KR100516984B1

KR100516984B1 - 조직배양기술을 이용한 둥근마의 씨마 생산방법

Info

Publication number: KR100516984B1
Application number: KR10-2003-0041068A
Authority: KR
Inventors: 남상일; 최종인; 권기석; 엄정식; 박주현
Original assignee: 동양물산기업 주식회사
Priority date: 2003-06-24
Filing date: 2003-06-24
Publication date: 2005-09-27
Also published as: KR20050000279A

Abstract

본 발명은 둥근마의 씨마 생산방법에 관한 것으로서, 씨마의 생산에 있어서 조직배양기술을 이용하여 조직배양 식물체를 삽목해서 순화, 활착을 동시에 이루어 무균식물체를 대량생산하고 다시 상기 무균식물체를 재배하여 씨마를 생산하는 무병종우의 대량생산방법에 관한 것이다.

Description

조직배양기술을 이용한 둥근마의 씨마 생산방법{Method for production of seed Dioscorea opposita Thunb. by use of tissue culture technology}

본 발명은 생산 수량 감소와 품질의 저하를 초래하는 바이러스 감염문제를 근본적으로 해결하기 위한 둥근마의 씨마 생산방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 씨마의 생산에 있어서 조직배양기술을 이용하여 조직배양 식물체를 삽목해서 순화, 활착을 동시에 이루어 무균식물체를 대량생산하고 다시 상기 무균식물체를 재배하여 씨마를 생산하는 무병종우의 대량생산방법에 관한 것이다.

마는 "산약"이라고도 하고 마(Dioscoreaceae)과에 속하며, 괴경에 의한 영양번식을 주로 하는 작물로서 영양번식 과정에서 바이러스 감염으로 인한 퇴화현상이 나타나며 이로 인해 수확량이 감소하는 작물이다.

마는 전세계적으로 약 600여종이 분포되어 있으며 이중 식용으로 이용하고 있는 종은 약 10종 정도이다. 재배지역은 아시아권, 중앙 아프리카권 및 중미권으로 나눌 수 있으며, 이중 세계 총 생산량의 96%가 아프리카에서 생산된다. 마는 덩이뿌리 작물 중에서 감자, 카사바, 고구마 다음으로 많이 재배되고 일일 생산량은 감자 다음으로 높은 작물이다.

마는 덩이뿌리의 형태로 보아 형태로 보아 장마, 단마, 둥근마 등으로 나눌 수 있는 데, 우리나라에서 생산된 마는 주로 약용으로 이용하고 일부 건강식품으로 쓰이지만 일부 도입마는 조사포닌 함량이 높거나 괴근 내부가 자주색을 띄어 건강식품 첨가제 또는 빵이나 과자 등 식용색소로의 이용 등 다양한 용도의 수요개발 검토가 필요하다.

대부분의 영양번식 작물에서와 같이 "마"에서도 바이러스에 의한 피해가 심각한데, 이로 인해 마의 수확량 감소와 품질저하가 초래되고 있는 실정이다. 이러한 바이러스병은 농약에 의하여 해결될 수 없기 때문에 현재까지는 획기적인 대처방안이 제시되지 못하고 있는 것이 사실이다.

식물 조직배양 기술을 이용하여 씨마를 생산하는 방법으로서, 현재까지 개발된 방법으로는 다음과 같이 4가지로 분류된다고 볼 수 있다:

1) 장마(Dioscorea opposita Thunb. cv. Nagaimo) 이용:

(Hajime Araki et al. 1992. Japan. Soc. Hort. Sci. 60(4):851-857)

- 신초(shoot) 유도 : 변형 MS 배지 (질소원 수준 1/10 감소, NAA 0∼0.1mg/l, BA 0.1mg/l)

- 칼루스(callus) 유도 : NAA 1.0 mg/l 칼루스는 신초 원기(shoot primordium)와 유사한 형태

- 신초 재분화(shoot regeneration) : MS 배지, BA 0∼0.1 mg/l, NAA 0.01∼0.1 mg/l

2) Dioscorea composita Hemsl:

(S. Alizadeh et al. 1998. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 53: 107-112)

기내 무균식물체를 sucrose 농도를 각각 2, 8, 10% 처리하고 키네틴(kinetin)을 2.5uM 처리하여 기내소구 생산

3) Dioscorea속 4종의 마 기내식물체 순화:

