伤组织。
表3不同营养成分对愈伤组织诱导的影响
表4不同营养成分对胚性愈伤组织诱导的影响
在植物组织培养中，激素是影响植物组织培养的关键因素之一。由于培养物内源激素状况及外源激素的供应对内源激素水平的影响等原因，在具体试验中，激素的种类、浓度和组合十分复杂。在甘蔗愈伤组织培养中，2,4-D是诱导愈伤组织产生的最重要激素因子。在没有2,4-D的培养基上不能形成愈伤组织。在0～3mg/L的范围内，愈伤组织诱导率随着2,4-D浓度的增加而提高，但浓度过高(4.0mg/L)诱导率反而下降。本试验设制了5个2,4-D浓度梯度，结果表明，在甘蔗愈伤组织诱导过程中，2,4-D起着重要作用。当2,4-D浓度为0mg/L时未能诱导出胚性愈伤组织；而2,4-D的浓度在0～3mg/L范围内，随着2,4-D浓度的升高，胚性愈伤组织的诱导率不断提高；但当浓度为4.0mg/L胚性愈伤组织诱导率反而下降，说明一定浓度的2,4-D能够促进胚性愈伤组织的诱导，而过高的浓度会产生抑制作用。此结果与前人的研究结果一致。但不同基因型的诱导浓度有所差别，以粤糖95-168为材料，2,4-D浓度为2.5mg/L时诱导率最佳。而桂糖48，2,4-D浓度为3.0mg/L时，愈伤组织诱导率最高达94.14％。粤糖03-373，诱导愈伤组织的2，4-D适宜浓度为1.0mg/L。本研究中2,4-D浓度为3mg/L时，最有利于甘蔗胚性愈伤组织的诱导，诱导率为71.06％。表明不同甘蔗基因型所适宜的激素诱导浓度是有差别的，因而对不同基因型进行胚性愈伤组织诱导时，筛选合适的2,4-D浓度是很有必要的。
本研究GT42叶梢作为外植体，研究不同激素浓度及营养成分对胚性愈伤组织诱导的影响，优化GT42胚性愈伤组织诱导的培养基。以MS为基本培养基，添加3mg/L 2,4-D，胚性愈伤诱导率达71.06％，为最佳培养基。在试验1的基础上，添加100ml/LCW，胚性愈伤诱导率达84.22％，因而GT42胚性愈伤组织的最佳诱导培养基为：MS+3mg/L2,4-D+100ml/L CW。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
步骤1：从田间选取生长健壮的甘蔗植株尾梢，剥掉叶片，留取28-32cm的尾梢带回实验室；
步骤2：用75％乙醇消毒尾梢表面，剥除4-5层外叶鞘后置于超净工作台内，取距顶端生长点9-11cm的幼嫩心叶组织作为外植体，将其切成0.18-0.22mm厚的薄片接种于愈伤组织诱导培养基上；
步骤3：培养皿的数量为6个，每个培养皿接种10块外植体，27℃暗培养15～20d；
步骤4：二十天后观察诱导出的愈伤组织，将愈伤组织转接至新的培养基中继代培养；
步骤5：继代后第二十天观察，统计继代培养后的愈伤组织诱导率、褐化率和污染率，选出适合诱导胚性愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤1中，甘蔗植株选用型号为GT42的甘蔗。
3.根据权利要求2所述的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤2中，培养基以MS培养基为基本培养基，加30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH值5.8，培养皿中2,4-D浓度分别为：0mg/L，1mg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L，每个处理接20块外植体，3次重复。
4.根据权利要求1所述的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤3中，接种外植体时，每个处理3个重复，每个重复接20个外植体。
5.根据权利要求1所述的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤5中，统计愈伤组织诱导率、褐化率和污染率的具体算式为：
愈伤组织诱导率(％)＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体块数×100；
外植体褐化率(％)＝外植体褐化数/接种外植体块数×100；
外植体污染率(％)＝外植体污染数/接种外植体块数×100。
6.根据权利要求1所述的一种甘蔗品种胚性愈伤组织诱导方法，其特征在于：所述步骤3还包括在浓度3mg/L的2,4-D的培养基上分别添加不同的营养成分，第一个为0.5g/L水解酪蛋白，第二个为100ml/L椰汁，第三个为0.5g/L水解酪蛋白和100ml/L椰汁，每个处理接20块外植体，3次重复。
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