(H.N. Asemota et al. 1997. Top. Agri. (Trinidad) 74(3): 243-247)

기내식물체를 75% 차광된 28±1℃ 조건에서 발근배지에 4주간 배양 후 1:1 비율로 혼합된 토양(soil)과 모래(sand) 상토에서 생육하였을 때 99% 생존

4) 둥근마(Dioscorea opposita Thunb.):

(T. Okamoto et al. 2001. J. of Japan. Crop Science 70(2): 179-185)

배양재료 : 온실 내에서 재배한 둥근마 선단부분을 채취하여 경정배양

초대배양 : 1/2 LS 배지에 NAA 0.01mg/l와 BAP 0.1mg/l를 첨가하여 배양

차대배양 : 배양개시 60일 후 경엽이 재분화하여 4∼5마디가 생장하였을 때 액아를 포함한 기내식물체의 마디를 배양한다. 2주간 배양묘를 순화한 후 배양토 30리터를 채운 상자에 정식하여 재배하였다.

일반적으로, 전기 마 무병종우의 생산은 마 식물체의 생장점 배양으로부터 시작하여 줄기를 형성시키고, 이 줄기를 배양용기 내에서 계대배양하면서 배양된 줄기를 삽목법 등으로 종우를 생산하거나, 배양된 줄기를 배양조건을 달리하여 기내소구(microtuber)를 생산하는 방법 등으로 대별할 수 있다. 그러나, 상기 방법들은 삼각플라스크 또는 시험관 등 실험실 내에서 소규모로 수행된 연구로서 이러한 방법에 의한 대량생산은 어렵고, 특히 둥근마를 이용한 조직배양 기술의 개발은 시도된 바는 있으나 아직 성과를 거둔 바 없다.

지금까지 개발된 조직배양 기술을 둥근마에 적용하는 경우, 바이러스 감염에 의한 수확량 감소를 방지하기 위하여 식물체 중 바이러스 감염밀도가 거의 없는 생장점 부위를 채취한 후 조직배양 증식단계를 거치며, 배양단계를 거친 줄기를 상토에서 일반적으로 영양번식체 또는 지상부에 달리는 영여자로 번식하도록 할 수 있으나, 둥근마의 경우에는 영여자가 거의 생성되지 않아 영양번식에 의한 방법으로만 번식한다. 둥근마의 경우 영양번식 과정에서 바이러스 감염으로 인한 퇴화현상이 나타나며 이로 인해 수확량이 감소하게 되는 것이다.

따라서, 본 발명의 제 1의 목적은 둥근마를 재료로 조직배양기술을 이용하여 대량으로 무병종우를 생산할 수 있는 높은 증식률을 나타내는 조직배양체계를 제공하는 것이다.

본 발명의 제 2의 목적은 본 발명의 상기 조직배양체계로부터 유래한 무균식물체를 삽목하여 무병종우를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 3의 목적은 기내에서 직접 기내소구(microtuber)를 생산할 수 있는 방법을 찾는 데 특징이 있다.

본 발명의 궁극적인 목적은 생산 수량 감소와 품질의 저하를 초래하는 바이러스 감염문제를 근본적으로 해결하여 영양번식 과정에서 바이러스 감염으로 인해 나타나는 조직의 퇴화현상을 억제 및/또는 방지함으로써 포장내 증식률이 낮은 둥근마의 번식체로서 무병종우를 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 이러한 수확량 감소를 방지하기 위하여 둥근마 식물체 중 바이러스 감염밀도가 거의 없는 생장점 부위를 채취한 후 조직배양 증식단계를 거쳐 무병 씨마를 생산함으로써 둥근마의 번식체로서 무병종우를 대량생산할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따른 둥근마 무병씨마 생산방법은 우선 생장점 배양 및 바이러스 검정을 거쳐 대량 증식된 우량 경삽묘를 얻는 단계, 본 발명의 삽목법에 의해 우량 경삽묘를 정식하여 순화하는 단계 또는 페트리디쉬 내에서 소구를 생산하는 단계, 정식된 경삽묘에 양액을 공급하여 지상부를 생육시키는 단계 및 씨마(종우, 種芋)를 생산하는 단계를 포함한다. 본 발명은 포장내 증식률이 낮은 둥근마의 번식체로서 무병종우를 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 둥근마 무병씨마 생산방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다:

제 1단계 : 기본줄기의 수득

둥근마의 액아생장점을 채취하고, 배양하여 기본줄기를 수득한다. 이때 액아생장점은 둥근마 절편을 식재하여 줄기가 9∼10개 신장하였을 때 상위로부터 6∼7번째의 마디까지에 생성된 액아부위로부터 채취하고, 배양은 식물의 조직배양에 일반적으로 사용되는 MS 배지의 조성 중 질소원의 농도를 1/2로 줄인 배지 내에 플루프리미돌(flurprimidol)이 첨가된 배지를 사용하여 수행되며 유도된 줄기가 신장한 후 약 6주가 경과한 것으로부터 기본줄기를 수득한다. 또한 배양은 25℃±1℃의 온도, 3,000룩스 이상의 조도 및 명기와 암기의 비율이 16:8(시간)인 조명주기의 조건에서 수행된다.

제 2단계 : 기본줄기의 증식

전기 수득된 기본줄기를 1 내지 2마디씩 절단하고, 이를 줄기 신장배지에서 5주간 배양하여 줄기를 신장시킨다. 이들 신장된 둥근마 기내식물체는 이후 매 6주 간격으로 계대배양하였다. 배양조건은 상기 제 1단계의 배양조건과 동일하다.

제 3단계 : 조직배양 식물체의 경삽에 의한 종우(種芋)의 생산

페트리디쉬 내에서 대량증식된 식물체 줄기를 마디가 1개 이상 포함되도록 절단, 경삽묘를 확보하여 이를 상토에 식재하고 3개월 내지 5개월 간 재배하여 무병종우를 수확한다.

제 3-1 단계 : 기내소구의 생산:

대량 증식된 무병식물체를 기내소구 유도배지, 기내소구 생산배지에서 배양하여 둥근마 기내소구를 생산한다. 이때, 기내소구 유도배지에서는 4 내지 6주 동안, 기내소구 생산배지에서는 8 내지 10주 동안 배양함이 바람직하다. 둥근마 기내소구 유도배지는 BA(6벤질 아미노퓨린; 6-benzyl aminopurine)와 IAA(인돌 아세트산 ; indole acetic acid) 및 파클로부트라졸(paclobutrazol)등을 포함하며, 기내소구 생산배지에는 식물생장조절물질을 함유하지 않는다.

배양은 20 내지 28℃의 온도, 명기와 암기의 비율이 12:12(시간)인 조명주기의 조건에서 수행된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.

실시예 1: 기본식물체의 유도 및 증식

둥근마 절편을 포트에 식재한 후 출현한 식물체의 신장된 줄기로부터 액아생장점을 채취하고, 배양배지(825mg/L 질산암모늄, 950mg/L 질산칼륨, 370mg/L 황산마그네슘, 170mg/L 디히드로인산칼륨염, 0.83mg/L 요오드화칼륨, 6.2mg/L 붕산, 15.1mg/L 황산망간, 8.6mg/L 황산아연, 0.25mg/L 몰리브덴산나트륨 2수화물, 0.025mg/L 황산구리 5수화물(cupric sulfate pentahydrate), 0.025mg/L 염화코발트 6수화물(cobalt chloride hexahydrate), 3.671mg/L EDTA, 100mg/L 미요이노시톨(myo-inositol), 0.5mg/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.5mg/L 피리독신(pyridoxin)-HCl, 0.5mg/L 티아민(thiamin)-HCl, 2mg/l 글리신(glycine), 0.5∼2.0mg/L 플루피리미돌(flurprimidol), pH 5.7∼5.8)에서 배양하여 기본식물체를 유도한 후 효소면역검정법으로 바이러스에 감염되지 않는 개체를 선별하였다.

선별된 개체를 전기 배양배지에 포함되는 플루피리미돌(flurprimidol) 대신 1.0 내지 2.0mg/L BA를 첨가한 배지에서 5주간 배양하여 신장시킨 후, 증식배지(825mg/L 질산암모늄(ammonium nitrate), 950mg/L 질산칼륨(potassium nitrate), 185mg/L 황산마그네슘(magnesium sulfate), 85mg/L 디히드로인산칼륨염(potassium dihydro phosphate), 0.415mg/L 요오드화칼륨(potassium iodide), 3.1mg/L 붕산(boric acid), 7.52mg/L 황산망간(manganese sulfate), 4.3mg/L 황산아연(zinc sulfate), 0.125mg/L 몰리브덴나트륨 2수화물(sodium molybdate dihydrate), 0.0125mg/L 황산구리 5수화물(cupric sulfate pentahydrate), 0.0125mg/L 염화코발트 6수화물(cobalt chloride hexahydrate), 1.835mg/L 에틸렌디아민사아세트산(EDTA), 100mg/L 미요이노시톨(myo-inositol), 니쉬 바이타민(Nitsch vitamin), pH 5.7∼5.8)에서 매 6주 간격으로 계대배양하였는데 이 때 증식률은 6배 내지 7배였다.

실시예 2: 경삽에 의한 무병종우의 생산

본 발명의 둥근마 무병종우의 생산은 기내에서 증식된 식물체를 1 내지 2개의 마디가 포함되도록 경삽묘를 준비하고 이를 상토에 식재하는 방법으로 수행될 수 있다.

실시예 2-1: 조직배양 식물체의 경삽묘 발근촉진제 처리에 따른 활착율

준비한 경삽묘 말단부위에 시판 발근촉진제(상품명; 옥시베린)를 침지하여 삽목한 결과 활착률에 있어서 대조구에 비해 약 13% 이상 활착이 증진되었다.

[표 1]

조직배양 식물체 삽수처리에 의한 활착율 증진

반복	활착률 (정상생육 개체수/총 개체수)
반복	IBA 처리	무처리
1	88.4 % (107/121)	70.5 % (62/88)
2	87.0 % (100/115)	89.7 % (113/126)
3	86.7 % (130/150)	62.1 % (100/161)
평균	87.4 ±0.9 (337/386)	74.1 ±14.1 (275/375)

실시예 2-2: 호르몬 및 처리법에 따른 경삽묘의 생육 비교

경삽묘에 대한 호르몬을 종류별, 처리방법 별로 비교한 결과 IBA(상품명: 옥시베린)에 침지하여 경삽하는 것이 초장이 14.9cm, 분지수가 2.9개로 가장 나은 결과를 보였다.

[표 2]

조직배양 식물체 삽목시 호르몬 종류 및 처리법에 따른 생육 비교

처 리	초장 (cm)	분지수 (개)
T 1	6.48 ±1.91	1.1 ±0.3
T 2	3.43 ±1.55	0.8 ±0.8
T 3	9.02 ±2.42	1.9 ±0.6
T 4	11.12 ±4.48	2.5 ±0.7
T 5	14.88 ±8.08	2.9 ±1.3

T1 : 무처리,

T2 : 1/8MS배지+IBA5㎎/ℓ+Kinetin2㎎/ℓ+IAA1㎎/ℓ+NAA1㎎/ℓ를 상토 관주후 삽목

T3 : IBA(상표명 옥시베린) 2㎎/ℓ희석후 상토에 관주 후 삽목

T4 : IAA 10㎎/ℓ에 2시간 침지

T5 : IBA(상표명 옥시베린) 5㎎/ℓ에 2시간 침지

실시예 3: 기내소구의 생산

상기한 실시예 1에서 증식된 기내식물체를 기내소구 유도배지(1650mg/L 질산암모늄(ammonium nitrate), 1900mg/L 질산칼륨(potassium nitrate), 370mg/L ㅎ호황산마그네슘(magnesium sulfate), 170mg/L 디히드로인산칼슘염(potassium dihydro phosphate), 0.83mg/L 요오드화칼륨(potassium iodide), 6.2mg/L 붕산(boric acid), 15.1mg/L 황산망간(manganese sulfate), 8.6mg/L 황산아연(zinc sulfate), 0.25mg/L 몰리브덴산나트륨 2수화물(sodium molybdate dihydrate), 0.025mg/L 황산구리 5수화물(cupric sulfate pentahydrate), 0.025mg/L 염화코발트 6수화물(cobalt chloride hexahydrate), 3.671mg/L 에틸렌디아민사아세트산(EDTA), 100mg/L 미요이노시톨(myo-inositol), 0.5mg/L 니코틴산(nicotinic acid), 0.5mg/L 피리독신(pyridoxin)-HCl, 0.5mg/L 티아민(thiamin)-HCl, 2mg/l 글리신(glycine), 0.5∼1.0mg/L 벤질아미노퓨린(benzyl aminopurine), 0.5∼1.0mg/L 인돌아세트산(indole acetic acid), 0.1∼0.5mg/L 파클로부트라졸(paclobutrazol), pH 5.7∼5.8)에서 5주간 배양한 후 기내소구 생산배지((1650mg/L 질산암모늄(ammonium nitrate), 1900mg/L 질산칼륨(potassium nitrate), 370mg/L 황산마그네슘(magnesium sulfate), 170mg/L 디히드로인산칼륨염(potassium dihydro phosphate), 0.83mg/L 요오드화칼륨(potassium iodide), 6.2mg/L 붕산(boric acid), 15.1mg/L 황산마그네슘(manganese sulfate), 8.6mg/L 황산아연(zinc sulfate), 0.25mg/L 몰리브덴산나트륨 2수화물(sodium molybdate dihydrate), 0.025mg/L 황산구리 5수화물(cupric sulfate pentahydrate), 0.025mg/L 염화코발트 6수화물(cobalt chloride hexahydrate), 3.671mg/L 에틸렌디아민사아세트산(EDTA), 100mg/L 미요이노시톨(myo-inositol), 니쉬 바이타민(Nitsch vitamin), pH 5.7∼5.8)에서 8주 이상 배양하여 기내소구를 생산한다. 이때 생산된 기내소구는 기내실물체 줄기 당 3 내지 5개가 형성되어 하나의 페트리디쉬 당 15 내지 25개의 기내소구가 생산되었다.

삭제

본 발명에 따라 포장 내 증식률이 낮은 둥근마의 번식체로서 무병종우를 생산하는 방법이 제공됨으로써, 둥근마의 생산효율을 획기적으로 증대시킴과 동시에 둥근마의 증가하는 수요에 부응할 수 있는 대량생산의 가능성을 실현할 수 있게 될 전망이다.

도 1a 및 도1b는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 조직배양을 이용한 둥근마의 씨마 생산과정을 모식적으로 도시한 공정도,

도 2a 및 도 2b는 각각 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 경삽법에 의해 생산된 둥근마의 씨마의 수확시점과 수확후의 모습을 나타낸 사진,

도 3a 및 도 3b는 각각 본 발명의 바람직한 일실시예에 따라 생성중인 둥근마의 기내소구 및 수확 후 기내소구의 모습을 나타낸 사진.

Claims

둥근마 무병씨마 생산방법에 있어서,

생장점 배양 및 바이러스 검정을 거쳐 대량 증식된 우량 경삽묘를 얻는 단계,

삽목법에 의해 우량 경삽묘를 정식하여 순화하는 단계;

정식된 경삽묘에 양액을 공급하여 지상부를 생육시키는 단계; 및

종우를 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 둥근마 무병씨마 생산방법.
제 1항에 있어서, 상기 삽목법이 기내에서 증식된 식물체를 1 내지 2개의 마디가 포함되도록 경삽묘를 준비하는 단계; 및

상기 준비된 경삽묘 말단부위에 발근촉진제를 침지하여 삽목하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 둥근마 무병씨마 생산방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발근촉진제가 옥시베린이며, 옥시베린 5㎎/ℓ희석액에 2시간 침지하고 상토에 관주 후 삽목하는 것을 특징으로 하는 둥근마 무병씨마 생산방법.
둥근마 무병씨마 생산방법에 있어서, 둥근마 절편을 포트에 식재한 후 출현한 식물체의 신장된 줄기로부터 액아생장점을 채취하여 배양배지에서 계대배양하고, 생장점 배양 및 바이러스 검정을 거쳐 대량 증식된 우량 경삽묘를 얻는 단계;

기내에서 증식된 식물체를 사용하여 페트리디쉬 내에서 소구를 생산하는 단계;

상기 소구를 생육시키는 단계; 및

종우를 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 둥근마 무병씨마 생산방법.